Термостабилизации, Expression, очистки и кристаллизации Серотонин Transporter человека Обязанный<em> S</em> -citalopram

1. Трансфекция Приверженец HEK293S GnTI – Клетки для термостабильность экрана Подготовка поли-D-лизином (PDL) -покрытие 96-луночные планшеты. Выполнить все работы в стерильном ламинарном потоке. Фильтр 25 мкг / мл раствора (PDL), молекулярный вес 70,000-150,000 Da, используя стерильный фильтр 0,2 мкм. Добавьте 50 мкл PDL в каждую лунку 96-луночного планшета культуры ткани (TC) пластины, обеспечивая дно равномерно покрыты, и инкубируют при комнатной температуре в течение 30 мин. Раствор Аспирируйте PDL и промывают 200 мкл стерильной воды. Разрешить пластины высохнуть на воздухе в течение 2 ч до хранения при 4 ° С. PDL пластины с покрытием можно хранить при температуре 4 ° С в течение нескольких недель. Трипсином адгезивных HEK293S клеток. Grow HEK293S до 80% сплошности в 10 см чашку выдерживали при 37 ° С с 8% CO 2. Один 10 см блюдо должно иметь приблизительно 10 миллионов HEK293S клеток. Не используйте клетки после 30-го пассажа! </lя> Вытяжку носители и промывают 5 мл фосфатно-буферном солевом растворе (PBS). Добавить 1 мл раствора трипсина-ЭДТА (0,25% трипсина, 0,02% ЭДТА) к клеткам и инкубируют в течение 2 мин при 37 ° С. Добавить 10 мл раствора Дульбекко в модификации Дульбекко (DMEM), дополненной 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) и ресуспендирования клеток путем многократного пипетированием вверх и вниз с помощью серологической пипетки. Пипетка 10 мкл клеток и смешивают с 10 мкл раствора трипанового синего (0,4%). Определение плотности клеток с помощью гемоцитометра и светового микроскопа. Не рассчитывайте клетки, которые окрашен в голубой цвет, как они мертвы. Убедитесь, что жизнеспособность клеток превышает 90%. Тщательно Ресуспендируют трипсином HEK293S GnTI – клеток в среде DMEM с добавлением 10% FBS , дополненной до плотности 0,5 × 10 6 клеток / мл в Пипеткой резервуаре. Приблизительно 5 миллионов HEK293S клетки будут необходимы для каждой пластины. В общей сложности 24 конструкции могут быть трансфицированы на каждой пластине с помощью этой прotocol. С помощью многоканальной пипетки, добавьте 100 мкл клеток в каждую лунку планшета PDL покрытием. Ресуспендируют клеток в пипетку резервуаре после заполнения каждой пластины, чтобы обеспечить равномерное распределение клеток. Инкубируйте клетки в 37 ° C инкубаторе с 8% СО 2. Через 24 ч клетки, должны достигать примерно 80% сплошности. 1 ч до трансфекции замены носителя. Готовят комплексы реагента ДНК-трансфекции для трансфекции. Для каждой конструкции в фоновом режиме СЕРТ TC , чтобы быть подвергнуты скринингу, смешайте 450 нг ДНК с 45 мкл не содержащей сыворотки DMEM и перемешать. Добавить 1,6 мкл реагента для трансфекции в 45 мкл не содержащей сыворотки DMEM и перемешать. Немедленно добавьте разбавленный раствор реагента для трансфекции ДНК-раствора и перемешать. Не следует смешивать растворы в обратном порядке. Подождите 10 – 15 мин и добавляют 20 мкл трансфекции смеси реагентов / ДНК 4 лунок. После того, как все скважины были трансфицированы, смешайте пластину осторожно покачайте часть спинкие вперед и вернуться к 37 ° С инкубатор. После 16 – 24 ч заменить носитель с DMEM, содержащей сыворотку и 10 мМ бутирата натрия. Приблизительно через 48 часов после трансфекции удалить носитель и либо сразу приступить к термостабильности экрана или заморозить клетки при -80 ° C, которые будут использоваться в дальнейшем. Клетки можно хранить при температуре -80 ° С в течение нескольких недель. 2. Сцинтилляционный Proximity на основе термостабильность экран с S -citalopram Инкубируйте клетки с 200 нМ S -citalopram в 25 мкл TBS (трис – буферном солевом растворе – 20 мМ Трис, рН 8, 100 мМ NaCl) в течение 5 мин при комнатной температуре. Солюбилизации клеток путем добавления 25 мкл 8 мМ н-додецил-бета-D-maltopyranoside (C12M), 1 мМ холестериновый hemmisuccinate (CHS), ингибиторов протеаз (2 мМ фенилметансульфонилфторид (ФМСФ), 0,1 мг / мл апротинина, 4 г / мл пепстатина а, и 4 мкг / мл лейпептина) в TBS, и инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре. Добавить 50 мкл TBS Wiй 20 нМ [3 H] циталопрам (81,7 Ки / ммоль), 0,1% бычьего сывороточного альбумина, и 2 мг / мл His-метка для анализа сродства сцинтилляционной близости (SPA) бусинки на три лунки для каждой конструкции. Для последнего также добавить такое же решение перечисленных, а дополняют 100 мкМ сертралина для определения неспецифического связывания. Убедитесь, что His-Tag сродством SPA бусин тщательно перемешивают при добавлении к 96-луночного планшета. Мера [3 H] циталопрам связывания с использованием 96-луночного сцинтилляционный счетчик при комнатной температуре с 1 мин Время счета на лунку. Продолжить подсчет пластин до суммарного количества не плато (примерно через 36 часов). Тепловые пластины в течение 15 мин в нагревательном блоке с нагретой крышкой при 33 ° C. Мера [3 Н] циталопрам связывание снова после нагрева , как это описано в разделе 2.4. Повторите шаг 2,4 – 2,5 и изменить стадию нагревания до 36 ° C, 39 ° C, 45 ° C, 48 ° C и 51 ° C. Регулировать нагрев температуры в зависимости от температуры плавления кажущийся (Гт)белка-мишени и термостабильности наиболее стабильной конструкции. Продолжайте нагревать пластины, пока все конструкции не имеют низкие удельные счетчики. Анализ данных для определения значений Tm. Определить среднее значение общего счета в минуту (CPM) каждого из них построить для скважин, которые не содержат сертралин путем усреднения 3 дублирующие скважин. Определить неспецифическую CPM путем усреднения CPM каждой лунки, содержащей сертралин в одной тарелке. Рассчитать удельную CPM путем вычитания неспецифического CPM от общей CPM. Вычислить Tm по нелинейной подгонки к сигмоидальной функции Больцмана. Конструкты с низким удельным CPM при комнатной температуре (<10% от WT) , как правило , не имеют точных значений Tm. Мутации от наиболее термостойких конструкции могут быть объединены вместе и подвергают скринингу на аддитивных увеличение термостойкости. 3. Выражение Transporter Человека Серотонин в HEK293S GnTI <suр> – клетки Transform химически компетентных клеток DH10Bac с 1 нг плазмиды. Добавить плазмиды к 50 мкл клеток DH10Bac и инкубировать на льду в течение 30 мин. Теплового шока DH10Bac клетки при 42 ° С в течение 30 сек. Добавить 200 мкл SOC среды и инкубируют при температуре 37 ° С в течение 4 часов при встряхивании. Тарелка все бактерии на более Лурии Бульон (LB), пластину, содержащую 50 мкг / мл канамицина, 7 мкг / мл гентамицина, 10 мкг / мл тетрациклина, 100 мкг / мл 5-бром-3-индолил бета-D-галактопиранозида, и 40 мкг / мл изопропил- β-D-1-тиогалактопиранозида (IPTG). Изолировать LacZ – колонии (белые колонии) , выращенные при 37 ° С в течение 2 дней на чашках с LB. Вырастить несколько колоний O / N при 37 ° С в 5 мл LB, содержащих антибиотики и изолировать Бакмидную ДНК. Спин вниз бактерии при 1000 мкг в центрифуге в течение 5 мин. Удалите супернатант. Ресуспендируют бактерии с 200 мкл минипрепаративную гesuspension буфера. Лизировать бактерии путем добавления 200 мкл буфера для лизиса минипрепаративную и переворачивая трубку осторожно 10 раз. Добавьте 200 мкл нейтрализующего буфера. Удалить нерастворимой фракции центрифугированием при 14000 х г в течение 10 мин в центрифуге. Добавить 1 мл изопропанола, супернатант и прохлады при температуре от -20 & deg; С в течение 20 мин, чтобы осадить ДНК. Спин при 14000 мкг в течение 15 мин в центрифуге и отбросить супернатант. Промыть ДНК гранул с 70% этанола и снова вращаются со скоростью 14.000 х г в течение 15 мин. Удалите супернатант. Воздух сухой ДНК пока все этанола испарилась и ресуспендируют в 50 мкл воды. Примечание: Бакмидную ДНК должна быть трансфицированы в клетки Sf9 сразу для достижения наилучших результатов, но и может храниться при температуре от -20 & deg; C в течение нескольких недель. Трансфекцию Бакмидную ДНК в 1х10 6 клеток адгезивных Sf9 , выращенных в увлажненной камере при 27 ° С в чашке 6-луночного. Выполните все манипуляции культивирования клеток в стерильном ламинарном потоке. <литий> Удалить носитель из клеток и добавляют 2 мл свежей среды, Sf9. Добавить 5 мкг Бакмидную ДНК к 100 мкл сред Sf9 (раствор А). Добавить 8 мкл реагента для трансфекции sF9 катионного липида к 100 мкл сред Sf9 (раствор Б). Инкубируйте пробирку, содержащую раствор B в течение 5 мин. Смешать пробирку, содержащую Раствор А с раствором Б и инкубируют при комнатной температуре в течение 30 мин и добавляют весь раствор в клетки Sf9. Через 96 ч, урожай супернатант (вирус P1) путем пропускания через фильтр с размером пор 0,2 мкм. Вирус Р1 может храниться в течение нескольких месяцев при температуре 4 ° С в темноте и использоваться повторно, чтобы сделать вирус P2 по мере необходимости. Добавить 100 мкл вируса от Р1 до 1 л клеток Sf9 при плотности 1 х 10 6 клеток / мл в Sf9 средах. Инфицировать клетки в течение 96 ч, растет при 27 ° С на качалке при 100 оборотах в минуту. Спин вниз клетки в центрифуге при 4000 х г в течение 15 мин и супернатант, содержащий фильтровальную вирусные частицы через фильтр с размером пор 0,2 мкм. Выбросите осадок клеток. Determине вирусной плотности с использованием вирусного анализа бляшек или счетчик вирусов. Плотность вируса должна быть> 1 × 10 8 вирусных частиц на миллилитр. Вирус P2 можно хранить при температуре 4 ° С в темноте и использоваться в течение нескольких месяцев. Infect 10 л HEK293S GnTI – клетки 7 , выращиваемых в суспензии при 37 ° С с 8% CO 2 и 85% влажности на качалке при 130 оборотах в минуту в 293 экспрессирующих среде с 2% FBS при множественности инфекции (MOI) 2 и плотностью 3 × 10 6 клеток / мл, как правило , 30 – 50 мл вируса P2 на 800 мл клеток в 2 л колбе с перегородками. Примечание: Не рекомендуется использовать более чем 80 мл вируса P2 , так как HEK293S GnTI – клетки будут расти медленно и может стать нежизнеспособным из – за изменения рН. Sf9 СМИ более кислый, чем 293 Expression Media. 12 – 16 ч после заражения, добавить бутират натрия до концентрации 10 мМ с 1 М запас. 48 – 60 ч после заражения, урожай клетки центрифугированием при4000 мкг в течение 15 мин. Удалить супернатант. Не Ресуспендируют клеток в 150 мл TBS, 2 мкМ S -citalopram или другие ингибиторы SERT и хранят при -80 ° С до готовности для очистки. 4. Affinity Очистка переносчика серотонина для иммунизации и кристаллизацией Оттепель клетки от 10 л культуры в теплой воде (примерно 30 ° C) и ресуспендируют путем быстро не проходящие сквозь 10 мл пипеткой до однородного состояния. Готовят раствор моющего средства для солюбилизации (150 мл): 80 мМ Трис, рН 8, 150 мМ NaCl, содержащего 40 мМ C12M, 5 мМ CHS, и ингибиторов протеаз. Добавить все клетки в химический стакан с мешалкой и добавить весь раствор моющего средства к клеткам при перемешивании. Солюбилизации при температуре 4 ° С в течение 1 ч при перемешивании. Спин лизата при 8000 х г в течение 15 мин при температуре 4 ° С. Откажитесь гранулы и декантируйте супернатант в чистую Ультрацентрифуга труб. Спин при 100000 мкг в течение 1 ч в ultracentrifuge. Выбросите осадок и фильтр супернатанта через фильтр с размером пор 0,2 мкм. Pass лизат в течение 10 мл стрептококкового сродства смолы помещенной в колонку с помощью перистальтического насоса , уравновешенной буфером для промывки: 1 мМ C12M, 0,2 мМ CHS, 5% глицерина, 25 мкМ липидный (1-пальмитоил-2-oleoyl- зп глицеро 3-фосфохолин, 1-пальмитоил-2-oleoyl- зп глицеро-3-фосфоэтаноламин, и 1-пальмитоил-2-oleoyl- зп глицеро-3-phosphoglycerol при мольном соотношении 1: 1: 1), и 1 S мкМ -citalopram или SSRI в TBS. Подключение Strep аффинной колонки к хроматографии (FPLC) жидкостной системы быстрого белка и промыть колонку со скоростью 2 мл / мин с 66 мл (объемы 6,6 колонка) промывочного буфера. Элюировать очищенный белок в то же буфере с добавлением 5 мМ desthiobiotin со скоростью 0,5 мл / мин с использованием 33 мл (объемы 3,3 столбцов) буфера. Собрать 1 мл фракции; Фракции пика будет ~ 10 мл. Очищенный белок можно хранить при температуре 4 ° С в течение 2 – 3 дней, если это необходимо. Примечание: Общий выход будет 3 -4 мг SERT CC и 1 мг SERT IC. Абсорбция 2 AU при 280 нм, равна 1 мг / мл SERT. 5. Воссоздание Transporter в липосомы для иммунизации Приготовьте липосом, содержащих asolectin: холестерин: липид А: мозга полярный липидный (мольное отношение 60: 17: 3: 20). Растворите липиды в 1 мл хлороформа и добавляют 40 мг общего липида до 100 мл стеклянную круглодонную колбу на указанном молярном соотношении. Выпаривают хлороформа в течение не менее 1 ч в вакууме при круглодонную колбу вращается в теплой воде, примерно 30 ° C. Увлажняет липиды путем добавления 10 мл TBS. Выдержите в буфере в течение 10 мин. Замораживание липида, помещая колбу в жидком N 2. Оттепель. Погрузитесь сферическое дно колбы в стакан с теплой водой, примерно 30 ° C. Разрушать ультразвуком в ванне для обработки ультразвуком в течение 5 мин. Вихревые и повторить шаги 5.1.3 – 5.1.4 10 раз или до липидаполностью ресуспендировали из нижней части и образует мутной суспензии. Выдавливание всю липидную смесь дважды через 200 нм фильтров. Липидный появится в виде суспензии молочного цвета до экструзии; после этого она будет полупрозрачной. Не следует добавлять всю липидную смесь в экструдер сразу, так как он может засориться, что приводит к потере образца. Спин липидов при 100000 х г в течение 20 мин и ресуспендируют в 0,5 – 1 мл TBS при концентрации 40 мг / мл. Концентрат очищенный Sert : IC 250 – 500 мкл с использованием белка концентраторы 100 кДа MWCO центрифуге 2 – 4 мг / мл и насыщают липосом с 5 мМ C12M. Добавить очищенный SERT с моющим средством: липидной смеси в 1 мл конечного объема. Удалить C12M с помощью 3-х последовательных добавлений 80 мг / мл гидрофобный абсорбционной смолой. В течение первых 2-х добавлений, инкубировать смолой с вращением в течение 2 ч при 4 ° С. Удалить смолу путем пропускания через стекловату. Выполните окончательную инкубации с смолойс ночевкой. Концентрат Протеолипосомы центрифугированием при 100000 х г в течение 20 мин. Удалите супернатант и ресуспендируют осадок в 250 – 500 мкл TBS. Добавляют 10 мкМ конечную концентрацию S -citalopram в разведенном белка после окончательного удаления смолы. Солюбилизации 2,5 мкл протеолипосомах в ДСН-ПААГ-загрузочном буфере (62,5 мМ Трис, рН 6,8, 10% глицерина, 2% ДСН, 0,01% бромфенолового синего, 100 мМ DTT), и работать на геле SDS-PAGE при 200 В в течение 1 ч, чтобы гарантировать, что SERT был успешно восстановлен. Протеолипосомы можно хранить при температуре -80 ° С в виде аликвот при длительном хранении и оттаивали на льду до каждой иммунизации. 6. Скрининг антител, распознающих эпитопы 3D Экран гибридомных клеточных линий с помощью Вестерн-блоттинга. Антитела, которые распознают SERT с помощью Вестерн-блоттинга, вероятно, связывать линейные эпитопы и, вероятно, не будет полезным для структурных исследований. Смешайте 1 мкг purifiред SERT IC или SERT CC и работать на 4 с – 15% -ном SDS-PAGE при 200 V в течение 1 ч. Передача на нитроцеллюлозную мембрану при 200 мА в течение 30 мин с использованием буфера Towbin (25 мМ Трис, 192 мМ глицина, 20% (об / об) метанол, 0,1% SDS). Мембрану можно сушить и хранить неопределенно долго при комнатной температуре. Повторное смачивание мембрана с 10% метанола и промывают PBS (10 мМ фосфата, рН 7,4, 137 мМ NaCl, 2,7 мМ КСl). Блок с 5% сухого молока в PBS в течение 30 мин при комнатной температуре. Промывают ЗФР и инкубируют с 1 мкг / мл антитела в PBS с 0,1% молока. Промыть экстенсивно с PBS, содержащим 0,1% Tween-20. Инкубируйте с антителом козы к антигенам мыши, конъюгированным с ИК-краситель разводили 1: 10000 в PBS с 0,1% твина 20 и 0,1% молока. Вымойте экстенсивно и сканирование с использованием системы визуализации. Смешайте супернатанта гибридомы , содержащий западные отрицательные антитела с 100 нМ СЕРТ CC белка , используя молярное соотношение 1: 2 (SERТ: МАБ) в 200 мкл TBS с 1 мМ C12M, 0,2 мМ CHS и 1 мкМ S -citalopram. Центрифуга при 100000 х г в течение 20 мин. Анализ супернатанта , содержащего SERT-мАт комплексы и анализируют с помощью флуоресцентной обнаружения вытеснительной хроматографии (фс) 8. Выбросите осадок. Выполнить по 100 мкл супернатанта на колонку вытеснительной при 0,5 мл / мин с использованием системы высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), снабженном флуоресцентным детектором (раздражений: 480 нм, эмиссия: 510 нм) с использованием рабочего буфера, содержащего TBS, 0,4 мМ лаурил мальтозу неопентилгликоль и 1 мкМ S -citalopram. Антитела, которые образуют комплексы заставит GFP-слитый белок, который элюируетс раньше, чем свободный транспортером из колонки вытеснительной. Развести комплексов до 10, 1, 0,1 нМ в 200 мкл TBS с 1 мМ C12M, 0,2 мМ CHS и 1 мкМ S -citalopram и запускать ФКЦБ. Антитела, которые до сих пор можно сдвинуть пик транспортеров при низких концентрациях наномолярными являютсявысокие вяжущие сродства и хорошими кандидатами для структурных исследований. Retest связывание ФКЦБ в присутствии 1 мМ серотонина. Антитела, которые специфически распознают СИОЗС конформации св зей не будет связываться в присутствии субстрата. Антитела, которые распознают 3D-эпитоп, который не изменяется в результате конформации будет связываться независимо от лиганда, присутствующего. Смешайте попарно различные комбинации антител и проверить связывания с ФКЦБ. Антитела, которые распознают различные эпитопы заставит СЕРТ для элюирования ранее в сочетании друг с другом по сравнению с связывание одного антитела. Для начальных структурных исследований, выбрать наибольшим сродством антитела, которые распознают эпитопы 3D. 7. Экспрессия фрагмент антитела в клетках Sf9 Клон переменной и константные домены Fab с помощью ПЦР в насекомых системе экспрессии для экспрессии в клетках Sf9 с использованием стандартных протоколов. Трансфекцию 1 х 10 6 Sf9 клеток с 5 мкг Бакмидную ДНК , кодирующие легкие и тяжелые цепи 8-Его помеченной 8B6 Fab с последовательностью секреции gp67 (как указано в разделе 3.4). Урожай Р1 вируса 96 ч после трансфекции и добавляют 500 мкл вируса от Р1 до 1 л клеток Sf9 при плотности 1 х 10 6 клеток / мл в 2 – литровую колбу , чтобы сделать вирус P2. Инфицировать клетки в течение 96 ч при 27 ° С. Урожай вируса P2 (как указано в разделе 3.6). Infect 6 л Sf9 клеток при плотности 2 – 3 × 10 6 клеток / мл с MOI 2 с вирусом P2, обычно 40 – 50 мл на колбу с 1 л клеток Sf9 в каждом 2 – литровой колбе. Урожай клетки приблизительно 96 ч постинфекционной. Добавляют 50 мл фосфатного буфера, рН 8 при конечной концентрации 50 мМ в клетки и спина при 4000 х г в течение 20 мин. Выбросите осадок клеток и фильтр супернатанта через ячейки тангенциальным потоком с фильтром 0,2 мкм. Соберите супернатант и хранят при температуре 4 ° С в течение 2 – 3 дней, если это необходимо. <p class="jove_title"> 8. Очистка фрагментов антител из sF9 супернатанта Концентрат Sf9 супернатанта с использованием 30 кДа Молекулярный вес Cut Off (MWCO) тангенциальной проточной ячейки приблизительно 400 – 800 мл. Добавить имидазола, рН 8 при конечной концентрации 10 мМ и 10 мл His-меткой сродства смолы. Смешать в стакане в течение 1 ч при 4 ° С. Соберите His-метку сродства смолы путем центрифугирования при 2000 мкг в течение 5 мин. Удалите супернатант. Паковать-тег сродства смолы в колонку и подключиться к FPLC. Мытье His-метку сродства смолы в 2 мл / мин с 66 мл (объемы 6,6 колонка) 50 мМ фосфата рН 8, 150 мМ NaCl, 25 мМ имидазола. Элюировать 8B6 Fab-в 33 мл 50 мМ фосфата рН 8, 150 мМ NaCl, 250 мМ имидазола. Собрать 1 мл фракции. Развести аффинно-очищенные Fab с 10-кратным объемом охлажденного льдом 20 мМ ацетата, рН 5. Bind ФАБ 1 мл катионообменной колонке с использованием перистальтического насоса при 1 мл / мин. Отдельные Fab с использованием 30 мл Linуха градиент NaCl (0 – 500 мМ) в 20 мМ ацетата рН 5,5 с помощью FPLC. Fab будет элюировать в виде единственного пика при ~ 300 мМ NaCl. Анализ на 12,5% геле SDS-PAGE с использованием буфера, содержащего 100 мМ ДТТ. Тяжелые и легкие цепи 8B6 Fab будет работать на 27 и 25 кДа, соответственно, на редукционной геле SDS-PAGE. Фракции, содержащие фрагменты Fab бассейн и концентрируют, по крайней мере, на 10 – 15 мг / мл с использованием 30 кДа MWCO белка концентраторы в Бакет центрифуге при 3000 х г. Отрегулировать до рН 8 добавлением 1 М Трис рН 8 до конечной концентрации 50 мМ и хранят очищенный Fab в течение длительного времени при температуре 4 ° С. Общий выход составит 25 – 30 мг. Оптическую плотность 1,4 AU при 280 нм, равна 1 мг / мл 8B6 Fab. 9. Формирование Transporter-антитело и разделение с помощью вытеснительной хроматографии Для кристаллизации, очищают SERT CC стрептококком аффинной хроматографии в C12M , как описано ранее (раздел 4). <li> Дайджест с тромбином для удаления меток (1: 100 м / м) и ЭндоН (в соотношении 1:10 вес / вес) O / N при комнатной температуре. Концентрат до 250 – 300 мкл с использованием 100 кДа MWCO центрифуга белка концентраторы до концентрации белка 10 мг / мл. Смешайте концентрированное SERT с Fab при мольном соотношении 1: 1,2 в объеме менее 500 мкл. Центрифуга при 100000 х г при 4 ° С в течение 20 мин. Собирают супернатант, содержащий комплекс SERT-Fab. Отбросить осадок. Раздельное с помощью вытеснительной хроматографии (SEC) с использованием FPLC на колонке вытеснительной уравновешенной в TBS с добавлением 40 мМ н-октил-β-D-maltoside (С8М), 0,5 мМ CHS, 5% глицерина, 25 мкМ липидов (то же, как на шаге 4.5) и 1 мкМ S -citalopram при 0,5 мл / мин. Сбор 0,5 мл фракции и анализируют на 4 – 15% SDS-PAGE гелей, а также с помощью флуоресценции триптофана по SEC. GFP, помеченный СЕРТ будет работать при температуре примерно 80 кДа на геле SDS-PAGE. После удаления и N-концов-связанных сахаров он будет работать как белок 45 кДа. Determine, какие фракции объединить путем объединения только фракции, которые монодисперсных судить по анализу фракции с помощью флуоресценции триптофана SEC (раздражений: 280, Излучение: 335 нм). Хранить очищенный SERT-8B6 комплекс при 4 ° С в течение до 1 недели. 10. Кристаллизация Transporter-антитело комплексов свисающими Перед кристаллизацией концентрат Пиковые фракции из разделения SEC комплекса СЕРТ-8B6 до 2 мг / мл, с помощью 100 кДа MWCO центрифуга белка концентраторы. Абсорбция 2 AU при 280 нм, равна 1 мг / мл. Добавление дополнительных Fab в соотношении 1: 0,05 комплекса: свободный Fab. Добавьте 10 мкМ свободный S -citalopram. Центрифуга при 100000 х г при 4 ° С в течение 20 мин. Собирают супернатант, содержащий SERT-Fab комплекс. Отбросить осадок. Настройка висячей капли экран 24-а при 4 ° С в соответствии с таблицей 1. Вырастить кристаллы качества дифракции над пластовых растворовсодержащего 100 мМ Трис-NaOH, рН 8,5, 25 – 125 мМ KCl, 32,5 – 34% ПЭГ 400 и 0,5% 6-аминокапроновой кислоты. Примечание: Используйте Трис скорректированные с помощью NaOH до рН 8,5 в качестве буфера. Не используйте Трис основание, установленное с HCl. Экран может быть получен в 2 мл пробирки и использовали пока не закончено. Позаботьтесь, чтобы точно пипеткой PEG 400 с использованием позитивного пипетку смещения как это чрезвычайно вязкая! Пипетка 500 мкл каждого резервуара раствора в низкопрофильных 24-луночный планшет с герметиком, приложенного к каждой лунке. Пипетка 1,5, 1,75, и 2 мкл комплекса СЕРТ-8B6 на обложку силиконизированный стекла скольжением 18 мм. Пипетка 1 мкл резервуарного раствора на верхней части образца белка. Примечание: Пластина была приобретена с уплотнителем уже нанесенного на ободе лунок. Нанесите крышку слайд на 24-луночных с каплями, с которыми сталкивается раствор пластового и запечатать сразу, нажав на покровное стекло герметик предварительно нанесен в каждую лунку. Продолжайте, пока все 24 скважины не были созданы. </li> Оставьте готовую плиту в хорошо изолированном помещении при температуре 4 ° С. Не беспокоить пластины, по крайней мере, 3-х дней Примечание: монокристаллы будут появляться в течение примерно 3 дней и вырасти до 100-175 мкм через 14 дней. Кристаллы урожая в cryoloops и непосредственно флэш-прохладно в жидком N 2 до рентгеновской дифракции сбора данных. При необходимости найти дополнительные условия кристаллизации широкого скрининга с висячей капли. Используйте три капли с белком: осадителя соотношение 2: 1, 1,5: 1, 1: 1. Если робот доступен, а затем установить 100-150 Н.Л. падает на 70 мкл раствора резервуара в 96-луночный планшет. Большие 3D кристаллы можно выращивать в 24-луночных. Оценка основана на внешнем виде капли: 0, ясно; 1, пыли; 2, гранулированный осадок; 3, разделение фаз; 4, микрокристаллическая; 5, иглы; 6, плиты; 7, 3D кристаллы. Настройка кристаллизации путем повешения методы падения в 24-лунок, как описано выше вокруг вновь выявленных кондitions.