Thermostabilization, expressie, zuivering en kristallisatie van het Human serotonine transporter Gebonden aan<em> S</em> citalopram

1. Transfectie van hechtende HEK293S GNTI – Cellen voor Thermostabiliteit Screen Bereid Poly-D-Lysine (PDL) gecoate 96-well platen. Voer alle werkzaamheden in een steriele laminaire stroming kap. Filtreer een 25 gg / mL oplossing van (PDL), molecuulgewicht 70,000-150,000 Da, met een 0,2 urn steriel filter. Voeg 50 ul van PDL aan elk putje van een 96-well weefselkweek (TC) plaat, zodat de bodem gelijkmatig bedekt, en incuberen bij kamertemperatuur gedurende 30 min. Zuig PDL-oplossing en wassen met 200 pi steriel water. Laat de plaat drogen gedurende 2 uur voor opslag bij 4 ° C. PDL bedekte platen kan meerdere weken bewaard bij 4 ° C. Trypsine hechtende HEK293S cellen. HEK293S groeien tot 80% confluentie in een 10 cm schaal gehouden op 37 ° C met 8% CO2. Eén 10 cm schaal moet ongeveer 10 miljoen HEK293S cellen. Niet cellen gebruiken na 30 passages! </li> Aspiraat media en was met 5 ml fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS). Voeg 1 ml trypsine-EDTA-oplossing (0,25% trypsine, 0,02% EDTA) cellen en incubeer gedurende 2 minuten bij 37 ° C. Voeg 10 ml Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS) en resuspendeer cellen door herhaaldelijk op en neer pipetteren met behulp van een serologische pipet. Pipetteer 10 ul cellen en mengen met 10 pi van trypan blauwe oplossing (0,4%). Bepaal celdichtheid met behulp van een hemocytometer en een lichtmicroscoop. Heeft cellen die blauw gekleurd zijn als zij dood zijn niet te tellen. Zorg ervoor dat de levensvatbaarheid van de cellen hoger is dan 90%. Grondig resuspendeer getrypsiniseerd HEK293S GNTI – cellen in DMEM gesupplementeerd met 10% FBS tot een dichtheid van 0,5 x 10 6 cellen / ml in een wegwerp pipet reservoir. Ongeveer 5.000.000 HEK293S cellen nodig zijn voor elke plaat. Een totaal van 24 constructen kunnen worden getransfecteerd op elke plaat met deze protocol. Met behulp van een multichannel pipet 100 ul cellen aan elk putje van een PDL beklede plaat. Resuspendeer cellen in de pipet reservoir na het vullen elke plaat om een ​​gelijkmatige verdeling van cellen. Incubeer cellen in een 37 ° C incubator met 8% CO2. Na 24 uur moeten de cellen ongeveer 80% confluentie bereiken. 1 uur voor transfectie vervangen media. Bereid DNA-transfectiereagens complexen voor transfectie. Voor elk construct in de SERT TC achtergrond te screenen, mengen 450 ng DNA met 45 pl serumvrij DMEM en meng. Voeg 1,6 ul van het transfectiereagens tot 45 ul serumvrij DMEM en meng. Voeg onmiddellijk verdunde transfectiereagens oplossing voor DNA-oplossing en meng. Gebruik geen oplossingen mengen in de omgekeerde volgorde. Wacht 10 – 15 min en voeg 20 ul van transfectiereagens / DNA mengsel 4 putjes. Zodra alle putten zijn getransfecteerd, meng plaat door voorzichtig schommelen terugnd heen en terug naar de 37 ° C incubator. Na 16-24 uur vervangen medium met DMEM met serum en 10 mM natriumbutyraat. Ongeveer 48 uur na transfectie verwijderd media en ofwel onmiddellijk voort thermostabiliteit scherm of bevriezen cellen bij -80 ° C tot later gebruik. Cellen kunnen meerdere weken bewaard bij -80 ° C. 2. Scintillation Proximity-gebaseerde Thermostabiliteit scherm met S-citalopram Incubeer cellen met 200 nM S-citalopram in 25 pl TBS (Tris-gebufferde zoutoplossing – 20 mM Tris, pH 8, 100 mM NaCl) gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Oplosbaar cellen door toevoeging van 25 pl 8 mM n-dodecyl-β-D-maltopyranoside (C12M), 1 mM cholesteryl hemmisuccinate (CHS), cocktail van proteaseremmers (2 mM fenylmethaansulfonylfluoride (PMSF), 0,1 mg / ml aprotinine, 4 g / ml pepstatine A, en 4 ug / ml leupeptine) in TBS en incuberen gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Voeg 50 ul TBS with 20 nM [3H] citalopram (81,7 Ci / mmol), 0,1% runderserumalbumine en 2 mg / ml His-tag affiniteit scintillatie proximity assay (SPA) bolletjes drie putjes per construct. Voor de laatste goed toe te voegen dezelfde oplossing genoemd, maar te vullen met 100 uM sertraline niet-specifieke binding te bepalen. Zorg ervoor dat de His-tag affiniteit SPA kralen zijn goed gemengd bij het toevoegen van de 96-well plaat. Meet [3 H] citalopram binding met behulp van een 96-well scintillatieteller bij RT met een 1 min aantal keer per well. Ga door het tellen van platen tot totale tellingen plateau (ongeveer na 36 uur). Warmte platen gedurende 15 minuten in een verwarmingsblok met een verwarmd deksel bij 33 ° C. Meet [3H] citalopram binding weer na verhitting zoals beschreven in 2.4. Herhaal stap 2,4-2,5 en wijzig de verwarmingsstap tot 36 ° C, 39 ° C, 45 ° C, 48 ° C en 51 ° C. Aanpassen verwarmingstemperatuur afhankelijk van de schijnbare smelttemperatuur (Tm)van het doeleiwit en de thermostabiliteit van de meest stabiele constructie. Doorgaan om platen te verwarmen totdat alle constructen laag soortelijk telt. Analyseer gegevens naar Tm waarden te bepalen. Bepaal de gemiddelde totale tellingen per minuut (CPM) van elk construct voor putten die niet sertraline bevatten door het gemiddelde van de 3 herhalingsputjes. Bepaal de niet-specifieke CPM door het gemiddelde CPM van elk putje sertraline in een enkele plaat. Bereken specifieke CPM door het aftrekken van de niet-specifieke CPM van de totale CPM. Bereken de Tm door een niet-lineaire fit een Boltzmann sigmoïdale functie. Constructen met geringe specifieke CPM bij kamertemperatuur (<10% van WT) algemeen geen nauwkeurige Tm waarden. Mutaties van de thermostabiele constructen kunnen worden gecombineerd en gescreend op additieve toename in de thermostabiliteit. 3. Expressie van het Human serotonine transporter in HEK293S GNTI <sup> – Cellen Transformeer chemisch competente DH10Bac cellen met 1 ng van het plasmide. plasmide toevoegen aan 50 ul van DH10Bac cellen en incubeer op ijs gedurende 30 min. Heat shock DH10Bac cellen bij 42 ° C gedurende 30 sec. Voeg 200 pl SOC medium en geïncubeerd bij 37 ° C gedurende 4 uur onder schudden. Plaat alle bacteriën op een Luria Broth (LB) platen bevattende 50 ug / ml kanamycine, 7 ug / ml gentamicine, 10 ug / ml tetracycline, 100 ug / ml 5-broom-3-indolyl β-D-galactopyranoside, en 40 ug / ml isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG). Isoleren lacZ – kolonies (witte kolonies) gekweekt bij 37 ° C gedurende 2 dagen op LB agarplaten. Groeien verschillende kolonies O / N bij 37 ° C in 5 ml LB met antibiotica en isoleren bacmide DNA. Spin down kiemen bij 1000 xg in een centrifuge gedurende 5 minuten. Teruggooi supernatant. Resuspendeer bacteriën met 200 pl miniprep resuspension buffer. Lyse bacteriën door toevoeging van 200 pl miniprep lysisbuffer en het buisje voorzichtig 10 keer. Voeg 200 pl neutralisatiebuffer. Onoplosbare fractie te verwijderen door het draaien bij 14.000 xg gedurende 10 minuten in een centrifuge. Voeg 1 ml isopropanol supernatant en kou bij -20 ° C gedurende 20 min om DNA te precipiteren. Spin bij 14.000 xg gedurende 15 minuten in een centrifuge en gooi supernatant. Wassen DNA pellet met 70% EtOH en weer draaien bij 14.000 xg gedurende 15 min. Teruggooi supernatant. Droging DNA totdat alle EtOH is verdampt en resuspendeer in 50 ul van water. OPMERKING: Bacmid DNA worden getransfecteerd in Sf9-cellen onmiddellijk voor de beste resultaten, maar kan ook meerdere weken bewaard bij -20 ° C. Transfecteren bacmide DNA in 1×10 6 cellen van hechtende Sf9 gekweekt in een bevochtigde kamer bij 27 ° C in een 6-putjes. Voer alle celcultuur manipulaties in een steriele laminaire stroming kap. <li> media Verwijderen uit cellen en voeg 2 ml vers Sf9 media. Voeg 5 ug bacmide DNA 100 ul van Sf9 media (oplossing A). Voeg 8 pi van een kationogeen lipide Sf9 transfectiereagens tot 100 ul van Sf9 media (oplossing B). Incubeer buis met Oplossing B voor 5 min. Meng buis met oplossing A met Oplossing B en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 30 min en voeg alle oplossing voor de Sf9-cellen. Na 96 h, oogst supernatant (P1 virus) door passage door een 0,2 urn filter. P1 virus kan enkele maanden opgeslagen bij 4 ° C in het donker en hergebruikt om P2 virus zo nodig. Voeg 100 gl P1 virus 1 liter Sf9-cellen bij een dichtheid van 1 x 10 6 cellen / ml in Sf9 media. Cellen infecteren gedurende 96 uur groeien bij 27 ° C op een schudinrichting bij 100 rpm. Spin down cellen in een centrifuge bij 4000 xg gedurende 15 minuten en filter supernatant bevattende virusdeeltjes door een 0,2 urn filter. Gooi cel pellet. determine virale dichtheid met behulp van een virale plaque-test of een virus tegen te gaan. Het virus dichtheid moet> 1 x 10 8 virusdeeltjes per milliliter. P2 virus kan worden opgeslagen bij 4 ° C in het donker en gebruikt voor verscheidene maanden. Infect 10 l HEK293S GNTI – cellen 7 groeien in suspensie bij 37 ° C met 8% CO2 en 85% vochtigheid op een schudinrichting bij 130 tpm in 293 expressie medium aangevuld met 2% FBS bij een multipliciteit van infectie (MOI) van 2 en een dichtheid van 3 x 10 6 cellen / ml, gewoonlijk 30 – 50 ml P2 virus per 800 ml van cellen in een 2 L kolf war. LET OP: Het is niet aan te raden om meer dan 80 ml P2 virus gebruiken omdat de HEK293S GNTI – cellen zullen langzaam groeien en kunnen levensvatbaar worden als gevolg van een wijziging in de pH. Sf9 media is zuurder dan de 293 uitdrukking media. 12-16 uur na infectie, voeg natriumbutyraat tot een concentratie van 10 mM van een 1 M voorraadoplossing. 48-60 uur na infectie, oogst cellen door centrifugeren bij4000 xg gedurende 15 min. Verwijder het supernatant. Resuspendeer cellen in 150 ml TBS, 2 pM S-citalopram of andere remmers SERT en bewaar bij -80 ° C tot gereed voor zuivering. 4. Affiniteit Zuivering van het serotonine transporter voor immunisatie en kristallisatie Dooi cellen van 10 liter van de cultuur in warm water (ongeveer 30 ° C) en resuspendeer door snel het passeren van een 10 ml pipet tot homogeen. Bereid schoonmaakmiddel voor solubilisatie (150 ml): 80 mM Tris, pH 8, 150 mM NaCl bevattende 40 mM C12M, 5 mM CHS en proteaseremmer cocktail. Voeg alle cellen in een bekerglas met een roerstaaf en voeg alle detergensoplossing naar de cellen onder roeren. Oplosbaar bij 4 ° C gedurende 1 uur onder roeren. Spin lysaat bij 8000 xg gedurende 15 min bij 4 ° C. Gooi pellet en decant supernatant in schone ultracentrifuge buizen. Spin bij 100.000 xg gedurende 1 uur per ultracentrifuge. Gooi pellet en filter bovenstaande vloeistof door een 0,2 pm filter. Passen lysaat in 10 ml Strep affiniteit hars gepakt in een kolom met een peristaltische pomp geëquilibreerd in wasbuffer: 1 mM C12M, 0,2 mM CHS, 5% glycerol, 25 uM lipide (1-palmitoyl-2-oleoyl-sn -glycero- 3-fosfocholine, 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-fosfoethanolamine, en 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoglycerol bij een molaire verhouding van 1: 1: 1), en 1 uM S-citalopram of SSRI in TBS. Verbinding Strep affiniteitskolom een ​​Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC) systeem waskolom bij 2 ml / minuut met 66 ml (6,6 kolomvolumina) wasbuffer. Elueer gezuiverd eiwit in dezelfde buffer gesupplementeerd met 5 mM desthiobiotine bij 0,5 ml / min met behulp van 33 ml (3,3 kolomvolumina) buffer. Verzamel 1 ml fracties; de piekfracties zal ~ 10 ml. Gezuiverd eiwit kan worden bewaard bij 4 ° C gedurende 2 – 3 d indien gewenst. LET OP: De totale opbrengst zal zijn 3 -4 mg SERT CC en 1 mg van SERT IC. Een absorptie van 2 AU bij 280 nm gelijk aan 1 mg / ml SERT. 5. Reconstitutie van Transporter in liposomen voor immunisatie Bereid liposomen die asolectin: cholesterol: lipide A: hersenen polair lipide (molverhouding 60: 17: 3: 20). Lipiden oplossen in 1 ml chloroform en voeg 40 mg totaal lipide een 100 ml glazen rondbodemkolf met gebruik van de molverhouding. Damp chloroform gedurende ten minste 1 uur onder vacuüm met de rondbodemkolf draaien in warm water, ongeveer 30 ° C. Hydrateren lipiden door toevoeging van 10 ml TBS. Incubeer in buffer gedurende 10 min. Bevries de lipide door het plaatsen van de kolf in vloeibare N2. Ontdooien. Dompel bolvormige bodem van de kolf in een bekerglas gevuld met warm water, ongeveer 30 ° C. Ultrasone trillingen in een badsonicator gedurende 5 minuten. Vortex en herhaal stappen 5.1.3 – 5.1.4 10 keer of totdat de lipidevolledig geresuspendeerd van de bodem en vormt een troebele suspensie. Extrusie van de gehele lipide mengsel tweemaal door middel van 200 nm filters. De lipide zal verschijnen als een melkachtige suspensie voorafgaand aan extrusie; daarna wordt deze doorschijnend. Mis gehele lipide mengsel niet aan de extruder tegelijkertijd als het verstopt raken, wat resulteert in verlies van monster. Spin lipiden bij 100.000 xg gedurende 20 min en resuspendeer in 0,5-1 ml TBS in een concentratie van 40 mg / ml. Concentreer gezuiverde SERT IC 250-500 pL met een 100 kDa MWCO centrifuge concentrator eiwit tot 2-4 mg / ml en verzadiging liposomen met 5 mM C12M. Voeg gezuiverd SERT aan het wasmiddel: lipide mengsel in 1 ml eindvolume. Verwijder C12M door 3 opeenvolgende toevoegingen van 80 mg / ml hydrofobe absorptie hars. Voor de eerste 2 toevoegingen, incubeer met hars met rotatie gedurende 2 uur bij 4 ° C. Verwijder hars door het passeren door glaswol. Voer de laatste incubatie met hars's nachts. Concentreer proteoliposomen door centrifugeren bij 100.000 xg gedurende 20 min. Verwijder het supernatant en resuspendeer pellet in 250-500 ul TBS. Voeg 10 uM eindconcentratie van S-citalopram met het opgeloste eiwit na de laatste verwijdering van hars. Oplosbaar 2,5 pi van de proteoliposomen in SDS-PAGE laadbuffer (62,5 mM Tris, pH 6,8, 10% glycerol, 2% SDS, 0,01% broomfenolblauw, 100 mM DTT) en gerund op een SDS-PAGE gel bij 200 V gedurende 1 h dat SERT zorgen met succes opgelost. Proteoliposomen kunnen worden opgeslagen bij -80 ° C in porties voor lange termijn opslag en ontdooid op ijs voorafgaand aan elke immunisatie. 6. Screening voor antilichamen die 3D-epitopen Screen hybridoma cellijnen door western blot. Antilichamen die SERT herkennen door western blot waarschijnlijk binden lineaire epitopen en zal waarschijnlijk niet nuttig zijn voor structurele studies. Meng 1 ug opzuiveringed SERT IC of SERT CC en draaien op een 4-15% SDS-PAGE gel bij 200 V gedurende 1 uur. Verwijzing naar een nitrocellulosemembraan bij 200 mA gedurende 30 min met behulp Towbin buffer (25 mM Tris, 192 mM glycine, 20% (v / v) methanol, 0,1% SDS). Het membraan kan worden gedroogd en voor onbepaalde tijd bij kamertemperatuur bewaard. Herbevochtiging membraan met 10% methanol, en wassen met PBS (10 mM fosfaat, pH 7,4, 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl). Blokkeren met 5% melkpoeder in PBS gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Wassen met PBS en geïncubeerd met 1 ug / ml antilichaam in PBS met 0,1% melk. Was uitvoerig met PBS dat 0,1% Tween-20. Incuberen met geiten anti-muis antilichaam geconjugeerd aan een IR kleurstof verdund 1: 10.000 in PBS met 0,1% Tween 20 en 0,1% melk. Wassen uitvoerig en scannen met een beeldvormingssysteem. Meng hybridoma supernatant dat westerse negatieve antilichamen met 100 nM SERT CC eiwit met een molaire verhouding van 1: 2 (SERT: mAb) in 200 pl TBS met 1 mM C12M, 0,2 mM CHS, en 1 pM S-citalopram. Centrifugeren bij 100.000 xg gedurende 20 min. Analyseer supernatant dat SERT-mAb complexen en te analyseren met behulp van fluorescentie-detectie Size Exclusion Chromatography (FSEC) 8. Gooi de pellet. Run 100 pl supernatant op een gelfiltratiekolom bij 0,5 ml / min met behulp van een High Performance Liquid Chromatography (HPLC) systeem uitgerust met een fluorescentiedetector (excitatie: 480 nm, Emissie: 510 nm) onder toepassing van een loopbuffer met TBS, 0,4 mM lauryl maltose neopentylglycol en 1 uM S-citalopram. Antilichamen die complexen vormen zal de GFP-fusie-eiwit eerder dan de vrije transporter van de grootte-uitsluiting kolom elueren. Verdun complexen tot en met 10, 1, 0,1 nM in 200 pi TBS met 1 mM C12M, 0,2 mM CHS, en 1 uM S-citalopram en herhaling FSEC. Antilichamen die nog steeds de vervoerder piek kan verschuiven bij lage nanomolaire concentratieshoge affiniteit binders en goede kandidaten voor structurele studies. Hertest binding van FSEC in aanwezigheid van 1 mM serotonine. Antilichamen die specifiek het SSRI gebonden conformatie herkennen binden in aanwezigheid van het substraat. Antilichamen die een 3D epitoop die niet verandert als gevolg van conformatie herkennen bindt ongeacht de ligand aanwezig. Meng paarsgewijze verschillende combinaties van antilichamen en testen van binding door FSEC. Antilichamen die verschillende epitopen herkennen veroorzaken SERT eerder elueren wanneer gecombineerd vergelijking met binding van een enkel antilichaam. Voor initiële structurele studies, selecteert u de hoogste affiniteit antilichamen die 3D-epitopen herkennen. 7. Weergave van antilichaam Fragment in Sf9 Cells Kloon variabele en constante domeinen van Fab door PCR in de insectencellen expressiesysteem voor expressie in Sf9-cellen met behulp van standaard protocollen. Transfecteren 1 x 10 6 Sf9 cellen met 5 ug Bacmid DNA dat voor de lichte en zware ketens van het 8-His gemerkte 8B6 Fab met een GP67 secretie sequentie (zoals in Sectie 3,4). Oogst P1 virus 96 uur na de transfectie en voeg 500 gl P1 virus 1 liter Sf9-cellen bij een dichtheid van 1 x 10 6 cellen / ml in een 2 L kolf P2 virus te maken. Cellen infecteren gedurende 96 uur bij 27 ° C. Harvest P2 virus (volgens paragraaf 3.6). Infect 6 l Sf9-cellen bij een dichtheid van 2-3 x 10 6 cellen / ml met een MOI van 2 met P2 virus, kenmerkend 40 – 50 ml per kolf 1 liter Sf9 cellen per 2 L kolf. Oogst cellen ongeveer 96 uur na infectie. Voeg 50 ml fosfaatbuffer, pH 8 bij een eindconcentratie van 50 mM aan de cellen en centrifugeren bij 4000 xg gedurende 20 min. Gooi de celpellet en filter bovenstaande vloeistof door een 0,2 um filter tangentiële stroom cel. Verzamel supernatant en bewaar bij 4 ° C gedurende 2-3 dagen indien gewenst. <p class="jove_title"> 8. Zuivering van antilichaamfragmenten uit Sf9 Supernatant Concentreer Sf9 supernatant met behulp van een 30 kDa moleculair gewicht Cut Off (MWCO) tangentiële flow cel tot ongeveer 400-800 ml. imidazool, pH 8 toe te voegen op een eindconcentratie van 10 mM en 10 ml His-tag affiniteitshars. Roer in een bekerglas gedurende 1 uur bij 4 ° C. Verzamel His-tag affiniteit hars door centrifugeren bij 2000 xg gedurende 5 minuten. Teruggooi supernatant. Verpak His-tag affiniteit hars in een kolom en aan te sluiten op een FPLC. Wassen His-tag affiniteit hars bij 2 ml / minuut met 66 ml (6,6 kolomvolumina) van 50 mM pH 8, 150 mM NaCl, 25 mM imidazool. Elueer 8B6 Fab in 33 ml 50 mM fosfaat pH 8, 150 mM NaCl, 250 mM imidazool. Verzamel 1 ml fracties. Verdun affiniteit gezuiverd Fab met een 10-voudig volume ijskoude 20 mM acetaat, pH 5. Fab binden aan een 1 ml kation uitwisselende kolom onder toepassing van een peristaltische pomp bij 1 ml / minuut. Aparte Fab met behulp van een 30 ml linoor gradiënt van NaCl (0-500 mM) in 20 mM acetaat pH 5,5 onder toepassing van een FPLC. Fab elueren als een enkele piek bij ~ 300 mM NaCl. Analyseren op een 12,5% SDS-PAGE onder toepassing monsterbuffer bevattende 100 mM DTT. De zware en lichte ketens van het 8B6 Fab loopt bij 27 en 25 kDa, respectievelijk, op een reducerende SDS-PAGE gel. Pool fracties die Fab en concentreer tot minstens 10 – 15 mg / ml met een 30 kDa MWCO eiwit concentrator in een swinging bucket centrifuge bij 3000 x g. Op pH 8 door toevoeging van 1 M Tris pH 8 tot een eindconcentratie van 50 mM en gezuiverd Fab opslag voor lange termijn bij 4 ° C. De totale opbrengst wordt 25-30 mg. Een absorptie van 1,4 AU bij 280 nm gelijk aan 1 mg / ml 8B6 Fab. 9. Vorming van Transporter-antilichaam complexen en Scheiden door Size Exclusion Chromatography Voor kristallisatie, zuiveren de SERT CC by Strep affiniteitschromatografie in C12M zoals eerder beschreven (hoofdstuk 4). <li> Digest met trombine om labels te verwijderen (1: 100 w / w) en EndoH (1:10 w / w) O / N bij kamertemperatuur. Concentreren 250-300 pl met een 100 kDa MWCO centrifuge concentrator eiwit een eiwitconcentratie van 10 mg / ml. Meng geconcentreerd SERT met Fab bij een molaire verhouding van 1: 1,2 in een hoeveelheid van minder dan 500 pl. Centrifugeer bij 100.000 xg bij 4 ° C gedurende 20 min. Verzamel supernatant dat SERT-Fab complex. Discard pellet. Gescheiden door grootte-uitsluitingschromatografie (SEC) onder toepassing van een FPLC op een gelfiltratiekolom geëquilibreerd in TBS dat was aangevuld met 40 mM n-octyl-β-D-maltoside (C8M), 0,5 mM CHS, 5% glycerol, 25 uM lipide (zelfde als in stap 4,5), en 1 pM S-citalopram bij 0,5 ml / min. 0,5 ml fracties te verzamelen en te analyseren op 4-15% SDS-PAGE gels en door tryptofaan fluorescentie door SEC. GFP hebben SERT zal ongeveer 80 kDa lopen op een SDS-PAGE gel. Na verwijdering van de termini en N-gekoppelde suikers zal draaien als een 45 kDa eiwit. Determine die fracties te combineren door het samenbrengen alleen de fracties die monodisperse zijn zoals beoordeeld door analyse van de fracties van tryptofaan fluorescentie SEC (excitatie: 280, emissie: 335 nm). WINKEL gezuiverd SERT-complex 8B6 bij 4 ° C gedurende maximaal 1 week. 10. Kristallisatie van Transporter-antilichaam complexen door Opknoping Drop Voorafgaand aan kristallisatie concentreren piekfracties van de SEC scheiding van de SERT-complex 8B6 2 mg / ml met behulp van een 100 kDa MWCO centrifuge concentrator eiwit. Een absorptie van 2 AU bij 280 nm gelijk aan 1 mg / ml. Voeg extra Fab in een verhouding van 1: 0,05 complex: vrij Fab. Voeg 10 uM gratis S-citalopram. Centrifugeer bij 100.000 xg bij 4 ° C gedurende 20 min. Verzamel supernatant dat de SERT-Fab complex. Discard pellet. Het opzetten van een hangende druppel 24-well scherm bij 4 ° C volgens tabel 1. Grow diffractie kwaliteit kristallen over reservoir oplossingenbevattende 100 mM Tris-NaOH, pH 8,5, 25-125 mM KCl, 32,5-34% PEG 400 en 0,5% 6-aminohexaanzuur. OPMERKING: Gebruik Tris ingesteld met NaOH op pH 8,5 als buffer. Gebruik geen Tris-base bijgesteld met HCl. Het scherm kan worden bereid in 2 ml buizen en gebruikt tot het werk klaar. Zorg om nauwkeurig pipet PEG 400 met behulp van een positieve verplaatsing pipet want het is zeer stroperige! Pipetteer 500 ul van elke voorraadoplossing in een low profile 24-wells plaat met afdichtmiddel aangebracht in elk putje. Pipette 1,5, 1,75 en 2 pi van de SERT-8B6 complex op een 18 mm gesiliconiseerde glazen afdekplaat slip. Pipetteer 1 pl voorraadoplossing bovenop het eiwitmonster. OPMERKING: De plaat werd aangekocht kit reeds aangebracht op de rand van de putjes. Solliciteer dekking dia om de 24-wells met de dalingen tegenover het reservoir oplossing en sluit direct door te drukken dekglas op kit vooraf aangebracht in elk putje. Ga door tot alle 24-wells zijn opgezet. </li> Laat de voltooide plaat in een goed geïsoleerde kamer bij 4 ° C. Mis platen niet storen minstens 3 dagen LET OP: Single kristallen verschijnen binnen ongeveer 3 dagen en groeien tot 100-175 urn na 14 dagen. Harvest kristallen in cryoloops en direct flash-cool in vloeibare N 2 voorafgaand aan de X-ray diffractie verzamelen van gegevens. Indien nodig, vindt aanvullende kristallisatie voorwaarden door brede screening met opknoping druppels. Met drie druppels met eiwit: neerslagmiddel verhoudingen van 2: 1, 1,5: 1, 1: 1. Als een robot beschikbaar is, dan is het opzetten van 100-150 nL druppels op 70 pi van het reservoir oplossing in een 96-well plaat. 3D grotere kristallen kunnen worden gekweekt in 24-wells. Score gebaseerd op het uiterlijk van de daling: 0, duidelijk; 1, stof; 2, granulair precipitaat; 3, fasescheiding; 4, microkristallijne; 5, naalden; 6, borden; 7, 3D kristallen. Opgericht kristallisatie door opknoping daling methoden in 24-wells zoals hierboven is beschreven in de buurt van nieuw geïdentificeerde conditions.