Thermostabilization, Expression, Reinigung und Kristallisation des menschlichen Serotonin-Transporter-Bound<em> S</em> -Citalopram

1. Transfektion von adhärenten HEK293s GnTI- – Zellen für die Thermostabilität Bildschirm Bereiten Poly-D-Lysine (PDL) -beschichteten Platten mit 96 Vertiefungen. Alle Arbeiten in einer sterilen Laminar-Flow-Haube. Filtern, um eine 25 & mgr; g / ml Lösung von (PDL), Molekulargewicht 70,000-150,000 Da, einen 0,2 um Sterilfilter. In 50 ul PDL zu jeder Vertiefung einer 96-Well-Gewebekultur (TC) Platte, um sicherzustellen, der Boden gleichmäßig beschichtet ist, und Inkubation für 30 min bei RT. Absaugen PDL-Lösung und Waschen mit 200 & mgr; l sterilem Wasser. Erlauben Platte an der Luft trocknen für 2 h vor der Lagerung bei 4 ° C. PDL beschichteten Platten können bei 4 ° C für mehrere Wochen gelagert werden. Trypsinisierung von adhärenten HEK293s Zellen. Wachsen HEK293s zu 80% Konfluenz in einer 10 cm Schale bei 37 ° C mit 8% CO 2 gehalten. Eine einzelne 10 cm-Schale sollte etwa 10 Millionen HEK293s Zellen haben. Verwenden Sie keine Zellen nach 30 Passagen! </li> Aspirat Medien und wasche mit 5 ml Phosphat-gepufferter Saline (PBS). 1 ml Trypsin-EDTA-Lösung (0,25% Trypsin, 0,02% EDTA) zu den Zellen und Inkubation für 2 min bei 37 ° C. In 10 ml Dulbecco-modifiziertem Eagle-Medium (DMEM), ergänzt mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) und resuspendieren Zellen durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren eine serologische Pipette. Je 10 ul der Zellen und mit 10 & mgr; l Trypanblau-Lösung (0,4%). Bestimmen Zelldichte einer Zählkammer und mit einem Lichtmikroskop. Zählen Sie nicht Zellen, die blau gefärbt werden, wie sie tot sind. Stellen Sie sicher, dass die Lebensfähigkeit der Zellen über 90% liegt. Gründlich resuspendieren HEK293s GnTI- trypsiniert – Zellen in DMEM mit 10% FBS auf eine Dichte ergänzt von 0,5 x 10 6 Zellen / mL in einem Einweg – Pipettenreservoir. Etwa 5 Millionen HEK293s Zellen werden für jede Platte benötigt werden. Insgesamt 24 Konstrukte können auf jeder Platte mit dieser pr transfiziert werdenotocol. Mit Hilfe einer Mehrkanalpipette, 100 & mgr; l Zellen zu jeder Vertiefung einer PDL beschichteten Platte. Die Zellen in der Pipettenbehälter nach jeder Platte füllt eine gleichmäßige Verteilung der Zellen zu gewährleisten. Inkubiere Zellen in einem 37 ° C Inkubator mit 8% CO 2. Nach 24 h sollte die Zellen etwa 80% Konfluenz erreichen. 1 h vor der Transfektion ersetzt Medien. Bereiten DNA-Transfektionsreagenz Komplexe für die Transfektion. Für jede in der SERT TC Hintergrund konstruieren abgeschirmt werden, mischen 450 ng DNA mit 45 & mgr; l Serum-freiem DMEM und mischen. Hinzufügen 1,6 uL des Transfektionsreagenz bis 45 & mgr; l serumfreiem DMEM und mischen. Sofort im verdünnten Transfektionsreagenz Lösung DNA-Lösung und mischen. Sie keine Lösungen in der umgekehrten Reihenfolge mischen. Warten Sie 10 bis 15 Minuten und fügen Sie 20 ul Transfektionsreagenz / DNA-Gemisch zu 4 Vertiefungen. Sobald alle Vertiefungen transfiziert wurden, Platte mischen eine durch sanft schaukelnden Rückennd her und zurück zum 37 ° C Inkubator. Nach 16 – 24 h ersetzen Medium mit DMEM, das Serum und 10 mM Natriumbutyrat. Etwa 48 h nach der Transfektion entfernen Medien und entweder sofort mit Thermostabilität Bildschirm oder Gefrierzellen bei -80 ° C ablaufen zu später verwendet werden. Zellen können bei -80 ° C für mehrere Wochen gelagert werden. 2. Scintillation Proximity-basierten Thermostabilität Bildschirm mit S -Citalopram Inkubiere die Zellen mit 200 nM S -Citalopram in 25 & mgr; l TBS (Tris-gepufferte Kochsalzlösung – 20 mM Tris, pH 8, 100 mM NaCl) für 5 min bei RT. Solubilisieren Zellen durch Zugabe von 25 ul 8 mM n-Dodecyl-β-D-maltopyranosid (C12M), 1 mM Cholesteryl hemmisuccinate (CHS), Protease-Inhibitor-Cocktail (2 mM Phenylmethansulfonylfluorid (PMSF), 0,1 mg / ml Aprotinin, 4 g / ml Pepstatin A, und 4 ug / ml Leupeptin) in TBS und 1 h bei RT inkubiert. In 50 ul TBS with 20 nM [3 H] Citalopram (81,7 Ci / mmol), 0,1% Rinderserumalbumin und 2 mg / mL His-tag Affinität Scintillation Proximity Assay (SPA) -Kügelchen zu drei Vertiefungen für jedes Konstrukt. Für die letzte Vertiefung für die gleiche Lösung aufgelistet, sondern ergänzen mit 100 & mgr; M Sertralin nicht-spezifische Bindung zu bestimmen. Stellen Sie sicher, dass His-Tag Affinität SPA-Kügelchen gründlich gemischt sind, wenn sie auf die 96-Well-Platte hinzugefügt wird. Messen Sie [3 H] Citalopram Bindung unter Verwendung eines 96-Well – Szintillationszähler bei RT mit einer 1 min Zählzeit pro Vertiefung. Weiter zählen Platten bis Gesamtzählungen Plateau (ca. nach 36 h). Wärmeplatten für 15 min in einem Heizblock mit einem beheizten Deckel bei 33 ° C. Messen Sie [3 H] Citalopram Bindung wieder nach dem Erhitzen wie in 2.4 beschrieben. Wiederholen Sie Schritt 2,4 bis 2,5 und die Erhitzungsstufe auf 36 ° C, 39 ° C, 45 ° C, 48 ° C und 51 ° C ändern. Einstellen Heiztemperaturen in Abhängigkeit von der scheinbaren Schmelztemperatur (Tm)des Zielproteins und der Thermostabilität des stabilsten Konstrukts. Weiter Platten zu erhitzen, bis alle Konstrukte niedrige spezifische Zählungen haben. Analysieren Daten Tm – Werte zu bestimmen. Bestimmen Sie die durchschnittliche Gesamt Zählungen pro Minute (CPM) jeder für Brunnen bauen, die Sertralin nicht enthalten, die durch die drei Wiederholungsvertiefungen im Durchschnitt. Bestimmen Sie die nicht-spezifische CPM durch die CPM jeder Vertiefung mit Sertralin in einer einzigen Platte gemittelt werden. Berechnen spezifischen CPM durch die unspezifische CPM von der gesamten CPM subtrahiert wird. Berechnen der Tm durch eine nichtlineare Anpassung an eine Boltzmann Sigmoidfunktion. Konstrukten mit niedrigem spezifischen CPM bei RT (<10% der WT) im allgemeinen keine exakten Tm – Werte. Mutationen aus den thermo Konstrukte können zusammen und für die additive Erhöhung der Thermostabilität gescreent kombiniert werden. 3. Expression des Human-Serotonin-Transporter in HEK293s GnTI- <sup> – Zellen Trans chemisch kompetente DH10Bac Zellen mit 1 ng Plasmid. Hinzufügen Plasmid zu 50 & mgr; l DH10Bac-Zellen und Inkubieren auf Eis für 30 min. Hitzeschock-DH10Bac-Zellen bei 42 ° C für 30 sec. In 200 ul SOC-Medium und Inkubation bei 37 ° C für 4 h unter Schütteln. Platte alle Bakterien auf einem Luria Broth (LB) Platte, die 50 ug / ml Kanamycin, 7 & mgr; g / ml Gentamycin, 10 ug / ml Tetracyclin, 100 ug / ml 5-Brom-3-indolyl β-D-galactopyranosid, und 40 ug / ml Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranosid (IPTG). Isolieren lacZ – Kolonien (weiße Kolonien) für 2 d bei 37 ° C gewachsen auf LB – Agar – Platten. Wachsen mehrere Kolonien O / N bei 37 ° C in 5 ml LB-Antibiotika enthalten und zu isolieren Bacmid DNA. Spin down Bakterien bei 1000 × g in einer Zentrifuge für 5 min. Überstand verwerfen. Resuspendieren Bakterien mit 200 & mgr; l Miniprep-resuspension Puffer. Lysieren Bakterien durch Zugabe von 200 & mgr; l Miniprep-Lysepuffer und Umdrehen des Röhrchens sanft 10mal. In 200 ul Neutralisierungspuffer. Entfernen unlöslichen Fraktion von in einer Zentrifuge bei 14.000 xg für 10 min dreht. 1 ml Isopropanol zum Überstand und Kälte bei -20 ° C für 20 min DNA auszufällen. Spin bei 14.000 × g für 15 min in einer Zentrifuge und Überstand verwerfen. Wasch DNA-Pellet mit 70% EtOH und Spin erneut bei 14000 × g für 15 min. Überstand verwerfen. Luft trocknen lassen, bis alle DNA EtOH wurde verdampft und resuspendieren in 50 & mgr; l Wasser. HINWEIS: Die Bacmid-DNA in Sf9-Zellen, für die besten Ergebnisse sofort transfiziert werden sollten, sondern kann auch für mehrere Wochen bei -20 ° C gelagert werden. Transfizieren Bacmid – DNA in 1×10 6 Zellen von adhärenten Sf9 in einer befeuchteten Kammer bei 27 ° C in einer Schale mit 6 Vertiefungen gezüchtet. Führen Sie alle Zellkulturmanipulationen in einer sterilen Laminar-Flow-Haube. <li> Entfernen Sie das Medium aus Zellen und mit 2 ml frischem Sf9 Medien. Zugabe von 5 & mgr; g Bacmid-DNA auf 100 & mgr; l von Sf9 Medien (Lösung A). Aus 8 & mgr; l eines kationischen Lipid-Sf9 Transfektionsreagenz auf 100 & mgr; l von Sf9 Medien (Lösung B). Inkubieren Rohr Lösung B für 5 min enthält. Mischungsrohr enthaltende Lösung A mit Lösung B und Inkubation bei RT für 30 min und fügen die gesamte Lösung zu den Sf9-Zellen. Nach 96 h, Ernteüberstand (P1-Virus) durch durch ein 0,2 um Filter geleitet. Der P1-Virus kann mehrere Monate lang bei 4 ° C im Dunkeln und wiederverwendet gespeichert P2-Virus zu machen, wie benötigt. Füge 100 & mgr; l P1 Virus zu 1 l Sf9 Zellen bei einer Dichte von 1 x 10 6 Zellen / mL in Sf9 Medien. Infect Zellen für 96 h, bei 27 ° C auf einem Schüttler bei 100 Upm wachsen. Spin-down Zellen in einer Zentrifuge bei 4000 × g für 15 min und Filterüberstand, der Viruspartikel durch ein 0,2 um-Filter. Entsorgen Zellpellet. determine virale Dichte eines viralen Plaque-Test oder einen Virus Zähler verwendet wird. Die Dichte Virus sollte> 1 x 10 8 Viruspartikel pro Milliliter. P2 Virus kann für mehrere Monate bei 4 ° C im Dunkeln gespeichert und verwendet werden. 10 l HEK293s GnTI- Infect – Zellen 7 in Suspension bei 37 ° C mit 8% CO 2 und 85% Luftfeuchtigkeit auf einem Schüttler bei 130 rpm in 293 Expressionsmedien , supplementiert mit 2% FBS bei einer Multiplizität der Infektion (MOI) von 2 wächst und einer Dichte von 3 x 10 6 Zellen / ml, typischerweise 30 – 50 ml P2 – Virus pro 800 ml Zellen in einem 2 – L Schikanekolben. HINWEIS: Es wird nicht mehr als 80 ml P2 – Virus seit dem HEK293s GnTI- empfohlen zu verwenden – Zellen langsam wachsen und kann in pH unrentabel werden aufgrund einer Änderung. Sf9 Medien ist saurer als die 293 Expression Media. 12 bis 16 h nach der Infektion, Natriumbutyrat in einer Konzentration von 10 mM aus einer 1 M Stammlösung hinzuzufügen. 48 – 60 h nach der Infektion Ernte Zellen durch Zentrifugation bei4.000 xg für 15 min. Entfernen Sie den Überstand. Die Zellen in 150 ml TBS, 2 uM S -Citalopram oder andere SERT – Inhibitoren und bei -80 ° C bis sie bereit zur Reinigung. 4. Affinitätsreinigung des Serotonin-Transporter für Immunisierung und Kristallisation Auftauen Zellen aus 10 l Kultur in warmem Wasser (ca. 30 ° C) und Resuspendieren von schnell bis zur Homogenität durch eine 10 ml-Pipette vorbei. Bereiten Reinigungslösung zur Solubilisierung (150 ml): 80 mM Tris, pH 8, 150 mM NaCl, enthaltend 40 mM C12M, 5 mM CHS und Protease-Inhibitor-Cocktail. Fügen alle Zellen in ein Becherglas mit einem Rührstäbchen und fügen alle der Waschmittellösung zu den Zellen unter Rühren. bei 4 ° C solubilisiert unter Rühren für 1 h. Spin-Lysat bei 8000 xg für 15 min bei 4 ° C. Entsorgen Pellet und umfüllen Überstand in saubere Ultrazentrifuge Rohre. Spin bei 100.000 × g für 1 h in einem ultracentrifuge. Pellet verwerfen und Filterüberstand durch ein 0,2 um-Filter. Passieren Lysat über 10 ml Strep Affinitätsharz in eine Säule gepackt eine peristaltische Pumpe in Waschpuffer äquilibriert: 1 mM C12M, 0,2 mM CHS, 5% Glycerol, 25 uM Lipid (1-Palmitoyl-2-oleoyl- sn – glycero 3-phosphocholin, 1-Palmitoyl-2-oleoyl- sn – glycero-3-phosphoethanolamin und 1-Palmitoyl-2-oleoyl- sn – glycero-3-phosphoglycerin bei einem molaren Verhältnis von 1: 1: 1) und 1 uM S -Citalopram oder SSRI in TBS. Verbinden Strep-Affinitätssäule mit einem Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC) -System und Waschkolonne mit 2 ml / min mit 66 ml (6,6 Säulenvolumina) Waschpuffer. Elute gereinigtes Protein in demselben Puffer mit 5 mM Desthiobiotin ergänzt mit 0,5 ml / min unter Verwendung von 33 ml (3,3 Säulenvolumen) des Puffers. Sammeln Sie 1-ml-Fraktionen; Die Peakfraktionen werden ~ 10 ml sein. Gereinigtes Protein kann für 2 bei 4 ° C gelagert werden – 3 d, falls gewünscht. HINWEIS: Die Gesamtausbeute wird 3 sein -4 mg SERT CC und 1 mg SERT IC. Eine Extinktion von 2 AU bei 280 nm ist auf 1 mg / mL SERT gleich. 5. Rekonstitution der Transporter in Liposome für Immunization Bereiten Sie Liposomen, die Asolectin: Cholesterin: Lipid A: Gehirn polare Lipid (Mol-Verhältnis 60: 17: 3, 20). Auflösen Lipiden in 1 ml Chloroform und werden 40 mg Gesamtlipid in einen 100 ml-Glasrundkolben, bei dem angegebenen Molverhältnis. Verdunsten Chloroform mindestens 1 h im Vakuum mit dem Rundkolben in warmem Wasser drehen, etwa 30 ° C. Rehydrieren Lipiden durch 10 ml TBS hinzugefügt wird. Inkubieren in Puffer für 10 min. Frieren Sie das Lipid , indem der Kolben in flüssigem N 2. Auftauen. Tauchen kugelförmigen Boden des Kolbens in einen Becher mit warmem Wasser gefüllt ist, etwa 30 ° C. Beschallen in einem Ultraschallbad für 5 min. Vortex und wiederholen Schritte 5.1.3 – 5.1.4 10-mal oder bis zum Lipidvollständig von dem Boden resuspendiert und bildet eine trübe Suspension. Extrudieren die gesamte Lipidmischung zweimal durch 200 nm-Filter. Das Lipid wird als milchige Suspension vor der Extrusion erscheinen; danach wird es durchscheinend sein. Sie nicht auf einmal die gesamte Lipid-Mischung in den Extruder hinzufügen, wie es verstopft werden kann, was zu einem Verlust der Probe. Spin Lipiden bei 100.000 xg für 20 min und resuspendieren in 0,5 bis 1 ml TBS mit einer Konzentration von 40 mg / mL. Konzentrat gereinigter SERT IC 250-500 & mgr; l unter Verwendung eines 100 kDa MWCO Zentrifugen Protein Konzentrator auf 2 – 4 mg / mL und sättigen Liposomen mit 5 mM C12M. Hinzufügen gereinigter SERT dem Waschmittel: Lipidgemisch in 1 ml Endvolumen. Entfernen C12M von 3 aufeinanderfolgenden Zugaben von 80 mg / ml hydrophobes Absorptionsharz. Für die ersten 2 Additionen, mit Harz unter Rotation für 2 h bei 4 ° C inkubieren. Entfernen Harz, indem sie durch Glaswolle. Führen Sie die abschließenden Inkubation mit Harzüber Nacht. Konzentrat Proteo durch Zentrifugation bei 100.000 × g für 20 min. Überstand verwerfen und Pellet in 250-500 ul von TBS. Zugabe von 10 & mgr; M Endkonzentration von S -Citalopram zu dem rekonstituierten Protein nach der endgültigen Entfernung des Harzes. Solubilisieren 2,5 ul der Proteoliposomen in SDS-PAGE Beladungspuffer (62,5 mM Tris, pH 6,8, 10% Glycerin, 2% SDS, 0,01% Bromphenolblau, 100 mM DTT) und auf einem SDS-PAGE-Gel bei 200 V für 1 h, dass SERT, um sicherzustellen, wurde erfolgreich wiederhergestellt. Proteoliposomen können jeder Immunisierung vor bei -80 ° C in Aliquots für die Langzeitlagerung und aufgetaut auf Eis gelagert werden. 6. Screening für Antikörper 3D-Epitope erkennen Bildschirm Hybridomzellinien durch Western-Blot. Antikörper, die SERT erkennen durch Western-Blot binden wahrscheinlich lineare Epitope und wird wahrscheinlich nicht für strukturelle Untersuchungen nützlich sein. Mix 1 ug purified SERT IC oder SERT CC und auf einem 4-15% SDS-PAGE – Gel bei 200 V für 1 h. Transfer auf eine Nitrocellulose Membran bei 200 mA für 30 min unter Verwendung von Towbin-Puffer (25 mM Tris, 192 mM Glycin, 20% (v / v) Methanol, 0,1% SDS). Die Membran kann getrocknet und bei Raumtemperatur unbegrenzt gelagert werden. Rewet-Membran mit 10% Methanol und Waschen mit PBS (10 mM Phosphat, pH 7,4, 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl). Blockieren mit 5% Milchpulver in PBS für 30 min bei RT. Waschen mit PBS und Inkubation mit 1 & mgr; g / ml Antikörper in PBS mit 0,1% Milch. Waschen ausgiebig mit PBS 0,1% Tween-20 enthält. Inkubieren mit Ziegen-Antikörper anti-Maus an einen IR-Farbstoff konjugiert verdünnt 1: 10.000 in PBS mit 0,1% Tween 20 und 0,1% Milch. Waschen Sie ausgiebig und scannen, ein Abbildungssystem verwendet wird. Mischungs Hybridomüberstand western negativen Antikörper mit 100 nM SERT CC Protein enthält , mit einem Molverhältnis von 1: 2 (SERT: mAb) in 200 & mgr; l TBS mit 1 mM C12M, 0,2 mM CHS und 1 uM S -Citalopram. Zentrifuge bei 100.000 xg für 20 min. Analysieren Überstand, der SERT-mAb – Komplexe und Analyse durch Fluoreszenz-Detektions Grßenausschlußchromatographie (FSEC) 8. Entsorgen Sie das Pellet. Auflagen 100 & mgr; l Überstand auf einer Größenausschlusssäule mit 0,5 ml / min eine High Performance Liquid Chromatography (HPLC) -System mit einem Fluoreszenz-Detektor ausgestattet war (Excitation: 480 nm, Emission: 510 nm) Laufpuffer enthält, TBS, 0,4 mM Lauryl- Maltose Neopentylglykol und 1 uM S -Citalopram. Antikörper, die Komplexe bilden, führt dazu, dass das GFP-Fusionsprotein zu eluieren früher als der freie transporter aus der Größenausschluss-Säule. Verdünnen Komplexe bis 10, 1, 0,1 nM in 200 ul TBS mit 1 mM C12M, 0,2 mM CHS und 1 uM S -Citalopram und Rerun FSEC. Antikörper, die den Transporter Spitze bei niedrigen nanomolaren Konzentrationen noch verschieben können, sindhohe Affinität Bindemittel und gute Kandidaten für Strukturuntersuchungen. Retest Bindung durch FSEC in Gegenwart von 1 mM Serotonin. Antikörper, die spezifisch die SSRI gebundene Konformation erkennen wird nicht in Gegenwart des Substrats binden. Antikörper, die ein 3D-Epitop erkennen, das als Ergebnis der Konformation nicht ändert binden, unabhängig von der vorhandenen Liganden. Mischen Sie paarweise verschiedene Kombinationen von Antikörpern und testen Bindung von FSEC. Antikörper, die verschiedene Epitope erkennen verursacht SERT früher zu eluieren, wenn miteinander kombiniert im Vergleich zu einer einzelnen Antikörperbindung. Für die erste Strukturstudien, wählen Sie die höchste Affinität Antikörper, die 3D-Epitope erkennen. 7. Expression von Antikörperfragment in Sf9-Zellen Clone variablen und konstanten Domänen des Fab durch PCR in den Insekten-Expressionssystem für die Expression in Sf9-Zellen unter Verwendung von Standardprotokollen. Transfizieren 1 x 10 6 Sf9 – Zellen mit 5 ug Bacmid DNA , die die leichten und schweren Ketten des 8-His – markierten 8B6 Fab mit einer GP67 Sekret – Sequenz , die (gemäß Abschnitt 3.4). Ernte P1 Virus 96 Stunden nach der Transfektion und füge 500 ul P1 Virus auf 1 l Sf9 Zellen bei einer Dichte von 1 x 10 6 Zellen / ml in einer 2 l – Kolben zu P2 – Virus zu machen. Infect Zellen für 96 h bei 27 ° C. Ernte-P2-Virus (gemäß Abschnitt 3.6). Infect 6 L von Sf9 Zellen bei einer Dichte von 2 – 3 x 10 6 Zellen / ml mit einer MOI von 2 mit P2 – Virus, in der Regel 40 – 50 ml pro Kolben mit 1 l Sf9 – Zellen in je 2 l – Kolben. Ernten Sie die Zellen etwa 96 h nach Infektion. 50 ml Phosphatpuffer, pH 8 bei einer Endkonzentration von 50 mM zu den Zellen und Schleudern bei 4.000 xg für 20 min. Entsorgen Sie das Zellpellet und Filterüberstand durch ein 0,2 um Filter tangentialen Strömungszelle. Sammeln Sie den Überstand und lagern bei 4 ° C für 2 – 3 Tage, falls gewünscht. <p class="jove_title"> 8. Reinigung von Antikörperfragmenten aus Sf9 Supernatant Konzentrat Sf9-Überstand eine 30 kDa Molekulargewicht Cut Off (MWCO) tangentiale Strömungszelle auf etwa 400 unter Verwendung von – 800 mL. Hinzufügen Imidazol, pH 8 bei einer Endkonzentration von 10 mM und 10 ml His-Tag-Affinitätsharz. Rühren Sie in einem Becher für 1 h bei 4 ° C. Sammeln His-tag-Affinitätsharz durch Zentrifugation bei 2.000 xg für 5 min. Überstand verwerfen. Packen His-Tag-Affinitätsharz in eine Säule und eine Verbindung zu einem FPLC. His-tag-Affinitätsharz mit 2 ml / min mit 66 ml Wasch (6,6 Säulenvolumen) von 50 mM Phosphat, pH 8, 150 mM NaCl, 25 mM Imidazol. Elute 8B6 Fab in 33 ml 50 mM Phosphat, pH 8, 150 mM NaCl, 250 mM Imidazol. Sammeln Sie 1-ml-Fraktionen. Verdünnte affinitätsgereinigtem Fab mit einem 10-fachen Volumen eiskaltem 20 mM Acetat, pH 5. Binden Fab zu einer 1 ml-Kationenaustauschsäule eine peristaltische Pumpe bei 1 ml / min verwendet wird. Separate Fab unter Verwendung einer 30 ml linear Gradienten von NaCl (0-500 mM) in 20 mM Acetat pH 5,5 eine FPLC unter Verwendung. Fab wird bei ~ 300 mM NaCl als einzelner Peak eluieren. Analyse auf einem 12,5% SDS-PAGE-Gel unter Verwendung von Probenpuffer, enthaltend 100 mM DTT. Die schweren und leichten Ketten des 8B6 Fab wird bei 27 und 25 kDa laufen, die jeweils auf einem reduzierenden SDS-PAGE-Gel. Pool Fab enthaltenden Fraktionen und konzentriere, um mindestens 10 bis 15 mg / ml eine 30 kDa MWCO Protein Konzentrator in einer Schwingbecherzentrifuge bei 3.000 x g verwendet. Einstellen auf pH 8 durch Zugabe von 1 M Tris pH 8 bis zu einer Endkonzentration von 50 mM und speichern gereinigt Fab für Langzeit bei 4 ° C. 30 mg – Die Gesamtausbeute beträgt 25 sein. Eine Absorption von 1,4 AU bei 280 nm ist auf 1 mg / ml 8B6 Fab gleich. 9. Bildung von Transporter-Antikörper-Komplexe und Trennung durch Grßenausschlußchromatographie Zur Kristallisation reinigen die SERT CC durch Streptokokken Affinitätschromatographie in C12M , wie zuvor beschrieben (Abschnitt 4). <li> Digest mit Thrombin zu entfernen Tags (1: 100 w / w) und EndoH (1:10 w / w) O / N bei RT. Konzentrat auf 250-300 & mgr; l unter Verwendung eines 100 kDa MWCO Zentrifugen Protein Konzentrator auf eine Proteinkonzentration von 10 mg / mL. Mischungs konzentrierter SERT mit Fab bei einem molaren Verhältnis von 1: 1,2 in einem Volumen von weniger als 500 & mgr; l. Zentrifuge bei 100.000 × g bei 4 ° C für 20 min. Sammeln Überstand SERT-Fab-Komplex enthält. Verwerfen Pellet. Separate durch Size Exclusion Chromatography (SEC) eine FPLC auf einer Größenausschluss-Säule, äquilibriert in TBS unter Verwendung supplementiert mit 40 mM n-Octyl-β-D-maltosid (C8M), 0,5 mM CHS, 5% Glycerol, 25 uM Lipid (wie in Schritt 4.5) und 1 uM S -Citalopram bei 0,5 mL / min. Sammeln 0,5-ml-Fraktionen und zu analysieren, auf 4-15% SDS-PAGE-Gelen sowie durch Tryptophan-Fluoreszenz durch SEC. GFP markiert SERT bei etwa 80 kDa auf einem SDS-PAGE-Gel laufen gelassen wird. Nach dem Entfernen des Termini und N-gebundene Zucker werden sie als 45-kDa-Protein ausgeführt. Determine die Fraktionen durch die Zusammenlegung nur die Fraktionen zu kombinieren, die wie durch Analyse der Fraktionen durch Tryptophan-Fluoreszenz SEC beurteilt monodispers (Anregung: 280, Emission: 335 nm). Store gereinigt SERT-8B6-Komplex bei 4 ° C für bis zu 1 Woche. 10. Kristallisation von Transporter-Antikörper-Komplexe durch Tropfen Hanging Vor der Kristallisation konzentriert Peakfraktionen aus der SEC Trennung des SERT-8B6-Komplex zu 2 mg / ml eine 100 kDa MWCO Zentrifugen Protein Konzentrator verwendet wird. Eine Extinktion von 2 AU bei 280 nm gleich 1 mg / mL. Fügen Sie zusätzliche Fab in einem Verhältnis von 1: 0,05 Komplex: frei Fab. In 10 uM frei S -Citalopram. Zentrifuge bei 100.000 × g bei 4 ° C für 20 min. Sammeln Überstand mit dem SERT-Fab-Komplex enthält. Verwerfen Pellet. Richten Sie bei 4 ° C , um einen hängenden Tropfen 24-Well – Bildschirm gemäß Tabelle 1. Beugungs Qualität Kristalle über Reservoir Lösungen wachsenenthaltend 100 mM Tris-NaOH, pH 8,5, 25 bis 125 mM KCl, 32,5 bis 34% PEG 400 und 0,5% 6-Aminohexansäure. HINWEIS: Die Verwendung Tris eingestellt mit NaOH auf pH 8,5 als Puffer. verwenden Tris-Base nicht mit HCl eingestellt. Der Bildschirm kann in 2 ml-Röhrchen hergestellt und verwendet werden, bis Sie fertig sind. Achten Sie darauf, genau zu pipettieren PEG 400 eine positive Verdrängungspipette, da es extrem zähflüssig ist! Pipette 500 ul jeder Vorratslösung in einem niedrigen Profil von 24-Well-Platte mit einem Dichtmittel in jede Vertiefung aufgetragen. Pipette 1,5, 1,75 und 2 ul der SERT-8B6-Komplex auf einem 18 mm silikonisierten Deckglas. Pipette 1 ul Vorratslösung auf der Proteinprobe. HINWEIS: Die Platte mit Dichtmittel bereits aufgebracht Rand der Vertiefungen erworben wurde. Bewerben Schieber auf dem 24-Loch mit den Tropfen der Reservoirlösung zugewandt und sofort verschließen durch Drücken Deckglas auf Dichtmittel auf jede Vertiefung vorge angewendet. Weiter, bis alle 24 Brunnen wurden eingerichtet. </li> Lassen Sie die fertige Platte in einem gut isolierten Raum bei 4 ° C. mindestens 3 Tage nicht stören Platten für HINWEIS: Einkristalle innerhalb von ca. 3 Tage und wachsen zu 100-175 & mgr; m nach 14 Tagen erscheinen wird. Ernte – Kristalle in Kryoschleifen und direkt Flash-cool in flüssigem N 2 vor der Röntgenbeugungsdatenerfassung. Bei Bedarf finden zusätzliche Kristallisationsbedingungen durch breites Screening mit hängenden Tropfen. Drei Tropfen mit Protein: Fällmittel Verhältnisse von 2: 1, 1,5: 1, 1: 1. Wenn ein Roboter zur Verfügung steht, dann gründen 100-150 nL Tropfen über 70 & mgr; l Reservoirlösung in einer 96-Well-Platte. Größere 3D-Kristalle können in 24-Mulden gezüchtet werden. Ergebnis basierend auf dem Aussehen des Tropfens: 0, klar; 1, Staub; 2, körniger Niederschlag; 3, Phasentrennung; 4, mikrokristallin; 5, Nadeln; 6, Platten; 7, 3D-Kristalle. Richten Sie die Kristallisation durch Tropfen hängen Methoden in 24-Vertiefungen wie um neu identifizierte cond oben beschriebenitions.