JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
עברית

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biochemistry

Thermostabilization, ביטוי, טיהור, התגבשות של Transporter סרוטונין האדם Bound כדי<em> S</em> -citalopram

Published: November 27, 2016
doi:
10.3791/54792
, ,
1Vollum Institute,Oregon Health & Science University, 2Graduate Group in Biophysics,University of California, San Francisco, 3Howard Hughes Medical Institute,Oregon Health & Science University

Summary

כתב יד זה מתאר כיצד למסך מוטציות thermostabilizing, לטהר את טרנספורטר הסרוטונין האדם, ליצור נוגדנים זיקה גבוהה, ולגבש במתחם טרנספורטר-נוגדן סרוטונין מאוגד -citalopram S תרופה נגד דיכאון. פרוטוקול זה יכול להיות מותאם המחקר של מובילי קרום מאתגר אחרים, קולטנים, ותעלות.

Abstract

טרנספורטר הסרוטונין הוא טרנספורטר נתרן כלוריד מצמידים כי "משאבות" סרוטונין תאיים לתאים. -citalopram S היא תרופה המשמשת לטיפול בדיכאון וחרדה על ידי קשירה של טרנספורטר הסרוטונין עם זיקה גבוהה, חסימת ספיגה חוזרת של סרוטונין. כאן אנו מדווחים הליך יעיל סט של כלים כדי לייצב, מפורשת, לטהר, ולגבש מתחמי טרנספורטר-נוגדן סרוטונין כבול S -citalopram וכן תרופות נוגדות דיכאון אחרות. מוטציות אשר לייצב את טרנספורטר הסרוטונין זוהו באמצעות S -citalopram מחייב assay. טרנספורטר הסרוטונין לידי ביטוי baculovirus-transduced HEK293S GnTI – תאים, היה מחדש לתוך proteoliposomes והשתמשו להעלות נוגדנים גבוהה זיקה. פיתחנו אסטרטגיה לגלות נוגדנים כי הם שימושיים עבור מחקרים מבניים. גישה פשוטה על מנת לתת ביטוי שברי נוגדן בתאי Sf9 גם כבר נקבעה.מתחמי Transporter-נוגדן מטוהרים באמצעות הליך זה הם התנהגו היטב בקלות להתגבש, הפקת מתחמי עם S -citalopram כי diffract צילומי רנטגן 3-4 ברזולוציה Å. האסטרטגיות שפותחו כאן יכולות להיות מנוצלות כדי לקבוע את המבנה של חלבונים בממברנה אחרים אתגרים.

Introduction

טרנספורטר הסרוטונין (בהלבשה) הוא חלבון ממברנלי אינטגרלי המאפשר התחבורה של סרוטונין על פני קרום התא 1. בהלבשה שייך למשפחה של נוירוטרנסמיטר נתרן Symporters (NSSs) אשר כוללת גם את דופאמין ונוראפינפרין מובילי 2. בהלבשה היא היעד המולקולרי של תרופות נוגדות דיכאון שנקבעו נרחב נגד חרדה אשר פועלות לעכב תחבורת סרוטונין תחרותית 3. בהלבשה מנצלת את cotransport הנוח האנרגטי של נתרן כדי להסיר הנוירוטרנסמיטר מן השסע הסינפטי. אפיון נרחב של מערכת serotonergic הוכיח כי שינויים במטבוליזם של סרוטונין מראית עין של השפעה כמעט כל תהליכי הנוירולוגיות כוללים מצב רוח, שינה, כאבים, קוגניציה, ותוקפנות התנהגויות 4. פונקציה בהלבשה ניתן לשנות באמצעות השימוש בתרופות נוגדות דיכאון ו סלקטיבי סרוטונין reuptake מעכבי (SSRI) כמו S -citalopram, כמו גם על ידי psychostimulants וסמים של התמכרות כגון אמפטמין ו 3,4-methylenedioxy- N -methylamphetamine או "אקסטזה" 1,2.

SSRIs הן בעלות חשיבות עצומה לטיפול הפרעות במצב רוח, עדיין את הבסיס המבני המדויק לפעולה שלהם אינו מובן היטב. בהלבשת WT היא יציבה מיצלות חומרי ניקוי, ובכך מעכב את התקדמות לקראת מבנה תלת-ממדי (3D) של בהלבשה 5,6. לאחרונה, פיתחנו גרסאות של בהלבשה אשר יציבים וחסונה במגוון רחב של חומרי ניקוי ולשמר SSRI מחייב פעילות 6. גרסות בהלבשת thermostable אלה נבחרו באמצעות assay thermostability קרב מבוסס נצנץ. כאן אנו מתארים הליך לייצור נוגדנים גבוהה זיקה אשר יכול לקשור סרט, ואת טיהור התגבשות של בהלבשה thermostable, בקומפלקס עם נוגדן ו- S -citalopram.

פרוטוקול זה מבוסס על ההנחה כי בהלבשה ו 8B6 גנים כבר מוצלחy משובט לתוך וקטורי ביטוי BacMam 7 חרקים, בהתאמה. כדי ליצור נוגדנים, שאריות קידוד cDNA 73-616 של WT בהלבשה שובט לתוך וקטור BacMam עם תג בטרמינל C-סטרפטוקוקוס השנייה (בהלבשה IC). לקבלת המסך thermostability, שאריות בהלבשה 73-616 עם GFP C- מסוף, סטרפטוקוקוס השנייה, ו -10 שלו תגים (TC בהלבשה) היה בשימוש. מוטציות נקודה בודדת נוצרו ברקע TC בהלבשה. בשביל הפרוטוקול התגבשות, החלבון היתוך-GFP בהלבשה שימש עם Twin-סטרפטוקוקוס [TrpSerHisProGlnPheGluLys (GlyGlyGlySer) 2 GlyGlySerAlaTrpSerHisProGlnPheGluLys] ו -10 שלו תגים, נושאת את מוטציות thermostable, Y110A, I291A, ו T439S ומוטציות של C554A cysteines השטח, C580A , ו C622A (CC בהלבשה). רצפים מחשוף תרומבין (LVPRGS) הוכנסו גם CC בהלבשה לאחר Q76 ו- T618 כדי לאפשר הסרה של N- ו- C-טרמיני. הפלסמיד קידוד Fab 8B6 היה שהונדסו הן כבד וקלשרשרות של הנוגדן עם רצפי הפרשת GP67 בשליטת שני יזמי polyhedrin נפרדים. C- הסופית של השרשרת הכבדה של נוגדן 8B6 תויג עם התג 8-שלו ואתר מחשוף תרומבין הוכנס בין השרשרת הכבדה ואת התג.

Protocol

1. Transfection של חסיד HEK293S GnTI – תאים עבור מסך Thermostability כן Poly-D- ליזין (PDL) מצופה 96-גם צלחות. בצע את כל העבודה במנדף זרימה למינרית סטרילי. סנן פתרון 25 מיקרוגרם / מ"ל ​​של (PDL), משקל מולקולרי 70,000-150,000 Da, באמצעות מסנן 0.2 מיקרומטר סטרילי. הוסף 50 μL של PDL היטב בכל צלחת תרבות רקמות 96-היטב (TC), הבטחה התחתונה הוא מצופה באופן שווה, דגירה על RT למשך 30 דקות. פתרון לשאוב PDL ולשטוף עם 200 μL של מים סטריליים. אפשר צלחת לאוויר יבש עבור 2 שעות לפני אחסון ב 4 ° C. ניתן לאחסן צלחות PDL מצופה ב 4 מעלות צלזיוס במשך כמה שבועות. Trypsinization של תאי HEK293S חסידים. לגדול HEK293S 80% confluency בצלחת 10 ס"מ על 37 מעלות צלזיוס עם 8% CO 2. מנה אחת 10 סנטימטרים צריכה כ -10 מיליון תאי HEK293S. אין להשתמש תאים לאחר 30 קטעים! </li> התקשורת לשאוב ולשטוף עם 5 מ"ל של פוספט-בופר (PBS). הוסף 1 מ"ל של תמיסת טריפסין-EDTA (0.25% טריפסין, 0.02% EDTA) לתאים דגירה במשך 2 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. הוסף 10 מ"ל של מדיום הנשר שונה של Dulbecco (DMEM) בתוספת 10% עוברית שור סרום (FBS) ותאי resuspend ידי pipetting מעלה שוב ושוב ולמטה בעזרת פיפטה סרולוגיות. פיפטה 10 μL של תאים ומערבבים עם 10 μL של Trypan פתרון כחול (0.4%). לקבוע צפיפות התאים באמצעות hemocytometer מיקרוסקופ אור. אל תסמכו תאים מגואלות כחולות כשהם מתים. ודא כדאיות תא היא מעל 90%. ביסודיות resuspend trypsinized HEK293S GnTI – תאי DMEM בתוספת 10% FBS כדי בצפיפות של 0.5 x 10 6 תאים / מיליליטר במאגר פיפטה חד פעמי. כ -5 מיליון תאים HEK293S יהיה צורך עבור כל צלחת. סך של 24 מבנים ניתן transfected על כל צלחת באמצעות יחסי ציבור זהotocol. בעזרת פיפטה רבה, להוסיף 100 μL של תאים לכל גם צלחת מצופה PDL. תאי Resuspend במאגר פיפטה לאחר מילוי כל צלחת כדי להבטיח חלוקה שווה של תאים. דגירה תאים 37 ° C חממה עם 8% CO 2. לאחר 24 שעות, התאים צריכים להגיע כ -80% confluency. h 1 לפני transfection להחליף תקשורת. כן מתחמי הגיב DNA-transfection עבור transfection. עבור כל לבנות ברקע TC בהלבשה שיוקרנו, לערבב 450 DNA ng עם 45 μL של סרום ללא DMEM ומערבבים. להוסיף 1.6 μL של מגיב transfection 45 μL של סרום ללא DMEM ומערבבים. מיד להוסיף פתרון מגיב transfection מדולל פתרון ה- DNA ומערבבים. אין לערבב פתרונות בסדר הפוך. המתן 10 – 15 דקות ולהוסיף 20 μL של תערובת מגיב transfection / DNA עד 4 בארות. לאחר שכל הבארות כבר transfected, לערבב צלחת ידי הנדנדה בעדינות בחזרהnd ושוב ולחזור 37 ° C חממה. אחרי 16 – 24 שעות להחליף תקשורת עם סרום המכיל DMEM ו -10 בוטיראט נתרן מ"מ. כ 48 שעות שלאחר transfection להסיר תקשורת ואו מייד להמשיך עם thermostability מסך או להקפיא תאים ב -80 ° C כדי לשמש מאוחר יותר. תאים ניתן לאחסן ב -80 מעלות צלזיוס במשך כמה שבועות. 2. נצנץ הסמיך מבוסס מסך Thermostability עם S -citalopram דגירה תאים עם 200 S -citalopram ננומטר ב 25 μL של TBS (מלוחים טריס שנאגרו – 20 מ"מ טריס, pH 8, 100 מ"מ NaCl) במשך 5 דקות ב RT. Solubilize התאים על ידי הוספת 25 μL של 8 מ"מ n-dodecyl-β-D-maltopyranoside (C12M), hemmisuccinate cholesteryl 1 מ"מ (CHS), מעכבי פרוטאז קוקטייל (פלואוריד phenylmethanesulfonyl 2 מ"מ (PMSF), 0.1 מ"ג / aprotinin מ"ל, 4 גרם / מ"ל ​​pepstatin A, ו -4 מיקרוגרם / מ"ל ​​leupeptin) ב TBS, דוגרים במשך שעה 1 ב RT. הוסף 50 μL של wi TBSה 20 ננומטר [3 ח] citalopram (81.7 Ci / mmol), 0.1% בסרום שור אלבומין, ו -2 מ"ג / מיליליטר assay קרבת נצנץ זיקת התג שלו (SPA) חרוזי שלוש בארות עבור כל מבנה. עבור האחרון גם להוסיף את אותו פתרון שמופיע אבל להשלים עם 100 סרטרלין מיקרומטר כדי לקבוע מחייב ספציפי. ודא חרוזי SPA זיקת התג שלו מעורבבים היטב בעת ההוספה לצלחת 96-היטב. מדוד [3 ח] citalopram מחייב בעזרת מונה נצנץ 96-גם ב RT עם הזמן לספור 1 דק 'בכל טוב. המשך צלחות לספור עד ספירה כולל רמה (כ אחרי 36 שעות). צלחות חומות במשך 15 דקות בתוך גוש חימום עם מכסה מחומם על 33 ° C. מדוד [3 ח] citalopram מחייב שוב אחרי חימום כמתואר 2.4. חזור על שלב 2.4 – 2.5 ו לשנות את הצעד חימום עד 36 מעלות צלזיוס, 39 ° C, 45 ° C, 48 ° C, 51 ° C. התאם טמפרטורות חימום תלויות היתוך הטמפרטורה לכאורה (Tm)של חלבון המטרה ואת thermostability של המבנה היציב ביותר. המשך לחמם צלחות עד שכל יש מבני ספירה נמוכה ספציפית. ניתוח נתונים כדי לקבוע ערכי Tm. קבע את ספירת הכוללת הממוצעת לדקה (CPM) של כל לבנות עבור בארות שאינם מכילים סרטרלין ידי ממוצעים 3 בארות לשכפל. קבע את CPM הספציפי על ידי חישוב ממוצע CPM של כל סרטרלין המכיל היטב צלחת אחת. חישוב CPM המבוקש על ידי הפחתת CPM הספציפי מן CPM הכולל. חשב את Tm ידי בכושר שאינו ליניארי לפונקציה sigmoidal בולצמן. בונה עם CPM הסגולי הנמוך ב RT (<10% WT) בדרך כלל אין לי ערכי Tm מדויקים. מוטציות מן המבנים ביותר thermostable ניתן לשלב יחד לגילוי עליות כתוסף thermostability. 3. הביטוי של Transporter סרוטונין האדם HEK293S GnTI <sup> – תאים Transform כימי מוסמכת תאי DH10Bac עם 1 ננוגרם של פלסמיד. הוסף פלסמיד 50 μL של תאי DH10Bac דגירה על קרח למשך 30 דקות. תאי חום הלם DH10Bac על 42 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות. הוספת 200 μL של מדיום SOC ו לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 4 שעות עם רעד. פלייט כל החיידקים על צלחת לוריא מרק (LB) המכיל 50 מיקרוגרם / מ"ל ​​kanamycin, 7 מיקרוגרם / גנטמיצין מ"ל, 10 מיקרוגרם / טטרציקלין מ"ל, 100 מיקרוגרם / מ"ל ​​5-bromo-3-indolyl β-D-galactopyranoside, ו 40 מיקרוגרם / מ"ל ​​איזופרופיל β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG). לבודד lacZ – מושבות (מושבות לבנות) גדלו ב 37 מעלות צלזיוס למשך 2 ד על צלחות אגרו LB. לגדול כמה מושבות O / N ב 37 מעלות צלזיוס ב 5 מ"ל של אנטיביוטיקה LB המכיל ולבודד DNA bacmid. ספין למטה חיידקים XG ב 1000 בצנטריפוגה במשך 5 דקות. supernatant מחק. חיידקים גלולים עם 200 μL של miniprep rחיץ esuspension. Lyse חיידקים על ידי הוספת 200 μL של חיץ תמוגה miniprep ואת היפוך הצינור בעדינות 10 פעמים. הוספת 200 μL של חיץ הניטרול. הסר חלק מסיס על ידי ספינינג ב 14,000 XG במשך 10 דקות בצנטריפוגה. הוסף 1 מ"ל של isopropanol כדי supernatant ומקררים ב -20 ° C במשך 20 דקות כדי לזרז DNA. ספין על 14,000 XG במשך 15 דקות בצנטריפוגה וזורקים supernatant. לשטוף DNA גלולה עם 70% EtOH ספין שוב ב 14,000 XG במשך 15 דקות. supernatant מחק. אוויר DNA היבש עד שכל EtOH התאדה ו resuspend ב 50 μL של מים. הערה: Bacmid DNA צריך להיות transfected לתאי Sf9 מיד לקבלת התוצאות הטובות ביותר, אך עשוי גם להיות מאוחסן ב -20 מעלות צלזיוס במשך כמה שבועות. Transfect bacmid DNA לתוך 1×10 6 תאים של חסיד Sf9 הגדלים בתא humidified על 27 מעלות צלזיוס בצלחת 6 באר. בצע את כל המניפולציות תרבית תאים במנדף זרימה למינרית סטרילי. <li> סר מדיה מתאי ולהוסיף 2 מיליליטר של תקשורת Sf9 הטריה. הוסף 5 מיקרוגרם של ה- DNA bacmid 100 μL של התקשורת Sf9 (פתרון א). הוסף 8 μL של מגיב transfection Sf9 קטיוני שומנים בדם 100 μL של התקשורת Sf9 (B פתרון). דגירת צינור המכיל תמיסת B במשך 5 דקות. מערבבים תמיסה המכילה צינור עם פתרון B לדגור על RT למשך 30 דקות ולהוסיף את כל הפתרון התאים Sf9. לאחר 96 שעות, supernatant הקציר (וירוס P1) על ידי עובר דרך פילטר 0.2 מיקרומטר. הווירוס P1 יכול להיות מאוחסן במשך מספר חודשים על 4 מעלות צלזיוס בחושך ולעשות בהם שימוש חוזר לעשות וירוס P2 לפי הצורך. הוספת 100 μL של וירוס P1 1 ליטר של תאים Sf9 בצפיפות של 1 x 10 6 תאים / מ"ל בתקשורת Sf9. להדביק תאים עבור 96 שעות, גדל ב 27 ° C על שייקר ב 100 סל"ד. ספין למטה התאים בצנטריפוגה ב 4000 XG במשך 15 דקות ולסנן supernatant המכיל חלקיקי הנגיף דרך פילטר 0.2 מיקרומטר. מחק תא גלול. Determצפיפות ויראלי ine באמצעות assay רובד נגיפי או דלפק וירוס. צפיפות וירוס צריך להיות> 1 x 10 חלקיקים 8 וירוס למיליליטר. P2 וירוס יכול להיות מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס בחושך במשך מספר חודשים. להדביק 10 ליטר של HEK293S GnTI – תא 7 גוברת השעיה על 37 מעלות צלזיוס עם 8% CO 2 ולחות 85% על שייקר ב 130 סל"ד ב 293 תקשורת ביטוי בתוספת 2% FBS על ריבוי של זיהום (משרד פנים) של 2 ו צפיפות של 3 x 10 6 תאים / מ"ל, בדרך כלל 30 – 50 מ"ל של וירוס P2 לכל 800 מ"ל של תאים L 2 מבולבל הבקבוק. הערה: לא מומלץ להשתמש יותר מ -80 מיליליטר של וירוס P2 מאז HEK293S GnTI – תאים יגדלו לאט עלול להפוך unviable עקב שינוי ב- pH. תקשורת Sf9 היא חומצי יותר בתקשורת הביטוי 293. 12 – 16 שעות לאחר ההדבקה, להוסיף בוטיראט נתרן לריכוז של 10 מ"מ ממלאי 1 M. 48 – 60 שעות לאחר הדבקה, תאי קציר על ידי צנטריפוגה ב4,000 XG במשך 15 דקות. הסר את supernatant. Resuspend התאים 150 מ"ל של TBS, 2 מיקרומטר S -citalopram או מעכבי בהלבשה אחרים ולאחסן ב -80 ° C עד מוכן לניקוי. טיהור זיקה 4. של Transporter סרוטונין לחיסון וגיבוש ההפשרה תאים 10 ליטר של תרבות במים חמים (כ 30 מעלות צלזיוס) ו resuspend ידי עובר במהירות דרך פיפטה 10 מ"ל עד הומוגניות. הכן פתרון אבקת עבור solubilization (150 מ"ל): 80 מ"מ טריס, pH 8, 150 מ"מ NaCl המכיל 40 מ"מ C12M, 5 מ"מ CHS, מעכבי פרוטאז קוקטייל. הוסף את כל תאי מבחנה עם בר מערבב ומוסיף את כל בתמיסת דטרגנט לתאים תוך ערבוב. Solubilize על 4 מעלות צלזיוס במשך שעה 1 עם ערבוב. ספין lysate ב 8000 XG במשך 15 דקות ב 4 ° C. מחק גלול ו supernatant למזוג לתוך צינורות ultracentrifuge נקיים. ספין ב 100,000 XG במשך 1 שעה בבית ultracentrifuge. מחק גלול ולסנן supernatant דרך פילטר 0.2 מיקרומטר. לעבור lysate מעל 10 מ"ל של סטרפטוקוקוס זיקה שרף ארוזים בתוך עמודה באמצעות משאבת peristaltic equilibrated במאגר לשטוף: 1 מ"מ C12M, 0.2 מ"מ CHS, 5 גליצרול%, 25 מיקרומטר השומנים (1-Palmitoyl-2-oleoyl- SN -glycero- 3-phosphocholine, 1-Palmitoyl-2-oleoyl- SN -glycero-3-phosphoethanolamine, ו 1-Palmitoyl-2-oleoyl- SN -glycero-3-phosphoglycerol לפי יחס טוחנת של 1: 1: 1), ו 1 -citalopram או SSRI S מיקרומטר ב TBS. חבר הטור זיקה סטרפטוקוקוס על כרומטוגרפיה נוזלית חלבון מהיר מערכת (FPLC) ולשטוף טור ב 2 מ"ל / דקה עם 66 מ"ל (6.6 כרכים עמודה) של חיץ לשטוף. Elute החלבון מטוהרים באותו חיץ בתוספת 5 מ"מ desthiobiotin ברמה של 0.5 mL / min באמצעות 33 מ"ל (3.3 כרכים עמודה) של חיץ. אסוף 1 שברים מ"ל; שברי השיא יהיו ~ 10 מיליליטר. חלבון מטוהר עשוי להיות מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס למשך 2 – 3 ד אם ירצה בכך. הערה: תשואה סה"כ תהיה 3 -4 מ"ג של CC בהלבשה ו 1 מ"ג של IC בהלבשה. ספיגת של 2 AU ב 280 ננומטר הוא שווה ל 1 מ"ג / מ"ל ​​בהלבשה. כינון 5. של Transporter לתוך ליפוזומים לחיסון כן ליפוזומים המכילים asolectin: כולסטרול: שומנים: מוח שומנים קוטביים (60 יחס טוחן: 17: 3: 20). ממסי שומני 1 המ"ל של כלורופורם ולהוסיף 40 מ"ג של שומנים הכוללים כוס מיליליטר 100 בקבוק עגול תחתון בבית היחס הטוחן המצוין. להתאדות כלורופורם לפחות 1 h תחת ואקום עם הבקבוק התחתי העגול מסתובב במים חמים, כ -30 מעלות צלזיוס. רעננותם שומנים על ידי הוספת 10 מ"ל של TBS. דגירה במאגר למשך 10 דקות. להקפיא את השומנים על ידי הצבת את הבקבוק בנוזל N 2. לְהַפְשִׁיר. לטבול תחתון כדורית של הבקבוק בכוס מלאה מים חמים, כ -30 מעלות צלזיוס. Sonicate בתוך sonicator אמבטיה במשך 5 דקות. צעדים וורטקס וחזור 5.1.3 – 5.1.4 10 פעמים או עד השומניםלגמרי הוא resuspended מלמטה ויוצר השעיה מעוננת. Extrude את תערובת שומנים כולו פעמיים דרך 200 מסננים ננומטר. השומנים יופיעו כמו השעיה חלבית לפני שהחול; אחר כך זה יהיה שקוף. אל תוסיף את תערובת שומנים כולו מכבש בבת אחת כפי שהוא יכול להיות סתומים, והתוצאה היא אובדן של מדגם. ספין שומנים ב 100,000 XG במשך 20 דקות ו resuspend ב 0.5 – 1 מ"ל של TBS בריכוז של 40 מ"ג / מ"ל. תתרכז מטוהרים בהלבשה IC 250 – 500 μL באמצעות concentrator חלבון צנטריפוגות 100 kDa MWCO – 2 4 מ"ג / מ"ל ו להרוות ליפוזומים עם 5 מ"מ C12M. להוסיף בהלבשה מטוהרים הדטרגנטים: תערובת שומנים ב 1 נפח סופי מ"ל. הסר C12M ידי 3 תוספות רצופות של 80 מ"ג / שרף קליטה הידרופובי מיליליטר. עבור 2 התוספות הראשונות, דגירה עם שרף עם סיבוב עבור 2 שעות על 4 ° C.. הסר שרף על ידי עובר דרך צמר זכוכית. בצע הדגירה הסופית עם שרףבין לילה. תתרכז proteoliposomes ידי צנטריפוגה ב 100,000 XG במשך 20 דקות. מחק גלולה supernatant ו resuspend ב 250 – 500 μL של TBS. הוסף 10 מיקרומטר ריכוז סופי של S -citalopram לחלבון מחדש לאחר ההסרה הסופית של שרף. Solubilize 2.5 μL של proteoliposomes במאגר טעינת SDS-PAGE (62.5 מ"מ טריס, pH 6.8, 10% גליצרול, 2% SDS, 0.01% כחול bromophenol, 100 מ"מ DTT) ולהפעיל על ג'ל SDS-PAGE ב 200 V עבור 1 h כדי להבטיח בהלבשה כי כבר מחדש בהצלחה. ניתן לאחסן Proteoliposomes ב -80 מעלות צלזיוס aliquots עבור אחסון לטווח ארוך מופשר על הקרח לפני כל חיסון. הקרנת 6. נוגדנים הכרה אפיטופים 3D שורות תאי מסך hybridoma ידי כתם מערבי. נוגדנים אשר מכירים בהלבשה ידי כתם המערבי לאגד אפיטופים ליניארי סביר ואת סביר להניח שלא להיות שימושי עבור מחקרים מבניים. מערבבים 1 מיקרוגרם של purified בהלבשה IC או CC בהלבשה ולהפעיל על 4 – ג'ל 15% SDS-PAGE ב 200 V עבור H 1. העברה קרום nitrocellulose ב 200 mA למשך 30 דקות באמצעות חיץ-טובין (25 מ"מ טריס, 192 גליצין מ"מ, 20% (V / V מתנול), 0.1% SDS). הממברנה ניתן לייבש ולאחסן ללא הגבלת זמן בטמפרטורת החדר. קרום להרטיב עם 10% מתנול, ולשטוף עם PBS (10 פוספט מ"מ, pH 7.4, 137 מ"מ NaCl, 2.7 מ"מ KCl). חסום עם 5% אבקת חלב ב PBS למשך 30 דקות ב RT. לשטוף עם PBS ו דגירה עם 1 מיקרוגרם / מ"ל ​​של הנוגדן PBS עם חלב 0.1%. לשטוף נרחב עם PBS המכיל 0.1% Tween-20. דגירה עם נוגדן אנטי עכבר עז מצומדות כדי לצבוע IR מדולל 1: 10,000 ב PBS עם 0.1% Tween 20 וחלב 0.1%. לשטוף בהרחבה לסרוק באמצעות מערכת הדמיה. מערבבי supernatant hybridoma המכיל נוגדנים שליליים מערביים עם 100 ננומטר חלבון בהלבשה CC באמצעות טוחנת יחס של 1: 2 (SERT: מב) ב 200 μL TBS עם 1 מ"מ C12M, 0.2 מ"מ CHS, ו -1 מיקרומטר S -citalopram. צנטריפוגות ב 100,000 XG במשך 20 דקות. לנתח supernatant המכיל מתחמים בהלבשה-מב ולנתח ידי כרומטוגרפיה הדרת גודל קרינת זיהוי (FSEC) 8. וזורק את הכדור. הפעל 100 μL של supernatant על עמודה הדרה גודל ברמה של 0.5 mL / min באמצעות מערכת (HPLC) כרומטוגרפיה נוזלית בעל ביצועים גבוהים מצויד גלאי הקרינה (עירור: 480 ננומטר, פליטה: 510 ננומטר) באמצעות למאגר פועל המכיל TBS, 0.4 מ"מ גליקול neopentyl מלטוז לאוריל, ו -1 מיקרומטר S -citalopram. נוגדנים אשר ליצירת קומפלקסים יגרמו חלבון-GFP ההיתוך כדי elute לפני טרנספורטר חינם מהעמודה בגודל ההדרה. לדלל מתחמי עד 10, 1, 0.1 ננומטר ב 200 μL TBS עם 1 מ"מ C12M, 0.2 מ"מ CHS, ו -1 מיקרומטר S -citalopram החוזרת FSEC. נוגדנים אשר עדיין יכול להעביר את שיא טרנספורטר בריכוזי nanomolar נמוכים הםקלסרים זיקה גבוהים מועמדים טובים מחקרים מבניים. בדוק שוב מחייב ידי FSEC בנוכחות 1 סרוטונין מ"מ. נוגדנים אשר במיוחד להכיר את הקונפורמציה כבול SSRI זו לא יחייבו בנוכחות המצע. נוגדנים אשר מזהה אפיטופ 3D שאינו משתנה כתוצאה קונפורמציה יהיה לאגד קשר בהווה ליגנד. מערבבים שילובים שונים pairwise של נוגדנים ולבדוק מחייב ידי FSEC. נוגדנים אשר מכירים אפיטופים ברורים יגרמו בהלבשה כדי elute מוקדם בשילוב יחד לעומת עקדת נוגדן יחיד. עבור מחקרים מבניים ראשוניים, בחר נוגדני הזיקה הגבוהים ביותר אשר מכירים אפיטופים 3D. 7. ביטוי של נוגדן בתאי Sf9 תחומים משתנים וקבועים שיבוט של Fab ידי PCR לתוך מערכת ביטוי חרקים לביטוי בתאי Sf9 באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים. Transfect 1 x 1 0 6 תאים Sf9 עם 5 מיקרוגרם של ה- DNA Bacmid קידוד הרשתות קל וכבד של Fab 8B6 8-שלו מתוייגים עם רצף הפרשת GP67 (כהוראת סעיף 3.4). קציר P1 וירוס 96 שעות posttransfection ולהוסיף 500 μL של וירוס P1 1 ליטר של תאים Sf9 בצפיפות של 1 x 10 6 תאים / מ"ל בבקבוק 2 ליטר לעשות וירוס P2. להדביק תאים עבור 96 שעות ב 27 מעלות צלזיוס. קציר וירוס P2 (כהוראת סעיף 3.6). להדביק 6 ליטר של תאים Sf9 בצפיפות של 2 – 3 x 10 6 תאים / מ"ל עם משרד הפנים של 2 בווירוס P2, בדרך כלל 40 – 50 מ"ל לכל בקבוק עם 1 ליטר של תאים Sf9 בכל בקבוק 2 ליטר. קציר תאים כ 96 שעות postinfection. הוסף 50 מ"ל של חיץ פוספט, pH 8 בריכוז סופי של 50 מ"מ אל התאים ספין ב 4000 XG במשך 20 דקות. מחק את התא גלול ולסנן supernatant דרך תא זרימה משיקה 0.2 מיקרומטר סינון. איסוף supernatant וחנות ב 4 ° C. עבור 2 – 3 ימים אם תרצה בכך. <p class="jove_title"> 8. טיהור של נוגדן שברי Sf9 Supernatant תתרכז supernatant Sf9 באמצעות 30 kDa מולקולרית משקל Cut Off (MWCO) התא זרימה המשיקים כ -400 – 800 מ"ל. להוסיף imidazole, pH 8 בריכוז סופי של 10 מ"מ ו 10 מ"ל של שרף זיקתו-תג. מערבבים בכוס של 1 ש 'ב 4 ° C. אסוף שרף זיקת התג שלו על ידי צנטריפוגה XG ב 2000 למשך 5 דקות. supernatant מחק. לארוז שרף זיקת התג שלו אותם בטור להתחבר FPLC. לשטוף שרף זיקה תג שלו ב 2 מ"ל / דקה עם 66 מ"ל (6.6 כרכים עמודה) של pH 8 פוספט 50 מ"מ, 150 מ"מ NaCl, 25 imidazole מ"מ. Elute 8B6 Fab ב 33 מ"ל של pH 8 פוספט 50 מ"מ, 150 מ"מ NaCl, 250 imidazole מ"מ. אסוף 1 שברים מ"ל. לדלל זיקה המטוהרת Fab עם נפח של פי 10 של אצטט קר כקרח 20 מ"מ, pH 5. לאגד Fab לעמודה קטיוני 1 מ"ל באמצעות משאבת peristaltic ב 1 מ"ל / דקה. Fab הנפרד באמצעות 30 מיליליטר ליןשיפוע האוזן של NaCl (0 – 500 מ"מ) ב- pH אצטט 20 מ"מ 5.5 באמצעות FPLC. Fab יהיה elute כמו לשיא יחיד ב ~ 300 מ"מ NaCl. לנתח על ג'ל 12.5% ​​SDS-PAGE באמצעות חיץ מדגם המכיל 100 מ"מ DTT. השרשרות הכבדות וקלות של Fab 8B6 תפעלנה בשעת 27 ו -25 kDa, בהתאמה, על ג'ל הפחתת SDS-PAGE. שברים בריכה המכילים Fab ולהתרכז לפחות 10 – 15 מ"ג / מ"ל ​​באמצעות concentrator חלבון 30 kDa MWCO בצנטריפוגה דלי מתנדנד ב 3000 x ז. התאם ל- pH 8 על ידי הוספת 1 M טריס pH 8 לריכוז סופי של 50 מ"מ ולאחסן מטוהרים Fab לטווח ארוך ב 4 ° C.. תשואה סה"כ תהיה 25 – 30 מ"ג. ספיגת של 1.4 AU ב 280 ננומטר הוא שווה ל 1 מ"ג / מ"ל ​​של 8B6 Fab. 9. כינונה של קומפלקסים נוגדן-Transporter והפרדה על ידי כרומטוגרפיה הדרה גודל עבור התגבשות, לטהר את CC בהלבשה ידי כרומטוגרפיה זיקה סטרפטוקוקוס ב C12M כמתואר לעיל (סעיף 4). <li> Digest עם תרומבין להסיר תגים (1: 100 w / w) ו EndoH (01:10 w / w) O / N ב RT. להתרכז כדי 250 – 300 μL באמצעות concentrator חלבון צנטריפוגות 100 kDa MWCO לריכוז חלבון של 10 מ"ג / מ"ל. מערבב בהלבשה מרוכזת עם Fab לפי יחס טוחן של 1: 1.2 בנפח של פחות מ -500 μL. צנטריפוגה ב 100,000 XG ב 4 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות. איסוף supernatant המכיל קומפלקס בהלבשה-Fab. גלולה מחק. הפרד על ידי כרומטוגרפיה הדרה גודל (SEC) באמצעות FPLC על עמודה הדרה גודל equilibrated ב TBS השלימו עם 40 מ"מ n-octyl-β-D-maltoside (C8M), 0.5 מ"מ CHS, 5% גליצרול, 25 מיקרומטר השומנים (זהה בשלב 4.5), ו -1 מיקרומטר S -citalopram ברמה של 0.5 mL / min. אסוף 0.5 שברים מ"ל ולנתח ב -4 – 15% ג'ל SDS-PAGE וכן על ידי הקרינה טריפטופן על ידי ה- SEC. GFP מתויג בהלבשה יפעל על כ 80 kDa על ג'ל SDS-PAGE. לאחר הסרת טרמיני וסוכרים N-linked זה יפעל כמו חלבון 45 kDa. Determine אשר שברים לשלב על ידי איגום רק שברים שהן monodisperse כמו להישפט על ידי ניתוח של שברים על ידי ה- SEC הקרינה טריפטופן (עירור: 280, פליטה: 335 ננומטר). חנות מטוהרת בהלבשה-8B6 מורכב על 4 מעלות צלזיוס עד 1 בשבוע. 10. התגבשות של קומפלקסים נוגדן-Transporter בתלייה זרוק לפני התגבשות, להתרכז שברים השיא מההפרדה SEC של המתחם בהלבשה-8B6 עד 2 מ"ג / מ"ל ​​באמצעות concentrator חלבון צנטריפוגות 100 kDa MWCO. ספיגת של 2 AU ב 280 ננומטר הוא שווה ל 1 מ"ג / מ"ל. הוסף עוד Fab ביחס של 1: 0.05 מורכבים: Fab בחינם. הוסף 10 מיקרומטר S -citalopram בחינם. צנטריפוגה ב 100,000 XG ב 4 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות. איסוף supernatant המכיל את המורכבות בהלבשה-Fab. גלולה מחק. הגדרת מסך 24 גם Drop Hanging על 4 מעלות צלזיוס על פי טבלה 1. לגדול גבישים באיכות עקיפה על פני פתרונות המאגרהמכיל 100 מ"מ טריס-NaOH, pH 8.5, 25 – 125 מ"מ KCl 32.5 – 34% PEG 400, וחומצה 0.5% 6-aminohexanoic. הערה: השתמש טריס מותאם עם NaOH 8.5 pH כחיץ. אין להשתמש טריס בסיס מותאם עם HCl. המסך עשוי להיות מוכן ב 2 צינורות מ"ל ומשומש עד לסיום. תשמור על עצמך כדי פיפטה במדויק PEG 400 בעזרת פיפטה תזוזה חיובית כפי שהוא צמיג מאוד! פיפטה 500 μL של כל פתרון המאגר בצלחת 24 גם פרופיל נמוך עם איטום להחיל כל טוב. 1.5 פיפטה, 1.75, ו -2 μL של המתחם בהלבשה-8B6 תתפס 18 מ"מ לכסות להחליק siliconized זכוכית. פיפטה 1 μL של פתרון מאגר על גבי מדגם החלבון. הערה: הצלחת נרכשת עם איטום כבר מיושם על שפת הבארות. החל להחליק הכיסוי היטב 24 עם טיפות מול הפתרון המאגר לאטום באופן מיידי על ידי תלוש לכסות לחיצה על איטום מראש מיושם היטב כל אחד. המשך עד שכל 24 הבארות הוקמו. </li> השאר את הצלחת המוגמרת בחדר מבודד היטב על 4 מעלות צלזיוס. נא לא להפריע צלחות לפחות 3 ימים הערה: גבישים יחידים יופיעו בתוך כ -3 ימים ולגדול 100-175 מיקרומטר לאחר 14 ימים. גבישי קציר cryoloops בזק-מגניב ישירות בנוזל N 2 לפני איסוף נתונים עקיפים רנטגן. במידת הצורך, למצוא התגבשות תנאים נוספים על ידי הקרנה רחבה עם טיפות תלויות. השתמש שלוש טיפות עם חלבון: יחסים נמהרים של 2: 1, 1.5: 1, 1: 1. אם רובוט זמין, ולאחר מכן להגדיר 100-150 nL טיפות מעל 70 μL של פתרון המאגר בצלחת 96-היטב. גדולים גבישי 3D ניתן לגדל 24 בארות. ציון מבוסס על המראה של ירידה: 0, ברור; 1, אבק; 2, משקע פרטני; 3, הפרדת פאזות; 4, מיקרו; 5, מחטים; 6, צלחות; 7, קריסטלים 3D. הגדרת התגבשות בתליית שיטות ירידת 24 בארות כמתוארות לעיל סביב מנצח זיהה לאחרונהitions.

Representative Results

ספריה של מוטציות נקודה אחת ברקע בהלבשה TC נוצר למסך עבור thermostabilizing מוטציות. מוטציות בודדות שהופקו באמצעות mutagenesis סטנדרטי. פרוטוקול ההקרנה מנצל transfected transiently תאי HEK293S וכן נצנץ קרב מבוסס thermostability מסך במהירות זהות מוטציות שימוש התגבשות כמתוארת באיור 1 א. ערכי Tm שרטוט לעומת הכבול [3 ח] citalopram ב RT חושף בונה עם רמות thermostability והביטוי הגבוהים מתאימות עבור טיהור חלבונים (1B איור). שלושה מוטנטים (Y110A, I291A, ו T439S) אוחדו כדי ליצור מבנה יציב ביותר (תרשים 1C). Thermostability מתואם גם עם יציבות מוגברת שרשרת קצרה דטרגנטים דרושי ההתגבשות של המתחם בהלבשה-Fab. הביטוי בקנה המידה הגדול של בהלבשת אדם באמצעות baculovirus-TRansduced HEK293S GnTI – תאים יכול לקחת פחות מ -2 שבועות והוא יכול לייצר כמויות מיליגרם, כפי שמודגם איור 2 א. השתמש של חלבון ה- GFP-tagged בהלבשה CC מאפשר בהלבשה להיות אחריו בנוחות בזמן ביטוי וטיהור על ידי הקרינה (איור 2 ב). טיהור האסטרטגיה שלנו מעורבת 1) solubilization של בהלבשת כבול S -citalopram מ HEK293S GnTI – תאי C12M בנוכחות CHS בתור שומני ייצוב; 2) עקד בהלבשה למטריצת זיקת סטרפטוקוקוס; 3) הסרת החלבונים מזהמים על ידי שטיפה נרחבת; ו -4) elution של בהלבשה הפונקציונלית עם מאגר המכיל desthiobiotin (איור 2 ג). החלבון eluted ללא תשלום, במידה רבה של חלבונים לזיהוי אחרים על ידי מכתים כחול Coomassie ו monodisperse כמו להישפט על ידי FSEC (איור 2 ד, ה). אסטרטגיה דומה ננקטה לטהר בהלבשה עם תג סטרפטוקוקוס השנייה ששימש reconstitution וחיסון (איור 3 א ', ב'). התאגדות של בהלבשה לתוך proteoliposomes מגבירה את הנסיוב מחצית החיים ויציבות של בהלבשה ומשפרת את הסיכוי של בידוד של נוגדנים גבוהה זיקה. יתר על כן, הכללת שומנים, מרכיב של קיר תא החיידק, משמשת אדג'ובנט חזק 9. ליפוזומים Multilamellar הוכנו על ידי התוספת של חיץ לתערובת שומנים יבש צינורות זכוכית resuspended במאגר. שחול של ליפוזומים דרך מסנני גודל נקבובי 200 ננומטר מייצר השעיות liposomal unilamellar monodisperse. ליפוזומים אז רוויים עם חומר ניקוי ואחריו התוספת של בהלבשה מטוהרת דטרגנט. לבסוף, חומרי הניקוי הוסר על ידי תוספת של שרף קליטה הידרופובי על שומנים: תערובת אבקת כביסה. ליגנד נוסף אמור להתווסף המדגם מחדש כדי לבחור עבור נוגדנים שמזהים את הקונפורמציה כבול נוגדות דיכאון. הנוכחות של בהלבשה ב proteoliposomes חייבת להיות מאושרת על ידיsolubilizing מדגם קטן עם צבע טעינת SDS-PAGE או C12M והפעלה על SDS-PAGE ו FSEC (איור 3 ג, ד). שורות תאי Hybridoma להביע נוגדנים בהלבשה יכולות להיות מוקרנות עבור קלסרים גבוהה זיקה מכירי אפיטופים 3D. מאפיינים אלה הם קריטיים להצלחה הסופית של התגבשות, כמו הנוגדן חייב להישאר כבול בחוזקה לאזור מובנה לקדם אריזת קריסטל של תחומים הומוגנית, מסודרים. בשלב הראשון, נוגדנים אשר מכירים אזורים בלתי מובנים מזוהים. בהלבשה היא מפוגלת ומחתה על קרום nitrocellulose; נוגדנים הנקשרים בהלבשה מפוגלת יהיו מערבי חיובי וסבירים להכיר אפיטופים ליניארי. באיור 4 א, אנו מציגים 2 דוגמאות של נוגדנים אשר מערביים חיוביות וסביר לא שימושיים כדי לקדם crystallogenesis. באיור 4B, הנוגדנים מערביים שליליים הנותרים מודגרת עם 100 ננומטר בהלבשה-GFP והופרדוFSEC. נוגדנים הנקשרים בהלבשה תעבור שיא GFP החיובי לעמדה קודמת. מתחמי בהלבשה-נוגדן ניתן מדולל יותר דטרגנט כדי לקבוע אם הם יכולים לקשור עם זיקה nanomolar ואחריו ניתוח על ידי FSEC. תוספת של תוצאות הסרוטונין שינויי קונפורמציה טרנספורטר ובכך הנוגדנים ניתן rescreened כדי לקבוע אם הם יכולים במיוחד להכיר את הקונפורמציה הנכנסת SSRI. באיור 4C, הנוגדנים מוצגים להיקשר בהלבשה בנוכחות סרוטונין, מראה כי epitope (הים) לא לשנות מן SSRI למצע מדינה נכנסת. לבסוף, באיור 4D שילובים של נוגדנים נבדקים על יכולת להיקשר אפיטופים שונים, דבר שהוביל לשינוי שמאלה נוסף. כאן 15B8 או 8A11 נוגדנים להכיר אפיטופ שונה 8B6. הנוגדן 8B6 נבחר לניתוח מבני נוסף המבוסס על הקרנת גביש ראשונית עם בגיד פפאיןטד Fab. הגנים של Fab 8B6 היו משובטים לתוך וקטור ביטוי התא חרק. Fab ניתן לבטא ומופרשת מתאי Sf9 גוברת השעיה. 8B6 Fab יכול להיות מטוהרים מן supernatant תא Sf9 ידי זיקתו-תג (איור 5 א ', ב') ו כרומטוגרפיה החליפין קטיון (איור 5 ג, ד) וכתוצאה מכך חלבון המופיע ללא מזהמים על ג'לים SDS-PAGE. באיור 5E, את רקומביננטי 8B6 Fab מוצג להיקשר בהלבשה והוא משמש ניסויים ביוכימיים biophysical שלאחר מכן. סמ"ק בהלבשה מטוהר הזיקה מתעכל עם תרומבין EndoH ומעורבב עם 8B6 Fab להקים קומפלקס בנוכחות -citalopram S. מתחם טרנספורטר-נוגדן מופרד ולאחר מכן על ידי ה- SEC ב C8M (איור 6 א) ואת שברי השיא מכילים הוא בהלבשה ו- Fab כפי שמוצג על ידי SDS-PAGE (איור 6). שימוש C8M חיוני היווצרות גבישים כנראה בגללחומר ניקוי השרשרת קצרה מאפשר אריזה טובה יותר בין מולקולות בסריג הגבישי. FSEC מועסק כדי לקבוע אילו שברים צריך להיות ונקווה להתגבשות (איור 6 ג); שברים שאינם monodisperse ו / או מכילים כמויות גדולות של בהלבשה בחינם או Fab לא צריכים להיות משולבים. גבישים בהלבשה-נוגדן בצורת פריזמה ניתן לגדל בנוכחות -citalopram S באמצעות פרוטוקול זה בתלייה דיפוזיה אדי ירידה (איור 7 א). הגבישים וכתוצאה diffract צילומי רנטגן כדי רזולוציה של 3.15 A 10 (איור 7). איור 1: נצנץ סמיך מבוסס Thermostability Assay.. סקירה כללית של פרוטוקול לסינון thermostability בנוכחות [3 ח] citalopram. B. מקסימום כבול [3 </sup> H] citalopram לעומת טמפרטורת ההתכה לכאורה (Tm). קווים מקווקווים מייצגים ערכים עבור טרנספורטר WT. 3 מוטציות thermostable ביותר מסומנים בתוויות. אזור האפור מייצג מוטציות שיש להם פחות מ -10% של [3 ח] citalopram מחייב ביחס WT ובכך ערכי Tm מדויקים עקב אות לרעש נמוך. ג. עקומות Thermostability עבור WT בהלבשת TC ואת מוטנטים 3 העליונים. ברי שגיאה מייצגים סטיית תקן (SD). נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. איור 2: מבט כולל של ביטוי חלבון יונקים Heterologous A.. סקירת Schematized של דור וירוס BacMam וביטוי של בהלבשה ב HEK293S GnTI -. תאי B. הואK293S GnTI – התאים המבטאים את CC בהלבשה (GFP הקרינה) C.. פרופיל Elution של CC בהלבשה על שרף זיקה סטרפטוקוקוס. עקבות ירוקות מייצגות את הריכוז של desthiobiotin, 0 – 100% (0 – 5 מ"מ) D.. ניתוח של CC בהלבשה מטוהר זיקה על 4 – ג'ל 15% SDS-PAGE E.. FSEC של CC בהלבשה מטוהרת זיקה זוהה על ידי קרינת GFP (עירור: 480 ננומטר; פליטה: 510 ננומטר). שיא משחררים ב 15 מיליליטר הוא בהלבשה (#) ו -18 מיליליטר הוא GFP חינם (*). נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. איור 3: נציג זיקת טיהור כינון של בהלבשת IC A.. סקירה סכמטי של דור נוגדן. <strong> B. פרופיל Elution נצפה ב 280 ננומטר של טיהור הזיקה של בהלבשה IC על שרף זיקת סטרפטוקוקוס. עקבות ירוקות מייצגות את הריכוז של desthiobiotin, 0 – 100%. (0 – 5 מ"מ) ג. ניתוח של זיקה מטוהרת ומשוחזר בהלבשה על 4 – ג'ל 15% SDS-PAGE D.. FSEC של בהלבשה solubilized הבאה הכינון מחדש. הקרינה של שאריות טריפטופן שימש לאיתור בהלבשה (עירור: 280 ננומטר; פליטה: 335 ננומטר). נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. איור 4:. ניתוח של נוגדני נציג בהלבשת A. הקרנת נוגדנים על ידי כתם המערבי. כ 1 מיקרוגרם של CC בהלבשה עם או בלי GFP היה מוחל על 4 -% 15 SDS-ג'ל עמוד ומחתה על קרום nitrocellulose. כריכה זוהתה באמצעות נוגדן אנטי עכבר עז מצומדות כדי IR דיי. 2G4 ו 10F2 הוא מערבי חיובי. B. עקדת נוגדנים ל -100 ננומטר-tagged GFP בהלבשה וזיהוי על ידי FSEC זוהה באמצעות הקרינה GFP. C. עקדת Fabs שנבחרו בהלבשה GFP-tagged 100 ננומטר בנוכחות סרוטונין 1 מ"מ. D. עקדת Fabs 8A11 או 15B8 כדי בהלבשה-8B6 Fab. פסגות מינור משחרר ב 18 מיליליטר חופשי GFP. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. איור 5: טיהור נציג של Fab 8B6 מתאי Sf9 A.. פרופיל Elution נצפה ב 280 ננומטר של הטיהור של 8B6 Fab ידי chromatograp זיקת התג שלו HY. עקבות ירוקות מייצגות את הריכוז של imidazole, 0 – 50% (0 – 250 מ"מ) B.. ללא צמצום והפחתת SDS-PAGE ג'ל לאחר טיהור זיקת התג שלו. חלבון אשר פועל ליד 50 kDa הוא Fab הלא מופחת (#) ומינים משניים ב 25 kDa מצטמצם Fab (*). ג. פרופיל Elution נצפה ב 280 ננומטר של הטיהור של 8B6 Fab ידי קטיוני מוצג לשיא סימטרי יחיד אשר elutes תחת שיפוע נתרן כלורי ליניארי. עקבות ירוקות מייצגות את ריכוז NaCl, 0 – 100%. (0 – 500 מ"מ) D. ניתוח של 8B6 Fab על ג'ל 12.5% SDS-PAGE הבאים טיהור ידי קטיוני. E. כריכה של 8B6 Fab 10 ננומטר-tagged GFP בהלבשה, זוהה באמצעות הקרינה של GFP. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. דואר 6 "src =" / files / ftp_upload / 54792 / 54792fig6.jpg "/> איור 6: כרומטוגרפיה סינון נציג ג'ל של קומפלקס בהלבשה-8B6 בנוכחות S -citalopram A.. פרופיל elution סינון ג'ל של מורכבות בהלבשה-8B6 מטוהרים. השיא ראשי משחררים ב 11.5 מיליליטר הוא מורכב בהלבשה-8B6. שיא של 15 – 17 מ"ל מכיל GFP ו- Fab B.. ניתוח של המתחם בהלבשה-8B6 מטוהרים על 4 – ג'ל 15% SDS-PAGE. העמדות של בהלבשה ואת השרשרות הכבדות לאור Fab מוצגות באמצעות מקף. C. FSEC של שברים מופרדים גודל. מתחמים בהלבשה-8B6 התגלו באמצעות קרינת טריפטופן. חלק 17 מכיל כמות גדולה של בהלבשה אשר לא מורכב עם Fab. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. <img alt="איור 7"src = "/ files / ftp_upload / 54792 / 54792fig7.jpg" /> איור 7: התגבשות של קומפלקס בהלבשה-8B6 Bound ל S -citalopram A.. במיקרוסקופ אור גבישים בצורת פאות של המתחם בהלבשה-8B6 לאחר 2 שבועות של צמיחה. סרגל קנה מידה שווה 200 מיקרומטר. B. גבישים בהלבשה-8B6 diffract צילומי רנטגן כדי 3.15 Å. טבעת כחול מייצג 3.15 Å. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. טבלה 1:. מסך התגבשות עבור קומפלקס בהלבשה-8B6 Bound ל S -citalopram אנא לחץ כאן כדי להוריד את הטבלה.

Discussion

קביעת מבנה חלבון הממברנה על ידי טכניקות biophysical נשארת התחייבות מרתיעה עבור מובילים משמעותיים מבחינה רפואית רבים, קולטנים, וערוצי 11. כאן אנו לחלוק את המומחיות מפורטת שפתחה עבור קביעת המבנה של טרנספורטר הסרוטונין אדם כבול S -citalopram. אנו צופים כי שיטות אלו תהיינה שימושיות כדי לקבוע מבנים של בהלבשה במדינות קונפורמציה אחרות, כמו גם מבנים של חלבונים בממברנה קשים אחרים. יתר על כן, הטכניקות ביוכימיות המתוארות כאן יכולות לשמש גם כדי ללמוד לתפקד של בהלבשה מטוהרת דטרגנט וסביבת שומנים כמעט טבעית.

התגבשות בהלבשת צירים על ההתפתחות מספר כלים וטכניקות. ראשית, שיפורים thermostability טרנספורטר הפיק גרסאות בהלבשה שהיו מחונך ב מיצלות חומר ניקוי שונים הבאים החילוץ של טרנספורטר מן הקרומים 6. השימוש שנית,של -citalopram S ליגנד הגבוה זיקה ברחבי טיהור התגבשות יציבות משופרת נוספת וההטרוגניות קונפורמציה המופחתת. שלישית, התפתחות מערכת ביטוי BacMam 7 מותר לייצור כמויות גדולות של בהלבשה בתוך פרק זמן קצר של 2 שבועות, בהנחיית שני חיסונים התגבשות. לבסוף, פיתוח אסטרטגיות כדי לבחור עבור נוגדנים גבוהה זיקת מכירי אפיטופים 3D מותר על הגילוי של הנוגדן 8B6 מקדם וסדורה אריזה של מתחמים בהלבשה-נוגדן לגבישים.

ישנם מספר הצעדים ריאגנטים קריטיים כמו גם בעיות נפוצות אשר לעתים קרובות להתרחש לאורך כל הפרוטוקול. ראשית, הדור של וירוס בהלבשה P2 כייל גבוה יכול להיות בעייתי. הוספת ריכוזים נמוכים של וירוס P1 כדי ליצור וירוס P2 כמתואר בפרוטוקול זה בדרך כלל מפחית את הבעיה הזו, ובמקרים בהם כייל P2 וירוס הוא נמוך, וירוס P3 יכול להתבצע usinוירוס גרם ב משרד הפנים של 0.0001. וירוסים עם כייל פחות מ -1 x 10 8 חלקיקי נגיף / מ"ל לא אמור לשמש ויהיה כמעט תמיד לגרום תשואות חלבון נמוכה. עבור ביטוי, HEK293S GnTI – תאים נבחרו משום שהם חסרי N -acetylglucosaminyltransferase שאני פעילות ועל כן אינו יכול לסנתז -glycans N המורכב, במקום לייצר -glycans מנוז N הגבוה בלבד. EndoH מסלקת N -linked glycosylation של גליקנים מנוז גבוהים בשני אתרי לולאה תאית 2 (EL2), עוזב N -acetylglucosamine המצורפת asparagine. עיכול של N -linked סוכרים מפחית האנטרופיה פני EL2 וזה חשוב סביר להתגבשות. עבור הדור של נוגדנים, IC בהלבשה אמור לשמש עבור חיסון. GFP מאוד immunogenic 12 ולא אמור לשמש כתווית היתוך לייצר נוגדנים משום שקשה להסיר לחלוטין על ידי ה- SEC. N- הגמיש C- הסופי של בהלבשה היה גם לאנכלל לבנות כדי למנוע נוגדנים נגד אזורים אלה. עכברים יכולים להתחסן עם 30 מיקרוגרם של חלבון מחדש; להמשיך עכברים מחסנים עד ניתן לאתר ומייצר hybridoma תאים כמתוארים 13 ריכוזי נוגדנים בסרום גבוה. בונת thermostabilized היא בדרך כלל הבחירה הטובה ביותר עבור חיסון; אם טרנספורטר הוא ומחונך ושומרת פעילות ביולוגית הבאים טיהור, זה הוא לעתים קרובות מספיק כדי להעלות נוגדנים. הנוגדן 8B6 הועלה נגד WT בהלבשה. עבור התגבשות, רק שברי השיא מ SEC המכילים קומפלקס monodisperse כמו להישפט על ידי FSEC צריכים להיות משולבים ומרוכז. גבישים בהלבשה-8B6 לגדול בטווח צר של תנאים ויש מספר צעדים שיש לנקוט כדי לפתור בעיות הקשורות ספציפי צמיחת קריסטל בהלבשה. טריס בסיס מותאם עם HCl לא אמור לשמש בפתרון המאגר, מאז חיץ זה אינו תומך צמיחה קריסטל; זה ובכך CRIזהה לזו במקום להשתמש טריס מותאם עם NaOH. גבישים בהלבשה לגדול במגוון ריכוז צר של PEG 400, כך שאם גבישים לא גדלים או אם גבישים קטנים רבים הם נצפו, אפילו עלייה קלה או ירידה בריכוזיות PEG 400 תהיה מומלצת. יתר על כן, חומצה 6-aminohexanoic כתוסף שימשה גם המסך מותאם לשפר התגרענות. יחס הירידה של חלבון: פתרון טוב הוא גם מפתח בקביעת גורם לצמיחת קריסטל. זרוק יחסי של 1.5 – 2: 1 מומלץ, עם יחס טיפה קרוב יותר ל -2: 1 בדרך כלל ומעודד את המשך צמיחת גבישים 3 ממדים גדולים. לבסוף, השימוש 24 גם צלחות פרופיל נמוך הוא גם משמעותי שיוכל להוביל לצמיחה קריסטל, ככל הנראה בשל שינוי של קצב דיפוזיה אדי.

גישה חלופית לשיטת SPA פותחה למסך עבור מוטנטים אשר לייצב את טרנספורטר הסרוטונין עכברוש קונפורמציה קוקאין הנכנס באמצעות מסנן מחייב assay 5. לעומת זאת, ba SPAassay SED מאפשר צעדי חימום רציפים הבאים על ידי קביעת החלק היחסית של בהלבשה אשר נשאר קשור ליגנד. לכן, זה מאפשר הקביעה המהירה של טמפרטורת ההתכה ממספר קטן של דגימות. שיטת SPA מסתמכת על הזמינות של ליגנד גבוהה זיקת radiolabeled ואם לא הליגנדים ידועים אשר לאגד עם זיקת submicromolar אז גישה חלופית תהיה צורך. רבי שיטות אחרות משמשות למדידת יציבות חלבון כגון עקידת צבעי ניאון ו calorimetry 14 אבל הם תפוקה נמוכה והם מסוגלים גם כדי למדוד את התפקוד ישירות או דורשים כמויות גדולות של חלבון. אם שיטת SPA לא ניתן להשתמש, אחד גישת תפוקה גבוהה וחלופה היא Assay FSEC המבוססת Thermostability 15 (FSEC-TS), שבו המדגם מחומם ואחריו הפריד את החלק היחסי של יתרת טרנספורטר. FSEC-TS היא גישה שימושית לצורך גישת התנהגות chromatographic ומדינת oligomeric והוא apכלי משלים owerful אשר יכול לשמש לצד שיטת SPA.

השוואת מערכות ביטוי חלבון שונות הנפוצים נמצאה גם להעדיף את השימוש בתאי יונקים לביטוי בהלבשה 16 ובאופן לא מפתיע זה עשוי המקרה עבור חלבונים רבים ממוצא יונק. השיטות אשר השתמשנו לביטוי נתפרו במיוחד בהלבשה אך סביר בקלות להתאמה. תנאים אשר מעדיפים רמות גבוהות של ביטוי יש לזהות בקפידה על ידי שינוי זמן ביטוי, טמפרטורה, ריכוז וירוס, ונוכחות של מעכבי deacetylase היסטון כגון בוטיראט נתרן.

בדרך כלל אנחנו מעדיפים טיהור זיקת חומר ניקוי ארוכת שרשרת קלה כגון C12M יחד עם CHS לפני הכינון לשמור ליגנד גבוהה זיקה מחייבת. כינון באמצעות קליטת הידרופובי הוא טכניקה קלה שמצאנו כיעיל במשך כמה מובילי קולטנים אחרים. אם זההוא לא מוצלח, הסרת דטרגנטים עם ריכוזי micelle ביקורתיים גבוהים על ידי דיאליזה, דילול, או SEC יכולה להיות מועסקת 17 ספקו את אנטיגן היא יציבה מספיק בדטרגנטים כאלה. במקרים בהם לא נוגדנים מתאימים נמצאים, אנחנו כמעט תמיד מצא את הבעיה נובעת אובדן תפקוד או denaturation של אנטיגן ובמקרים כאלה בהצלחה ביצענו חיסונים חדשים תשומת לב מיוחדת ביוכימיה חלבון. לבסוף, הליגנדים ונוגדנים אשר לאגד עם זיקה גבוהה צריכים להוות את הבסיס עבור ניסוי התגבשות מתוכננת בצורה רציונלית על ידי ניצול של גרסת thermostable, אפשר להקרין מגוון רחב של תנאים על ידי שינוי המאפיינים של דטרגנטים שונים. יתר על כן, התגבשות בתוך mesophase lipidic 18 או באמצעות bicelles 19 תמיד צריך להיחשב כאלטרנטיבה התגבשות מיצלות.

מנהלי שיטות אלה יכולים לשמש עם כמה modifiקטיון עבור חלבון טראנסממברנלי רב אחר אשר קשה לבטא ולטהר ממארחי ביטוי אחרים, ויהיה שימושי במיוחד עבור קביעת המבנה של מטרות של תרופות גבוהה זיקה.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We thank D. Cawley for generating monoclonal antibodies. We thank A. Penmatsa and K. Wang for sharing ideas and expertise developed from the dopamine transporter. L. Vaskalis for assistance with figures, H. Owen for help with manuscript preparation and other Gouaux laboratory members for helpful discussions. J.A.C. has support from a Banting postdoctoral fellowship from the Canadian Institutes of Health Research. E.M.G. is supported by the National Science Foundation Graduate Research Fellowship. We are particularly grateful to Bernie and Jennifer LaCroute for their generous support, as well as for funding from the NIH (5R37MH070039). E.G. is an investigator of the Howard Hughes Medical Institute.

Materials

DH10Bac Invitrogen 10361-012
Kanamycin Fisher BP906-5
Gentamicin Fisher BP918-1
Tetracycline Sigma T-7660
Bluo-gal Invitrogen 15519-028 5-Bromo-3-indolyl β-D-galactopyranoside
IPTG Anatrace I1003
Miniprep kit Qiagen 27106
Cellfectin II Invitrogen 10362-100 Sf9 transfection reagent
SF9 ATCC CRL-1711
Sf-900 III SFM media Life Technologies 12658-027
HEK-293S GnTI- ATCC CRL-3022
Freestyle 293 media Life Technologies 12338-018 293 expression media
Fetal bovine serum Life Technologies 0984018DJ
Sodium butyrate Sigma 303410
S-citalopram Sigma E4786 Anagrade
n-Dodecyl-?-D-Maltopyranoside Anatrace D310
Cholesteryl hemmisuccinate Sigma C6013
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Avanti Polar Lipids 850457P
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine Avanti Polar Lipids 850757P
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoglycerol Avanti Polar Lipids 840457P
Leupeptin Sigma L2884
Pepstatin A Sigma P5318
Aprotinin Sigma A1153
PMSF Sigma P7626
Desthiobiotin Iba Life Sciences 2-1000-05
Asolectin Sigma 11145
Cholesterol Sigma C-8667
Lipid A Sigma L5399
Brain polar lipid Avanti Polar Lipids 141101C
Biobeads Biorad 152-3920 Hydrophobic absorption resin
Goat anti-mouse IRDye 680RD Odyssey 926-68070 Used as secondary for western blotting
Lauryl maltose neopentyl glycol Anatrace NG310 Anagrade
Serotonin Sigma H9523
pFastBac 8B6 Available from authors
pEG Bacmam SERT Strep II SERTIC, Available from authors
pEG Bacmam SERT GFP twin Strep His SERTTC, Available from authors
pEG Bacmam SERT ts3 GFP twin Strep His SERTCC, Available from authors
Imidazole Sigma 56749
n-Octyl β-D-maltoside Anatrace O310 Anagrade
Thrombin Haematologic Technologies HCT-0020
EndoH New England Biolabs P0702
Trizma-HCl Sigma T5941 Tris used for preparation of crystallization reservoirs
PEG 400 Sigma 91893
6-aminohexanoic acid Sigma 7260
Trypsin-EDTA Fisher MT25052CV
Isoplate-96 TC PerkinElmer 6005070
PolyJet SignaGen SL100688 Polymer transfection reagent for mamalian cells
Copper HIS-Tag YSI SPA Beads PerkinElmer RPNQ0096 His-tag affinity SPA beads
Citalopram, [N-Methyl-3H] PerkinElmer NET1039250UC
ThermoMixer C Eppendorf 5382000023 heating block for thermostability assay
ThermoTop Eppendorf 5308000003
SmartBlock PCR 96, thermoblock for PCR plates Eppendorf 5306000006
0.2 µm syringe filter Olympus Plastics 25-243
1 L filter system Corning 430517
2 L flat bottom tissue culture flask Genemate F-5909-2000
2 L baffled tissue culture flask Genemate F-5909-2000B
CO2 incubator Thermo Scientific 3950
Forma Orbital Shaker Thermo Scientific 416
Strep-Tactin resin Iba Life Sciences 2-1208-025 Strep affinity resin
Extruder Northern Lipids
Li-Cor imaging system Odyssey western blot imaging system
XK16 column GE Healthcare 28-9889-37 column used for Strep-Tactin and Talon purificaiton
100 kDa MWCO protein concentrator Millipore UFC910096
30 kDa MWCO protein concentrator Millipore UFC903024
Äkta FPLC GE Healthcare UPC-900
HPLC Shimadzu 51476
Superose 6 (10/300) column GE Healthcare 17-5172-01 Used for FSEC
Tangential flow apparatus Pall Filtron
0.2 µm filter tangential flow cell Pall Filtron PSM20C11
30 kDa MWCO tangential flow concentrator Pall Filtron OS030T12
Talon resin Clonetech 635504 His-tag affinity resin used for Fab purification
1 ml HiTrap SP column GE Healthcare 17115101 Cation exchanger used for Fab purification
Superdex 200 10/300 GL column GE Healthcare 17-5175-01 Used for SEC separation of SERT-8B6
24-well VDXm plate Hampton Research HR3-306
18 mm coverslips Hampton Research HR3-239
Virocyt virus counter Virocyt 2100
MicroBeta Trilux PerkinElmer 1450 96-well scintillation counter
HiTrap SP column GE Healthcare 17115101
Sertraline Sigma S6319
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kristensen, A. S., et al. SLC6 neurotransmitter transporters: structure, function, and regulation. Pharmacol Rev. 63 (3), 585-640 (2011).
  2. Broer, S., Gether, U. The solute carrier 6 family of transporters. Br J Pharmacol. 167 (2), 256-278 (2012).
  3. Andersen, J., Kristensen, A. S., Bang-Andersen, B., Stromgaard, K. Recent advances in the understanding of the interaction of antidepressant drugs with serotonin and norepinephrine transporters. Chem Commun (Camb). 25 (25), 3677-3692 (2009).
  4. Hahn, M. K., Blakely, R. D. The functional impact of SLC6 transporter genetic variation. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 47, 401-441 (2007).
  5. Abdul-Hussein, S., Andrell, J., Tate, C. G. Thermostabilisation of the serotonin transporter in a cocaine-bound conformation. J Mol Biol. 425 (12), 2198-2207 (2013).
  6. Green, E. M., Coleman, J. A., Gouaux, E. Thermostabilization of the human serotonin transporter in an antidepressant-Bound Conformation. Plos One. 10 (12), e0145688 (2015).
  7. Goehring, A., et al. Screening and large-scale expression of membrane proteins in mammalian cells for structural studies. Nat Protoc. 9 (11), 2574-2585 (2014).
  8. Kawate, T., Gouaux, E. Fluorescence-detection size-exclusion chromatography for precrystallization screening of integral membrane proteins. Structure. 14 (4), 673-681 (2006).
  9. De Becker, G., et al. The adjuvant monophosphoryl lipid A increases the function of antigen-presenting cells. Int Immunol. 12 (6), 807-815 (2000).
  10. Coleman, J. A., Green, E. M., Gouaux, E. X-ray structures and mechanism of the human serotonin transporter. Nature. , (2016).
  11. White, S. H. The progress of membrane protein structure determination. Protein Sci. 13 (7), 1948-1949 (2004).
  12. Gambotto, A., et al. Immunogenicity of enhanced green fluorescent protein (EGFP) in BALB/c mice: identification of an H2-Kd-restricted CTL epitope. Gene Ther. 7 (23), 2036-2040 (2000).
  13. Galfre, G., Howe, S. C., Milstein, C., Butcher, G. W., Howard, J. C. Antibodies to major histocompatibility antigens produced by hybrid cell lines. Nature. 266 (5602), 550-552 (1977).
  14. Deller, M. C., Kong, L., Rupp, B. Protein stability: a crystallographer’s perspective. Acta Crystallogr F Struct Biol Commun. 72, 72-95 (2016).
  15. Hattori, M., Hibbs, R. E., Gouaux, E. A fluorescence-detection size-exclusion chromatography-based thermostability assay for membrane protein precrystallization screening. Structure. 20 (8), 1293-1299 (2012).
  16. Tate, C. G., et al. Comparison of seven different heterologous protein expression systems for the production of the serotonin transporter. Biochim Biophys Acta. 1610 (1), 141-153 (2003).
  17. Rigaud, J. L., Levy, D. Reconstitution of membrane proteins into liposomes. Methods Enzymol. 372, 65-86 (2003).
  18. Caffrey, M., Cherezov, V. Crystallizing membrane proteins using lipidic mesophases. Nat Protoc. 4 (5), 706-731 (2009).
  19. Faham, S., Bowie, J. U. Bicelle crystallization: a new method for crystallizing membrane proteins yields a monomeric bacteriorhodopsin structure. J Mol Biol. 316 (1), 1-6 (2002).

Tags

Serotonin TransporterS-citalopramThermostabilizationExpressionPurificationCrystallizationMembrane ProteinsDrug TargetsNeurotransmitter TransportersReceptorsChannelsSoluble ProteinsHEK293S GnTIDNA TransfectionCitalopramC12MCHSProtease InhibitorsTritiated CitalopramBSAHis-tag AffinitySPA BeadsSertraline

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Coleman, J. A., Green, E. M., Gouaux, E. Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram. J. Vis. Exp. (117), e54792, doi:10.3791/54792 (2016).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image