Termoestabilização, expressão, purificação e cristalização do transportador de serotonina humano Bound to<em> S</em> -citalopram

1. A transfecção de Aderente HEK293S GnTI – Pilhas para a tela termoestabilidade Prepare poli-D-lisina (PDL) -Revestido placas de 96 poços. Executar todo o trabalho em uma capela de fluxo laminar estéril. Filtrar uma solução de 25 ug / mL de (PDL), o peso molecular 70,000-150,000 Da, utilizando um filtro estéril de 0,2 | im. Adicionar 50 uL de PDL para cada poço de uma placa de cultura de tecidos de 96 poços (TC), assegurando o fundo é revestido uniformemente, e incubar à TA durante 30 min. Aspirar PDL solução e lava-se com 200 mL de água estéril. Permitir que a placa secar ao ar durante 2 h antes do armazenamento a 4 ° C. PDL placas revestidas podem ser armazenadas a 4 ° C durante várias semanas. A tripsinização de células aderentes HEK293S. Cresça HEK293S a 80% de confluência numa placa de 10 centímetros mantida a 37 ° C com 8% de CO 2. Uma única placa de 10 cm devem ter, aproximadamente 10 milhões de células HEK293S. Não utilize células após 30 passagens! </li> meios Aspirar e lava-se com 5 mL de soluto salino tamponado com fosfato (PBS). Adicionar 1 ml de solução de tripsina-EDTA (tripsina a 0,25%, EDTA a 0,02%) para as células e incuba-se durante 2 min a 37 ° C. Adicionar 10 ml de Dulbecco Modified Eagle Médium (DMEM) suplementado com 10% de Soro Fetal Bovino (FBS) e ressuspender as células por pipetagens repetidas cima e para baixo com uma pipeta serológica. Pipetar 10 ul de células e misturar-se com 10 uL de azul Tripano solução (0,4%). Determinar a densidade de células utilizando um hemocitómetro e um microscópio de luz. Não conte as células que estão manchadas azul como eles estão mortos. Assegure-se que a viabilidade das células é superior a 90%. Completamente ressuspender tripsinizadas HEK293S GnTI – células em DMEM suplementado com FBS a 10% a uma densidade de 0,5 X 10 6 células / ml num reservatório pipeta descartável. Cerca de 5 milhões de células HEK293S serão necessários para cada placa. Um total de 24 construções podem ser transfectadas em cada placa utilizando este protocol. Usando uma pipeta de canais múltiplos, adiciona-se 100 uL de células para cada poço de uma placa revestida PDL. Ressuspender as células no reservatório de pipeta depois de encher cada placa para assegurar uma distribuição uniforme de células. Incubar as células em uma incubadora a 37 ° C com 8% de CO 2. Após 24 h, as células devem atingir cerca de 80% de confluência. 1 h antes da transfecção substituir a mídia. Preparar complexos de reagente de transfecção de ADN para transfecção. Para cada construção no fundo SERT TC a ser peneirado, mistura de 450 ng de ADN com 45 mL de DMEM isento de soro e mistura-se. Adicionar 1,6 mL do reagente de transfecção de 45 mL de DMEM isento de soro e mistura-se. Imediatamente adicionar solução de reagente de transfecção diluída a solução de ADN e misturar. Não misture soluções na ordem inversa. Esperar 10 – 15 min e adicionar 20? L de mistura de reagente / transfecção de ADN a 4 poços. Uma vez que todos os poços foram transfectadas, misture placa por balançando suavemente de volta umND adiante e retornar à temperatura de 37 ° C incubadora. Depois de 16 – 24 h substituí meios com DMEM contendo soro e butirato de sódio 10 mM. Aproximadamente 48 h após a transfecção remover a mídia e quer prosseguir imediatamente com thermostability tela ou congelar as células a -80 ° C para ser usado mais tarde. As células podem ser armazenadas a -80 ° C durante várias semanas. Tela de termoestabilidade com base em 2. Proximidade de Cintilação com S -citalopram Incubar as células com 200 nM S -citalopram em 25 mL de TBS (Tris-Soro Fisiológico Tamponado com – Tris a 20 mM, pH 8, NaCl 100 mM) durante 5 min à TA. Solubiliza-se as células por adição de 25 uL de mM de N-dodecil-β-D-maltopiranósido 8 (C12M), colesterilo hemmisuccinate 1 mM (CHS), cocktail inibidor de protease (fenilmetanossulfonil fluoreto de 2 mM (PMSF), 0,1 mg / ml de aprotinina, 4 g / mL de pepstatina a, e 4 ug / ml de leupeptina) em TBS, e incubação durante 1 h à TA. Adicionar 50 ul de TBS with 20 nM de [3H] citalopram (81,7 Ci / mmole), 0,1% de albumina de soro de bovino, e 2 mg / mL de His-tag de afinidade de ensaio de proximidade de cintilação (SPA) para grânulos de três poços para cada constructo. Para o último poço adicionar a mesma solução listada, mas complementar com 100 sertralina? M para determinar a ligação não específica. Certifique-se de que as contas His-tag de afinidade SPA são misturados ao adicionar a placa de 96 poços. Medir [3 H] citalopram de ligação usando um contador de cintilação de 96 poços à temperatura ambiente com um tempo de contagem de 1 min por po. Continue placas de contagem até que as contagens totais planalto (aproximadamente após 36 h). placas de calor durante 15 min num bloco de aquecimento com uma tampa aquecida a 33 ° C. Medir a ligação de [3H] citalopram novamente após o aquecimento, tal como descrito em 2.4. Repetir o passo 2,4-2,5 e alterar o passo de aquecimento a 36 ° C, 39 ° C, 45 ° C, 48 ° C, e 51 ° C. Ajuste as temperaturas de aquecimento, dependendo da temperatura aparente de fusão (Tm)da proteína alvo e a termoestabilidade da construção mais estável. Continuar a aquecer as placas até que todas as construções têm baixas contagens específicas. Analisar os dados para determinar os valores de Tm. Determinar as contagens totais médias por minuto (cpm) de cada construção de poços que não contêm sertralina através da média das 3 réplicas de poços. Determinar o CPM não específica pela média das CPM de cada poço contendo sertralina numa única placa. Calcular CPM específica subtraindo a CPM não específica do CPM total. Calcular a Tm por um ajuste não linear para uma função sigmoidal de Boltzmann. Construções com baixo CPM específica à temperatura ambiente (<10% do WT) geralmente não têm valores precisos Tm. Mutações do mais construções termoestáveis ​​podem ser combinadas e rastreados para aumentos aditivos em thermostability. 3. A expressão do transportador da serotonina humana em HEK293S GnTI <sup> – Células Transformar células competentes DH10Bac quimicamente com 1 ng de plasmídeo. Adicionar plasmídeo a 50 ul de células DH10Bac e incubar em gelo durante 30 min. células DH10Bac choque térmico a 42 ° C durante 30 seg. Adicionar 200 ul de meio SOC e incubar a 37 ° C durante 4 h, com agitação. Placa de todas as bactérias para uma placa de caldo de Luria (LB) contendo 50 ug / ml de canamicina, 7 pg / ml de gentamicina, 10 ug / ml de tetraciclina, 100 ug / ml de 5-bromo-3-indolil β-D-galactopiranósido, e 40 ug / ml de β-D-1-tiogalactopiranosido (IPTG) isopropilo. Isolar lacZ – colónias brancas (colónias) produzidas a 37 ° C durante 2 d em placas de LB-agar. Cresça várias colónias O / N a 37 ° C em 5 mL de LB contendo antibióticos e isolar o ADN de bacmid. Spin down bactérias a 1.000 xg numa centrífuga durante 5 min. sobrenadante de descarte. Ressuspender as bactérias com 200 ul de r minipreptampão esuspension. Lisar as bactérias por adição de 200 uL de tampão de miniprep de lise e invertendo o tubo suavemente 10 vezes. Adicionar 200 ul de tampão de neutralização. Remover fracção insolúvel por centrifugação a 14.000 xg durante 10 min numa centrífuga. Adicionar 1 mL de isopropanol frio para o sobrenadante e à temperatura de -20 ° C durante 20 minutos para precipitar o ADN. Girar a 14.000 xg durante 15 min numa centrífuga e descartar o sobrenadante. Lave o peletizado de ADN com 70% de EtOH e girar novamente a 14000 xg durante 15 min. sobrenadante de descarte. Ar ADN seco até que todos EtOH foi evaporado e ressuspender em 50 mL de água. NOTA: ADN bacmid deve ser transfectado em células Sf9 imediatamente para obter os melhores resultados, mas podem também ser armazenados a -20 ° C durante várias semanas. Transfectar ADN bacmid em 1×10 6 células de Sf9 aderentes cultivadas numa câmara humidificada a 27 ° C num prato de 6 poços. Executar todas as manipulações de cultura de células numa câmara de fluxo laminar estéril. <li> Remova a mídia a partir de células e adicionar 2 mL de meio Sf 9 frescos. Adicionam-se 5 ug de ADN bacmeo de 100 uL de meios de Sf9 (solução A). Adicionar 8 mL de um reagente de transfecção catiónico Sf9-lípido para 100 ul de meios de Sf9 (Solução B). Incubar tubo contendo solução B durante 5 min. Misture tubo contendo solução A com a solução B e incubar à TA durante 30 min e adicionar toda a solução para as células Sf9. Após 96 h, o sobrenadante da colheita (vírus P1) por passagem através de um filtro de 0,2 um. O vírus P1 podem ser armazenados durante vários meses a 4 ° C no escuro e reutilizado para fazer vírus P2, conforme necessário. Adicionar 100 uL de vírus P1 a 1 L de células Sf9, a uma densidade de 1 x 10 6 células / ml em meios Sf9. Infectar as células durante 96 h, a crescer a 27 ° C num agitador a 100 rpm. Girar as células numa centrífuga a 4000 xg durante 15 min e o sobrenadante contendo partículas virais filtro através de um filtro de 0,2 um. Descartar sedimento celular. determdensidade viral ine utilizando um ensaio de placa virai ou um contador de vírus. A densidade de partículas de vírus deve ser> 1 x 10 8 de vírus por mililitro. vírus P2 pode ser armazenado a 4 ° C no escuro e utilizada para vários meses. Infect 10 L de HEK293S GnTI – células 7 que crescem em suspensão, a 37 ° C com CO 2 e 85% de humidade 8% num agitador a 130 rpm, em 293 meios de expressão suplementado com 2% de FBS a uma multiplicidade de infecção (MOI) de 2 e uma densidade de 3 X 10 6 células / ml, tipicamente 30 – 50 ml de vírus P2 por 800 ml de células num frasco de 2 L confundido. NOTA: não é recomendado o uso de mais do que 80 ml de vírus P2 desde o HEK293S GnTI – células vão crescer lentamente e pode tornar-se inviável devido a uma alteração no pH. media Sf9 é mais ácida do que a mídia 293 expressão. 12 – 16 h pós-infecção, adicionar butirato de sódio para uma concentração de 10 mM a partir de um estoque 1 M. 48 – 60 h pós-infecção, as células por centrifugação a colheita4000 xg durante 15 min. Remover o sobrenadante. Ressuspender as células em 150 ml de TBS, 2 uM S -citalopram ou outros inibidores da SERT e armazenar a -80 ° C até estar pronta para purificação. 4. A purificação por afinidade do transportador de serotonina para Imunização e cristalização Descongelar as células a partir de 10 L de cultura em água quente (aproximadamente 30 ° C) e ressuspender fazendo passar rapidamente através de uma pipeta de 10 mL, até ficar homogénea. Preparar a solução de detergente para a solubilização (150 mL): 80 mM Tris, pH 8, NaCl 150 mM contendo 40 mM de C12M, CHS 5 mM, e cocktail inibidor de protease. Adicionar todas as células para uma proveta com uma barra de agitação e adicionar toda a solução de detergente para as células, enquanto se agitava. Solubiliza-se a 4 ° C durante 1 h com agitação. Girar lisado a 8000 xg durante 15 min a 4 ° C. Descartar pelete e o sobrenadante decantado para tubos de ultracentrífuga limpas. Girar a 100.000 xg durante 1 h em uma ultracentrifuge. Descartar o sobrenadante e sedimento do filtro através de um filtro de 0,2 um. Passa lisado sobre resina de afinidade com 10 mL de Strep empacotada numa coluna utilizando uma bomba peristáltica, equilibrada em tampão de lavagem: C12M 1 mM, CHS 0,2 mM, glicerol a 5%, 25 fiM de lípido (1-palmitoil-2-sn-glicero-oleoyl- 3-fosfocolina, 1-palmitoil-2-oleoyl–sn-glicero-3-fosfoetanolamina, e 1-palmitoil-2-oleoyl–sn-glicero-3-fosfoglicerol numa razão molar de 1: 1: 1), e 1 S ^ M -citalopram ou SSRI em TBS. Conectar Strep coluna de afinidade a um sistema de Cromatografia Líquida de Proteínas Rápida (FPLC) e lavagem da coluna a 2 mL / min com 66 mL (6,6 volumes de coluna) de tampão de lavagem. Eluir a proteína purificada no mesmo tampão suplementado com 5 mM de destiobiotina em 0.5 ml / min, utilizando 33 mL (3,3 volumes de coluna) de tampão. Recolher fracções de 1 ml; as fracções de pico será ~ 10 mL. A proteína purificada pode ser armazenada a 4 ° C durante 2-3 d se desejado. NOTA: O rendimento total será de 3 -4 mg de SERT CC e 1 mg de SERT IC. Uma absorvância de 2 UA a 280 nm é igual a 1 mg / mL de SERT. 5. Transportador de reconstituição em lipossomas para imunização Preparar lipossomas contendo asolectin: colesterol: lípido A: cérebro de lípidos polares (razão molar 60: 17: 3: 20). Dissolve-se os lípidos em 1 mL de clorofórmio e adicionar 40 mg de lípido total de 100 ml de vidro frasco de fundo redondo à razão molar indicada. Evapora-se o clorofórmio, durante pelo menos 1 h sob vácuo com o balão de fundo redondo de rotação em água quente, a cerca de 30 ° C. Reidratar lípidos pela adição de 10 mL de TBS. Incubar em tampão durante 10 minutos. Congelar o lípido, colocando o frasco em N2 líquido. Descongelamento. Imergir fundo esférico do frasco num copo cheio com água quente, a cerca de 30 ° C. Sonicar num sonicador de banho durante 5 min. Vortex e repita os passos 5.1.3 – 5.1.4 10 vezes ou até que a lipídicoé completamente ressuspenso a partir do fundo e forma uma suspensão turva. Extrusão da mistura de lípidos toda duas vezes através de filtros 200 nm. O lípido irá aparecer como uma suspensão leitosa antes da extrusão; depois ele irá ser translúcido. Não adicione a mistura de lípidos inteiro para a extrusora de uma só vez, pois ele pode ficar obstruídos, resultando em perda de amostra. Lípidos girar a 100.000 xg durante 20 min e ressuspender em 0,5-1 ml de TBS com uma concentração de 40 mg / mL. Concentrado purificado SERT IC 250 – 500 mL utilizando um concentrador de proteína de 100 kDa MWCO centrífuga para 2-4 mg / mL e saturar com lipossomas C12M 5 mM. Adicionar SERT purificada para o detergente: mistura de lípidos em 1 ml de volume final. Remover C12M 3 por adições sucessivas de 80 mg / ml de resina hidrofóbica de absorção. Durante os primeiros 2 adições, incubar com resina com rotação durante 2 h a 4 ° C. Remover a resina por passagem através de lã de vidro. Realizar a incubação final com resinadurante a noite. Concentrar proteolipossomas por centrifugação a 100000 xg durante 20 min. Descartar o sobrenadante e ressuspender o pellet em 250-500 ul de TBS. Adiciona-se 10 uM de concentração final -citalopram S à proteína reconstituída a seguir à remoção final da resina. Solubiliza-se 2,5 ul da proteolipossomas em tampão de SDS-PAGE de carga (Tris 62,5 mM, pH 6,8, 10% de glicerol, 2% de SDS, 0,01% de azul de bromofenol, DTT 100 mM) e corrido num gel de SDS-PAGE a 200 V durante 1 h para assegurar que a SERT foi reconstituída com sucesso. Proteolipossomas pode ser armazenado a -80 ° C em alíquotas para armazenamento a longo prazo e descongelado em gelo antes de cada imunização. 6. Rastreio de anticorpos que reconhecem epitopos 3D linhas celulares de hibridoma da tela por Western Blot. Os anticorpos que reconhecem SERT por western blot provavelmente se ligam epítopos lineares e provavelmente não serão úteis para estudos estruturais. Misturar 1 ug de purifiEd SERT IC ou CC SERT e executado em um 4 – em gel de SDS-PAGE a 15% a 200 V durante 1 h. Transfira para uma membrana de nitrocelulose a 200 mA durante 30 minutos usando tampão Towbin (25 mM de Tris, 192 mM glicina, 20% (v / v) de metanol, 0,1% de SDS). A membrana pode ser seco e armazenado indefinidamente à temperatura ambiente. re-humedecimento da membrana com 10% de metanol, e lava-se com PBS (fosfato 10 mM, pH 7,4, NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM). Bloco com 5% de leite em pó em PBS durante 30 min à TA. Lavar com PBS e incuba-se com 1 ug / ml de anticorpo em PBS com leite a 0,1%. Lavar exaustivamente com PBS contendo 0,1% de Tween-20. Incubar com anticorpo de cabra anti-ratinho conjugado com um corante IV diluída 1: 10000 em PBS com 0,1% de Tween 20 e 0,1% de leite. Lavar extensivamente e digitalizar utilizando um sistema de imagem. Misture sobrenadante de hibridoma contendo anticorpos negativos ocidentais com 100 nM de proteína SERT CC utilizando uma razão molar de 1: 2 (SERT: mAb) em 200 uL de TBS com C12M 1 mM, CHS 0,2 mM, e 1 ^ M S -citalopram. Centrifugar a 100.000 xg durante 20 min. Analisar o sobrenadante contendo os complexos SERT-mAb e analisar por detecção de fluorescência Cromatografia de Exclusão de Tamanho (FSEC) 8. Descartar o sedimento. Executar 100 ul de sobrenadante numa coluna de exclusão por tamanho em 0.5 ml / min, utilizando um sistema de Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (HPLC) equipado com um detector de fluorescência (excitação: 480 nm, Emissão: 510 nm) utilizando um tampão de corrida contendo TBS, 0,4 mM lauril neopentilglicol maltose, e 1 uM S -citalopram. Os anticorpos que formam complexos fará com que a proteína de fusão GFP-a eluir mais cedo do que o transportador livre a partir da coluna de exclusão de tamanho. Dilui-se a complexos de 10, 1, 0,1 nM em 200 uL de TBS com C12M 1 mM, CHS 0,2 mM, e 1 ^ M S -citalopram e de reprise FSEC. Os anticorpos que ainda pode deslocar o pico transportador em baixas concentrações nanomolares sãoligantes de alta afinidade e bons candidatos para estudos estruturais. Retestar ligação por FSEC na presença de serotonina 1 mM. Anticorpos que reconhecem especificamente a conformação SSRI ligado não irá ligar-se na presença do substrato. Os anticorpos que reconhecem um epitopo em 3D que não se altera como resultado de conformação irão ligar-se independentemente do ligando presente. Misturar diferentes combinações de pares de anticorpos e testar a ligação por FSEC. Os anticorpos que reconhecem epítopos distintos vai causar SERT para eluir antes, quando combinados em conjunto em comparação com a ligação de um único anticorpo. Para estudos estruturais iniciais, selecione os anticorpos de afinidade mais elevados que reconhecem epítopos 3D. 7. Expressão de um fragmento de anticorpo em células Sf9 domínios variáveis ​​e constantes clone Fab por PCR no sistema de expressão de insecto para a expressão em células Sf9 usando protocolos padrão. Transfectar 1 x 10 6 células Sf9 com 5 ug de ADN bacmeo que codificam as cadeias leves e pesadas do Fab 8B6 8-His, com uma sequência de secreção de GP67 (conforme a secção 3.4). Colheita P1 vírus 96 h após transfecção e adicionar 500 mL de vírus de P1 a 1 L de células Sf9, a uma densidade de 1 x 10 6 células / ml em um balão de 2 L para fazer vírus P2. Infectar as células durante 96 h a 27 ° C. Colheita vírus P2 (conforme a secção 3.6). Infect 6 L de células Sf9, a uma densidade de 2-3 x 10 6 células / ml com uma MOI de 2 com vírus P2, tipicamente 40 – 50 ml por frasco com 1 L de células Sf9 em cada balão de 2 L. Células colheita aproximadamente 96 h após a infecção. Adicionar 50 ml de tampão de fosfato, pH 8, numa concentração final de 50 mM para as células e centrifugação a 4000 xg durante 20 min. Desprezar o pelete de células e o sobrenadante do filtro através de uma célula de fluxo tangencial de 0,2 um filtro. Recolher o sobrenadante e armazenar a 4 ° C durante 2 – 3 dias, se desejado. <p class="jove_title"> 8. A purificação do anticorpo Os fragmentos de Sf9 sobrenadante Concentre Sf9 sobrenadante usando um 30 kDa de peso molecular Cut Off (MWCO) de célula de fluxo tangencial para cerca de 400-800 mL. Adicionar imidazole, pH 8 a uma concentração final de 10 mM e 10 ml de resina de afinidade de His-tag. Agita-se numa proveta de 1 h a 4 ° C. Recolhe His resina de afinidade por centrifugação a 2000 xg durante 5 min. sobrenadante de descarte. Pacote de resina de afinidade His-tag em uma coluna e se conectar a um FPLC. Lava-His-tag de afinidade em resina de 2 ml / min com 66 mL (6,6 volumes de coluna) de fosfato 50 mM pH 8, NaCl 150 mM, imidazole 25 mM. Eluir 8B6 Fab em 33 mL de 50 mM de fosfato de pH 8, NaCl 150 mM, imidazole 250 mM. Recolher fracções de 1 ml. Diluir Fab purificado por afinidade com um volume de 10 vezes de acetato 20 mM gelado, pH 5. Fab se ligam a uma coluna de 1 ml de permuta catiónica, utilizando uma bomba peristáltica a 1 mL / min. Fab separada usando um mL lin 30gradiente de NaCl de orelha (0-500 mM) em 20 mM de acetato, pH 5,5 utilizando um FPLC. Fab irá eluir como um único pico a ~ NaCl 300 mM. Analisar num gel de SDS-PAGE a 12,5%, utilizando tampão de amostra contendo DTT 100 mM. As cadeias pesada e leve de 8B6 do Fab será executado a 27 e 25 kDa, respectivamente, sobre um gel de SDS-PAGE redutor. Piscina fracções contendo Fab e concentra-se para, pelo menos, 10 – 15 mg / ml usando um concentrador kDa MWCO de proteína numa centrífuga de 30 basculante a 3.000 x g. Ajustar a pH 8 por adição de Tris 1 M pH 8 para uma concentração final de 50 mM e armazenamento de Fab purificado por longo prazo, a 4 ° C. O rendimento total será de 25 – 30 mg. Uma absorvância de 1,4 UA a 280 nm é igual a 1 mg / mL de Fab 8B6. 9. A formação de complexos transportadores-anticorpo e separação por cromatografia de exclusão de tamanho Para cristalização, purificar o CC SERT por cromatografia de afinidade Strep em C12M como descrito anteriormente (secção 4). <li> Digest com trombina para remover as etiquetas (1: 100 w / w) e EndoH (1:10 w / w) O / N à temperatura ambiente. Concentra-se para 250-300 uL utilizando uma kDa MWCO de proteína concentrador de centrífuga de 100 a uma concentração de proteína de 10 mg / mL. Misture SERT concentrado com Fab a uma razão molar de 1: 1,2, num volume inferior a 500 uL. Centrifuga-se a 100.000 x g a 4 ° C durante 20 min. Recolher o sobrenadante contendo o complexo de SERT-Fab. pellet de descarte. Separado por Cromatografia de Exclusão de Tamanho (SEC) usando um FPLC numa coluna de exclusão de tamanho equilibrada em TBS suplementado com 40 mM de N-octil-β-D-maltósido (C8M), CHS 0,5 mM, glicerol a 5%, 25 fiM de lípido (o mesmo que no passo 4.5), e 1 uM S -citalopram a 0,5 mL / min. Recolha 0,5 frações mL e analisar em 4-15% de gel SDS-PAGE, bem como por fluorescência de triptofano pela SEC. GFP com etiquetas SERT será executado em cerca de 80 kDa num gel de SDS-PAGE. Após a remoção dos terminais e açúcares ligados a N que será executado como uma proteína de 45 kDa. Determine quais as fracções a combinar juntando apenas as fracções que são monodispersas, tal como avaliado por análise das fracções por fluorescência de triptofano SEC (excitação: 280, Emissão: 335 nm). Loja purificado complexo SERT-8B6 a 4 ° C por até 1 semana. 10. A cristalização de complexos transportadores-anticorpo por enforcamento Gota Antes da cristalização, concentrar as fracções do pico a partir da separação do complexo SEC do SERT-8B6 a 2 mg / ml usando um concentrador kDa MWCO de proteína centrífuga 100. Uma absorvância de 2 UA a 280 nm é igual a 1 mg / mL. Adicionar Fab adicional a uma razão de 1: 0,05 complexo: Fab livre. Adicionar 10 mM livre S -citalopram. Centrifuga-se a 100.000 x g a 4 ° C durante 20 min. Recolher o sobrenadante contendo o complexo SERT-Fab. pellet de descarte. Configurar um ecrã de 24 poços gota suspensa a 4 ° C de acordo com a Tabela 1. Crescer cristais de qualidade de difração em relação às soluções de reservatóriocontendo Tris 100 mM-NaOH, pH 8,5, 25 – de KCl 125 mM, 32,5 – 34% de PEG 400 e 0,5% de ácido 6-amino-hexanóico. NOTA: O uso de Tris ajustado com NaOH para um pH de 8,5 como tampão. Não use base Tris ajustado com HCl. A tela pode ser preparado de 2 mL e tubos utilizados até terminar. Tome cuidado para pipetar com precisão PEG 400, utilizando uma pipeta de deslocamento positivo, pois é extremamente viscosa! Pipetar 500 L de cada solução de reservatório num baixo perfil placa de 24 poços com selante aplicado a cada poço. Pipeta de 1,5, 1,75 e 2 mL do complexo SERT-8B6 para um 18 milímetros lamela de vidro siliconizada. Pipete 1 mL de solução reservatório no topo da amostra de proteína. NOTA: A placa foi comprado com selante já aplicada à borda dos poços. Aplicar a cobertura deslizante para a de 24 poços com as gotas de frente para a solução de reservatório e selar imediatamente pressionando tampa de deslizamento para selante pré-aplicado a cada poço. Continue até que todos os 24 poços foram criadas. </li> Deixe a placa acabada em um quarto bem isolado a 4 ° C. Não perturbe placas durante pelo menos 3 dias NOTA: Monocristais aparecerão dentro de aproximadamente 3 dias e crescer para 100-175 mm após 14 dias. Cristais da colheita no cryoloops e directamente pisca-legal no N2 líquido antes de raios-X de coleta de dados de difração. Se necessário, encontrar condições de cristalização adicionais por triagem ampla com gotas de suspensão. Utilizar três gotas com proteína: precipitantes proporções de 2: 1, 1,5: 1, 1: 1. Se um robô está disponível, em seguida, ajustado até 100-150 nL gotas mais de 70 ul de solução de reserva numa placa de 96 poços. Cristais maiores 3D podem ser cultivadas em 24 poços. Pontuação baseada na aparência da queda: 0, claro; 1, poeira; 2, precipitado granular; 3, a separação de fases; 4, microcristalina; 5, agulhas; 6, as placas; 7, cristais 3D. Configurar a cristalização por enforcamento métodos gota em 24 poços como descrito acima em torno cond recém-identificadoitions.