Thermostabilization, Espressione, purificazione e cristallizzazione della umana trasportatore della serotonina associato a<em> S</em> -citalopram

1. Trasfezione di Adherent HEK293S GnTI – Celle per termostabilità schermo Preparare Poly-D-lisina (PDL) Rivestiti piastre da 96 pozzetti. Eseguire il lavoro in una cappa a flusso laminare sterile. Filtrare una soluzione 25 mg / mL di (PDL), peso molecolare 70,000-150,000 Da, utilizzando un filtro sterile da 0,2 micron. Aggiungere 50 ml di PDL a ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti Tissue Culture (TC), assicurando il fondo è uniformemente rivestita, ed incubare a temperatura ambiente per 30 min. Aspirare soluzione PDL e lavare con 200 ml di acqua sterile. Lasciare asciugare la piastra all'aria per 2 ore prima di conservazione a 4 ° C. piastre rivestite PDL possono essere conservati a 4 ° C per diverse settimane. Tripsinizzazione delle cellule HEK293S aderenti. Grow HEK293S al 80% di confluenza in 10 cm piatto mantenuta a 37 ° C con 8% di CO 2. Un piatto unico 10 centimetri dovrebbe avere circa 10 milioni di cellule HEK293S. Non utilizzare le cellule dopo 30 passaggi! </li> mezzi Aspirare e lavare con 5 ml di Phosphate-Buffered Saline (PBS). Aggiungere 1 mL di soluzione di tripsina-EDTA (0,25% tripsina, 0,02% EDTA) alle cellule e incubare per 2 minuti a 37 ° C. Aggiungere 10 ml di Modified Eagle Medium di Dulbecco (DMEM) supplementato con 10% siero fetale bovino (FBS) e risospendere le cellule ripetutamente pipettando su e giù con una pipetta sierologica. Pipettare 10 ml di cellule e mescolare con 10 ml di soluzione Trypan blu (0,4%). Determinare la densità delle cellule utilizzando un emocitometro e un microscopio ottico. Non contare le cellule che sono di colore blu come sono morti. Assicurarsi che la vitalità delle cellule è al di sopra del 90%. Accuratamente risospendere tripsinizzati HEK293S GnTI – cellule in DMEM supplementato con 10% FBS ad una densità di 0,5 x 10 6 cellule / ml in un serbatoio pipetta monouso. Circa 5 milioni di cellule HEK293S saranno necessari per ogni piatto. Un totale di 24 costrutti può essere trasfettato su ciascuna piastra usando questo protocol. Usando una pipetta multicanale, aggiungere 100 ml di cellule in ciascun pozzetto di una piastra rivestita PDL. Risospendere le cellule in serbatoio della pipetta dopo riempiendo ogni piatto per assicurare una distribuzione uniforme delle cellule. Incubare le cellule in un incubatore a 37 ° con l'8% di CO 2. Dopo 24 ore, le cellule devono raggiungere circa l'80% di confluenza. 1 h prima di trasfezione sostituire i media. Preparare DNA-trasfezione complessi reagenti per la trasfezione. Per ogni costrutto in background SERT TC ad essere proiettato, mescolare 450 DNA ng con 45 ml di DMEM senza siero e mescolare. Aggiungere 1,6 ml di reagente di trasfezione per 45 ml di DMEM privo di siero e mescolare. Immediatamente aggiungere la soluzione di trasfezione reagente diluita di soluzione di DNA e mescolare. Non mescolare soluzioni in ordine inverso. Attendere 10 – 15 minuti e aggiungere 20 ml di trasfezione miscela reagente / DNA a 4 pozzi. Una volta che tutti i pozzetti sono state trasfettate, mescolare piatto agitandola lentamente indietro di unnd avanti e tornare alla incubatore a 37 °. Dopo 16 – 24 ore sostituire il supporto con DMEM contenente siero e 10 mm butirrato di sodio. Circa 48 ore dopo la trasfezione rimuovere il supporto e sia procedere immediatamente con termostabilità schermo o congelare le cellule a -80 ° C per essere utilizzato in seguito. Le celle possono essere conservati a -80 ° C per diverse settimane. Schermo termostabilità 2. scintillazione di prossimità-based con S -citalopram Incubare le cellule con 200 nM S -citalopram in 25 ml di TBS (Tris-Buffered Saline – 20 mM Tris, pH 8, 100 mM NaCl) per 5 minuti a temperatura ambiente. Solubilizzare le cellule con l'aggiunta di 25 ml di 8 mm n-dodecil-β-D-maltopyranoside (C12M), 1 mM colesterolo hemmisuccinate (CHS), cocktail di inibitori della proteasi (2 mm phenylmethanesulfonyl fluoruro (PMSF), 0,1 mg / ml aprotinina, 4 g / mL pepstatina a, e 4 mg / ml leupeptina) in TBS, e incubando per 1 ora a RT. Aggiungere 50 ml di TBS wiesimo 20 nM [3 H] citalopram (81,7 Ci / mmol), 0,1% di albumina sierica bovina, e 2 mg / mL His-tag saggio di affinità scintillazione di prossimità (SPA) perle a tre pozzetti per ciascuno costrutto. Per l'ultimo anche aggiungere la stessa soluzione elencato ma integrare con 100 micron sertralina per determinare legami non specifici. Assicurarsi che le microsfere His-tag di affinità SPA sono accuratamente miscelati quando si aggiunge alla piastra a 96 pozzetti. Provvedimento vincolante [3 H] citalopram utilizzando un contatore a scintillazione 96 pozzetti a temperatura ambiente con un tempo di conteggio 1 min per bene. Continuare piastre conteggio fino conteggi totali plateau (dopo circa 36 h). piastre di calore per 15 minuti in un blocco di riscaldamento con un coperchio riscaldato a 33 ° C. Misurare [3 H] citalopram vincolante dopo riscaldamento come descritto al punto 2.4. Ripetere il passaggio 2,4-2,5 e cambiare la fase di riscaldamento a 36 ° C, 39 ° C, 45 ° C, 48 ° C, e 51 ° C. Regolare temperature di riscaldamento in funzione della temperatura apparente di fusione (Tm)della proteina bersaglio e la termostabilità del costrutto più stabile. Continuare a riscaldare piatti fino a quando tutti i costrutti hanno bassi conteggi specifici. Analizzare i dati per determinare i valori Tm. Determinare i conteggi totali medi per minuto (CPM) di ogni costruzione di pozzi che non contengono sertralina facendo la media dei 3 pozzi replicati. Determinare il CPM non specifica la media della CPM di ogni sertralina pozzetto contenente in un unico piatto. Calcolare il CPM specifica sottraendo il CPM non specifico dal CPM totale. Calcolare la Tm da un accesso non lineare ad una funzione sigmoidale Boltzmann. Costruisce con un basso CPM specifico a temperatura ambiente (<10% del WT) generalmente non hanno valori precisi Tm. Le mutazioni dei maggior parte dei costrutti termostabili possono essere combinati insieme e sottoposti a screening per additivi aumenti di termostabilità. 3. L'espressione del trasportatore della serotonina umano in HEK293S GnTI <sup> – Celle Trasformare cellule DH10Bac chimicamente competenti con 1 ng di plasmide. Aggiungere plasmide a 50 microlitri di cellule DH10Bac e incubare su ghiaccio per 30 min. cellule DH10Bac shock termico a 42 ° C per 30 sec. Aggiungere 200 microlitri di terreno SOC e incubare a 37 ° C per 4 ore con agitazione. Piatto tutti i batteri su una piastra Luria Broth (LB) contenente 50 mg / ml kanamicina, 7 mg / ml gentamicina, 10 ug / ml di tetraciclina, 100 ug / ml 5-bromo-3-indolil β-D-galattopiranoside, e 40 mg / ml isopropilico β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG). Isolare lacZ – colonie (colonie bianche) derivate a 37 ° C per 2 d su piastre di LB agar. Grow diverse colonie O / N a 37 ° C in 5 ml di LB contenenti antibiotici e isolare il DNA bacmid. Spin down batteri a 1000 xg in una centrifuga per 5 min. surnatante degli scarti. batteri Risospendere con 200 ml di miniprep rBuffer esuspension. batteri Lyse con l'aggiunta di 200 ml di miniprep tampone di lisi e invertendo il tubo dolcemente per 10 volte. Aggiungere 200 ml di tampone di neutralizzazione. Rimuovere frazione insolubile mediante centrifugazione a 14.000 xg per 10 min in una centrifuga. Aggiungere 1 ml di isopropanolo al surnatante e raffreddare a -20 ° C per 20 minuti per precipitare il DNA. Spin a 14.000 xg per 15 min in una centrifuga e scartare il surnatante. Lavare DNA pellet con il 70% EtOH e girare nuovamente a 14000 xg per 15 min. surnatante degli scarti. Aria DNA a secco fino a quando tutti EtOH è evaporato e risospendere in 50 ml di acqua. NOTA: Bacmid DNA dovrebbe essere trasfettato in cellule Sf9 subito per i migliori risultati, ma può anche essere conservato a -20 ° C per diverse settimane. Trasfezione bacmid DNA in 1×10 6 cellule aderenti Sf9 coltivati in una camera umidificata a 27 ° C in un piatto da 6 pozzetti. Eseguire tutte le manipolazioni di coltura cellulare in una cappa a flusso laminare sterile. <li> Rimuovere supporti dalle cellule e aggiungere 2 ml di mezzi freschi Sf9. Aggiungere 5 mg di DNA bacmid a 100 l di Sf9 supporti (soluzione A). Aggiungere 8 ml di una Sf9 reagente di trasfezione cationico-lipidi a 100 ml di Sf9 supporti (soluzione B). Incubare provetta contenente Soluzione B per 5 min. Mescolare provetta contenente soluzione A con soluzione B e incubare a temperatura ambiente per 30 min e aggiungere tutta la soluzione alle cellule Sf9. Dopo 96 h, raccolto surnatante (virus P1) facendo passare attraverso un filtro da 0,2 micron. Il virus P1 può essere conservato per diversi mesi a 4 ° C al buio e riutilizzato per rendere virus P2 come necessario. Aggiungere 100 ml di virus P1 a 1 L di cellule Sf9 ad una densità di 1 x 10 6 cellule / ml in mezzi Sf9. Infettare le cellule per 96 h, crescendo a 27 ° C su un agitatore a 100 rpm. Spin le cellule in una centrifuga a 4000 xg per 15 minuti e il surnatante filtro contenente particelle virali attraverso un filtro da 0,2 micron. Scartare pellet cellulare. determdensità virale ine utilizzando un saggio di placca virale o un contatore virus. La densità virus dovrebbe essere particelle> 1 x 10 8 virali per millilitro. virus P2 può essere conservato a 4 ° C al buio e utilizzato per diversi mesi. Infect 10 L di HEK293S GnTI – cellule 7 crescono in sospensione a 37 ° C con 8% di CO 2 e 85% di umidità su un agitatore a 130 rpm in 293 mezzi di espressione addizionato con 2% FBS ad una molteplicità di infezione (MOI) di 2 e una densità di 3 x 10 6 cellule / ml, tipicamente 30 – 50 mL di P2 virus per 800 ml di cellule in un 2 L sconcertato pallone. NOTA: Non è consigliabile usare più di 80 ml di virus P2 poiché il HEK293S GnTI – le cellule crescono lentamente e può diventare impraticabile a causa di un cambiamento di pH. SF9 media è più acida rispetto al supporto 293 espressione. 12 – 16 h post-infezione, aggiungere butirrato di sodio ad una concentrazione di 10 mM da uno stock 1 M. 48 – 60 ore dopo l'infezione, Celle di raccolta per centrifugazione a4.000 xg per 15 min. Rimuovere il surnatante. Risospendere le cellule in 150 ml di TBS, 2 mM S -citalopram o altri inibitori SERT e conservare a -80 ° C fino al momento della purificazione. 4. affinità purificazione del trasportatore della serotonina per le vaccinazioni e cristallizzazione Scongelare cellule da 10 L di coltura in acqua calda (circa 30 ° C) e risospendere da rapidamente passando attraverso un mL pipetta 10 fino ad omogeneità. Preparare una soluzione detergente per la solubilizzazione (150 ml): 80 mM Tris, pH 8, 150 mM NaCl contenente 40 mM C12M, 5 mM CHS, e inibitore della proteasi cocktail. Aggiungere tutte le celle in un becher di ancoretta e aggiungere tutta la soluzione detergente cellule agitando. Solubilizzare a 4 ° C per 1 h sotto agitazione. Spin lisato a 8000 xg per 15 min a 4 ° C. Eliminare pellet e supernatante decantare in provette ultracentrifuga pulite. Spin a 100.000 xg per 1 h in un ultracentrifuge. Scartare pellet e filtro surnatante attraverso un filtro da 0,2 micron. Passare lisato oltre 10 ml di Strep resina di affinità imballato in una colonna utilizzando una pompa peristaltica equilibrata in tampone di lavaggio: 1 mm C12M, 0,2 mM CHS, 5% glicerolo, 25 mM lipidi (1-palmitoil-2-oleoyl- sn -glycero- 3-phosphocholine, 1-palmitoil-2-oleoyl- sn -glycero-3-fosfoetanolamina, e 1-palmitoil-2-oleoyl- sn -glycero-3-phosphoglycerol in un rapporto molare di 1: 1: 1), e 1 mM S -citalopram o SSRI in TBS. Collegare l'affinità delle colonne Strep ad un sistema veloce di proteine ​​cromatografia liquida (FPLC) e lavare colonna a 2 mL / min con 66 ml (volumi 6,6 colonna) di tampone di lavaggio. Eluire proteina purificata in stesso tampone integrato con 5 mM desthiobiotin a 0.5 mL / min con 33 mL (volumi 3,3 colonna) di tampone. Raccogliere 1 frazioni mL; le frazioni di picco sarà ~ 10 mL. proteina purificata può essere conservato a 4 ° C per 2 – 3 d se desiderato. NOTA: Resa totale sarà di 3 -4 mg di SERT CC e 1 mg di SERT IC. Un'assorbanza di 2 AU a 280 nm è pari a 1 mg / mL SERT. 5. Ricostituzione del trasportatore in liposomi per l'immunizzazione Preparare liposomi contenenti asolectin: colesterolo: lipide A: cervello polare lipidi (rapporto molare 60: 17: 3: 20). Sciogliere lipidi in 1 mL di cloroformio e aggiungere 40 mg di lipide totale in un pallone a fondo tondo vetro da 100 mL con un rapporto molare indicato. Evaporare cloroformio per almeno 1 h sotto vuoto con il pallone a fondo tondo rotante in acqua calda a 30 ° C. Reidratare lipidi con l'aggiunta di 10 ml di TBS. Incubare in tampone per 10 min. Blocca il lipide mettendo il pallone in liquido N 2. Scongelare. Immergere fondo sferica del pallone in un bicchiere pieno d'acqua calda, circa 30 ° C. Sonicare in un bagno sonicatore per 5 min. Vortex e ripetere i punti 5.1.3 – 5.1.4 10 volte o fino a quando il lipideè completamente risospeso dal basso e forma una sospensione torbida. Estrudere la miscela lipidica due volte attraverso 200 filtri nm. I lipidi apparirà come una sospensione lattiginosa prima dell'estrusione; in seguito sarà traslucido. Non aggiungere l'intera miscela lipidica all'estrusore contemporaneamente come può intasarsi, con conseguente perdita di campione. Spin lipidi a 100.000 xg per 20 min e risospendere in 0,5 – 1 ml della TBS ad una concentrazione di 40 mg / mL. Concentrato purificato SERT IC a 250 – 500 ml utilizzando una proteina concentratore 100 kDa MWCO centrifuga a 2-4 mg / mL e saturare liposomi con 5 mM C12M. Aggiungere SERT purificato al detersivo: miscela lipidica in 1 ml di volume finale. Rimuovere C12M da 3 successive aggiunte di 80 mg / ml di resina idrofoba assorbimento. Per i primi 2 aggiunte, incubare con resina con rotazione per 2 ore a 4 ° C. Rimuovere resina passando attraverso lana di vetro. Eseguire l'incubazione finale con resinadurante la notte. Concentrato proteoliposomi per centrifugazione a 100.000 xg per 20 min. Gettare il surnatante e risospendere pellet in 250-500 ml di TBS. Aggiungere 10 mM concentrazione finale di S -citalopram alla proteina ricostituito a seguito della rimozione finale di resina. Solubilizzare 2,5 ml di proteoliposomi nel buffer SDS-PAGE di carico (62,5 mM Tris, pH 6,8, 10% glicerolo, 2% SDS, 0,01% blu di bromofenolo, 100 mM DTT) ed eseguire su un gel SDS-PAGE a 200 V per 1 h per garantire che SERT è stato ricostituito con successo. Proteoliposomi possono essere conservati a -80 ° C in aliquote per la conservazione a lungo termine e scongelati in ghiaccio prima di ogni immunizzazione. 6. Screening per anticorpi Riconoscere epitopi 3D linee cellulari derivate da ibridomi schermo Western Blot. Gli anticorpi che riconoscono SERT mediante western blot probabilmente si legano epitopi lineari e probabilmente non essere utile per studi strutturali. Mescolare 1 mg di purifiEd SERT IC o SERT CC ed eseguire su un 4 – gel SDS-PAGE 15% a 200 V per 1 ora. Trasferire una membrana di nitrocellulosa a 200 mA per 30 minuti utilizzando tampone Towbin (25 mM Tris, 192 mM glicina, 20% (v / v) di metanolo, 0,1% SDS). La membrana può essere essiccati e conservati indefinitamente a temperatura ambiente. Membrana rewet con il 10% di metanolo, e lavare con PBS (10 mM fosfato, pH 7.4, 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl). Blocco con 5% di latte in polvere in PBS per 30 minuti a RT. Lavare con PBS e incubare con 1 mg / mL di anticorpi in PBS con 0,1% di latte. Lavare a lungo con PBS contenente 0,1% di Tween-20. Incubare con anticorpo di capra anti-topo coniugato con un colorante IR diluito 1: 10.000 in PBS con 0,1% Tween 20 e latte 0,1%. Lavare ampiamente e eseguire la scansione utilizzando un sistema di imaging. Mescolare ibridoma surnatante contenente anticorpi negativi occidentali con 100 nM proteina SERT CC utilizzando un rapporto molare di 1: 2 (SERT: mAb) in 200 ml TBS con 1 mM C12M, 0,2 mM CHS, e 1 micron S -citalopram. Centrifugare a 100.000 xg per 20 min. Analizzare surnatante contenente complessi SERT-mAb e analizzare da fluorescenza di rilevamento Size Exclusion Chromatography (FSEC) 8. Eliminare il pellet. Eseguire 100 ml di surnatante su una colonna di esclusione sterica a 0.5 mL / min utilizzando un sistema High Performance Liquid Chromatography (HPLC) equipaggiato con un rivelatore a fluorescenza (eccitazione: 480 nm, emissione: 510 nm) usando un tampone di corsa contenente TBS, 0,4 mM lauril glicole neopentilico maltosio, e 1 micron S -citalopram. Gli anticorpi che formano complessi causerà la proteina GFP-fusion per eluire prima di quanto il trasportatore libera dalla colonna dimensione-esclusione. Diluire complessi a 10, 1, 0,1 nM a 200 microlitri TBS con 1 mM C12M, 0,2 mM CHS, e 1 micron S -citalopram ed eseguire nuovamente FSEC. Anticorpi che può ancora spostare il picco trasportatore a basse concentrazioni nanomolari sonoleganti affinità alti e buoni candidati per studi strutturali. Ritestare impegnativa FSEC in presenza di 1 mM serotonina. Anticorpi che riconoscono specificamente la conformazione SSRI vincolato non si legano in presenza del substrato. Anticorpi che riconoscono un epitopo 3D che non cambia a causa della conformazione legheranno indipendentemente ligando presente. Mescolare due a due diverse combinazioni di anticorpi e testare vincolante per FSEC. Gli anticorpi che riconoscono epitopi distinti causerà SERT per eluire prima, quando combinati insieme, rispetto al legame di un singolo anticorpo. Per gli studi strutturali iniziali, selezionare i più elevati anticorpi affinità che riconoscono epitopi 3D. 7. L'espressione di anticorpi Frammento in cellule Sf9 Clone domini variabili e costanti di Fab mediante PCR nel sistema di espressione degli insetti per l'espressione in cellule Sf9 utilizzando protocolli standard. Trasfezione 1 x 10 6 celle Sf9 con 5 mg di Bacmid DNA che codificano per le catene leggere e pesanti della 8-His tag 8B6 Fab con una sequenza di secrezione GP67 (di cui al punto 3.4). Harvest P1 virus 96 h posttransfection e aggiungere 500 ml di virus P1 a 1 L di cellule Sf9 ad una densità di 1 x 10 6 cellule / ml in un pallone da 2 L di rendere virus P2. Infettare le cellule per 96 ore a 27 ° C. Harvest virus P2 (di cui al punto 3.6). Infect 6 L di cellule Sf9 ad una densità di 2 – 3 x 10 6 cellule / ml con una MOI di 2 con virus P2, tipicamente 40 – 50 ml per beuta con 1 L di cellule Sf9 a ciascun pallone da 2 L. Celle di raccolta di circa 96 h postinfection. Aggiungere 50 mL di tampone fosfato, pH 8 ad una concentrazione finale di 50 mM alle cellule e centrifugare a 4000 xg per 20 min. Eliminare il pellet di cellule e filtro surnatante con una cella di flusso tangenziale 0,2 micron filtro. Raccogliere il surnatante e conservare a 4 ° C per 2 – 3 giorni se lo si desidera. <p class="jove_title"> 8. Purificazione di anticorpi Frammenti da Sf9 Surnatante Concentrato surnatante Sf9 utilizzando un 30 kDa peso molecolare Cut Off (MWCO) cella di flusso tangenziale a circa 400-800 ml. Aggiungere imidazolo, pH 8 ad una concentrazione finale di 10 mM e 10 mL di resina di affinità His-tag. Mescolare in un bicchiere per 1 ora a 4 ° C. Raccogliere His-tag resina affinità per centrifugazione a 2.000 xg per 5 min. surnatante degli scarti. Confezione His-tag resina di affinità in una colonna e connettersi a un FPLC. Lavare His-tag resina di affinità a 2 mL / min con 66 ml (volumi 6,6 colonna) di 50 mm di fosfato pH 8, 150 mM NaCl, 25 mM imidazolo. Eluire 8B6 Fab in 33 ml di 50 mM di fosfato pH 8, 150 mM NaCl, 250 mM imidazolo. Raccogliere 1 ml frazioni. Diluire affinità purificato Fab con un volume 10 volte di acetato 20 mM ghiacciato, pH 5. Associare Fab ad una colonna di scambio cationico 1 mL utilizzando una pompa peristaltica a 1 mL / min. Separata Fab utilizzando un mL lin 30gradiente orecchio di NaCl (0 – 500 mm) 20 mM acetato pH 5,5 utilizzando un FPLC. Fab sarà eluire come un singolo picco a ~ 300 mM NaCl. Analizzare su un gel SDS-PAGE 12,5% utilizzando tampone contenente 100 mM DTT. Le catene pesanti e leggere di 8B6 Fab verrà eseguito a 27 e 25 kDa, rispettivamente, su un gel SDS-PAGE riducente. frazioni Pool contenenti Fab e concentrarsi per almeno 10 – 15 mg / mL con un kDa MWCO concentratore 30 proteine ​​in un secchio centrifuga oscillante a 3.000 x g. Aggiustare il pH a 8 con l'aggiunta di 1 M Tris pH 8 ad una concentrazione finale di 50 mM e conservare purificato Fab per lungo a + 4 ° C. Resa totale sarà di 25 – 30 mg. Un'assorbanza di 1,4 AU a 280 nm è pari a 1 mg / ml di 8B6 Fab. 9. formazione di complessi Transporter-anticorpo e la separazione da Size Exclusion Chromatography Per la cristallizzazione, purificare il SERT CC da Strep cromatografia di affinità in C12M come descritto in precedenza (sezione 4). <li> Digest con trombina per rimuovere i tag (1: 100 w / w) e Endoh (1:10 w / w) O / N a RT. Concentrato a 250 – 300 ml utilizzando un kDa MWCO proteine ​​centrifuga concentratore 100 ad una concentrazione proteica di 10 mg / mL. Mescolare SERT concentrato con Fab ad un rapporto molare di 1: 1,2 in un volume inferiore a 500 microlitri. Centrifugare a 100.000 xg a 4 ° C per 20 min. Raccogliere il surnatante contenente complesso SERT-Fab. pellet di scarto. Separato da Size Exclusion Chromatography (SEC) utilizzando un FPLC su una colonna di esclusione dimensionale equilibrata in TBS completato con 40 mM n-ottil-β-D-maltoside (C8M), 0.5 mM CHS, 5% glicerolo, 25 mM lipidi (come nel passo 4.5) e 1 mM S -citalopram a 0,5 mL / min. Raccogliere 0,5 ml frazioni e analizzare il 4 – 15% gel SDS-PAGE, così come con la fluorescenza del triptofano da SEC. GFP tagged SERT verrà eseguito a circa 80 kDa su un gel SDS-PAGE. Dopo la rimozione dei capolinea e gli zuccheri N-linked sarà eseguito come una proteina di 45 kDa. Determine che le frazioni di combinare mettendo in comune solo le frazioni che sono monodisperse come giudicato da analisi delle frazioni da triptofano fluorescenza SEC (Eccitazione: 280, emissione: 335 nm). Conservare purificato complesso SERT-8B6 a 4 ° C per un massimo di 1 settimana. 10. La cristallizzazione di complessi Transporter-anticorpo per impiccagione di goccia Prima della cristallizzazione, concentrare frazioni di picco dalla separazione SEC del complesso SERT-8B6 a 2 mg / ml usando un kDa MWCO proteine ​​centrifuga concentratore 100. Un'assorbanza di 2 AU a 280 nm è pari a 1 mg / mL. Aggiungere ulteriore Fab con un rapporto di 1: 0.05 complesso: gratuito Fab. Aggiungere 10 micron libera S -citalopram. Centrifugare a 100.000 xg a 4 ° C per 20 min. Raccogliere il surnatante contenente il complesso SERT-Fab. pellet di scarto. Impostare uno schermo da 24 pozzetti goccia pendente a 4 ° C in base alla tabella 1. Grow cristalli di qualità diffrazione rispetto alle soluzioni serbatoiocontenente 100 mM Tris-NaOH, pH 8,5, a 25 – 125mM KCl 32,5 – 34% PEG 400, e 0,5% di acido 6-amminoesanoico. NOTA: Utilizzare Tris regolato con NaOH a pH 8,5 come un buffer. Non utilizzare Tris base regolare con HCl. Lo schermo può essere preparato in 2 mL e utilizzato fino al termine. Fare attenzione a pipetta accuratamente PEG 400 con una pipetta a spostamento positivo in quanto è estremamente viscoso! Pipettare 500 ml di ciascuna soluzione serbatoio in un basso profilo 24 pozzetti con sigillante applicato a ciascun pozzetto. Pipetta 1.5, 1,75, e 2 ml del complesso SERT-8B6 su un 18 millimetri di vetro siliconato di copertura antiscivolo. Pipettare 1 ml di soluzione serbatoio sopra il campione proteico. NOTA: La piastra è stata acquistata con sigillante già applicato al bordo dei pozzetti. Applicare vetrino di copertura al 24 pozzetti con le gocce di fronte alla soluzione di serbatoio e sigillare immediatamente premendo copertura antiscivolo sul sigillante pre-applicato ad ogni bene. Continuare fino a quando tutti i 24 pozzi sono stati istituiti. </li> Lasciare il piatto finito in una stanza ben isolata a 4 ° C. Non disturbare le piastre per almeno 3 giorni NOTA: cristalli singoli appariranno entro circa 3 giorni e crescere per 100-175 micron dopo 14 giorni. Cristalli Harvest in cryoloops e direttamente flash-cool in N liquido 2 prima di raggi X la raccolta dei dati di diffrazione. Se necessario, trovare condizioni di cristallizzazione supplementari di ampia proiezione con gocce sospese. Utilizzare tre gocce con proteine: rapporti precipitanti di 2: 1, 1.5: 1, 1: 1. Se un robot è disponibile, quindi impostare 100-150 nL gocce più di 70 ml di soluzione di riserva in una piastra da 96 pozzetti. cristalli 3D più grandi possono essere coltivate in 24 pozzi. Punteggio in base alla comparsa della goccia: 0, chiaro; 1, della polvere; 2, precipitato granulare; 3, separazione di fase; 4, microcristallina; 5, aghi; 6, piatti; 7, cristalli 3D. Impostare la cristallizzazione per impiccagione metodi goccia in 24 pozzi come sopra descritto intorno cond recentemente identificatiizioni.