JoVE Journal > Bioengineering
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
русский

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Bioengineering

Приготовление внеклеточного матрикса белковых волокон для Бриллюэна спектроскопии

Published: September 15, 2016
doi:
10.3791/54648
, , , , , ,
1School of Physics and Astronomy,University of Exeter, 2Department of Physics and Geology,University of Perugia, 3Istituto Officina dei Materiali del CNR,Unità di Perugia

Summary

We present a protocol for the application of Brillouin light scattering spectroscopy to elastin and trypsin-purified type I collagen fibers of the extracellular matrix to extract their full elastic properties.

Abstract

Brillouin spectroscopy is an emerging technique in the biomedical field. It probes the mechanical properties of a sample through the interaction of visible light with thermally induced acoustic waves or phonons propagating at a speed of a few km/sec. Information on the elasticity and structure of the material is obtained in a nondestructive contactless manner, hence opening the way to in vivo applications and potential diagnosis of pathology. This work describes the application of Brillouin spectroscopy to the study of biomechanics in elastin and trypsin-digested type I collagen fibers of the extracellular matrix. Fibrous proteins of the extracellular matrix are the building blocks of biological tissues and investigating their mechanical and physical behavior is key to establishing structure-function relationships in normal tissues and the changes which occur in disease. The procedures of sample preparation followed by measurement of Brillouin spectra using a reflective substrate are presented together with details of the optical system and methods of spectral data analysis.

Introduction

Рассеяния Бриллюэна света (BLS) эффект был обнаружен Леоном Бриллюэном в 1922 году 1 Она состоит из неупругого рассеяния видимого света термоактивированных акустических фононов в материале. В физике твердого тела, акустические фононы когерентные колебания всех атомов в решетке. Одномерная цепочка из двух чередующихся типов атомов в решетке является простая модель , иллюстрирующая разницу между акустических фононов, выявленных BLS и оптических фононов, опрашиваются методом ИК – поглощения и комбинационного рассеяния света (рисунок 1). Акустические фононы движения синфазные атомов в цепи с перемещением вдоль направления распространения (продольных акустических фононов) или перпендикулярно к направлению распространения (поперечные акустические фононы), в то время как оптические фононы из синфазного движения атомов производя осциллирующий электрический дипольный момент (продольной или поперечной моды).

BLS спектроскопии был использован в аналитической науке начиная с 1920-х годов; Тем не менее, только с 1980-х имеют высокие измерения контраста было возможно за счет использования тандема многопроходной спектрометра Фабри-Перо. С тех пор все большее число достижений в области BLS для аналитических приложений в конденсированных средах (где эксплуатируемого взаимодействие фотон-фонон) 2-4 и магнитные материалы ( за счет взаимодействия фотонов одномагнонного) 5 было вызвано. Семенные работы по биомедицине 6-8 проложили путь к разработке различных подходов, в том числе той , которая применяется здесь и описанной ранее 9 с использованием отражающей подложки в пластинчатой ​​конфигурации для достижения полного описания тензора упругости образец.

В настоящей работе мы применяем BLS спектроскопии основных компонентов внеклеточного матрикса в соединительной ткани, волокнистые белки эластин и типа I-коллаген. TYpe коллагена является жесткой, тройной спиральной молекулой, которая собирает в поперечном направлении и в продольном направлении с обширной сшивки с образованием по существу жестких волокон в ткани, такие как сухожилия. Сети коллагена часто сосуществуют с сетями эластин, белок, который, необычно, генерирует эластичность на большие расстояния за счет сочетания энтропии и гидрофобных взаимодействий со средой и имеет важное значение для функций тканей, таких, как рак легких и кожи. Оба волокна моделируется с помощью гексагональную модели кристалла в современных исследованиях. 9 В части 1 мы опишем протокол для извлечения волокон из тканей животных и подготовить образец для спектроскопических измерений. В части 2, процедура настройки устройства Бриллюэна и получения спектров из волокон представлена. Часть 3 дает подробную информацию анализа данных применительно к спектрам Бриллюэна извлечь соответствующую механическую содержащуюся в нем информацию. Затем репрезентативные результаты представлены и discussed.

Protocol

Внимание: Пожалуйста, обратитесь к биологическим протоколы безопасности и все соответствующие паспорта безопасности материала (MSDS) перед использованием. Лазер используется в этих опытах является 3Б класса лазера; соблюдение местных правил для безопасного использования системы требуется. Пожалуйста, используйте все соответствующие практики безопасности при проведении измерений спектроскопии лазера в том числе с использованием средств индивидуальной защиты (защитные очки). Хвост сухожилия были получены из 7-8-недельных крыс Вистар эвтаназии для других целей в соответствии с постановлением ЕС 1099/2009 и благосостояния животных (убойный или убийство) Положения 1995 Бычьи затылочные связки были получены из местного бойне. 1. Подготовка образцов волокон Примечание: Белковые волокна внеклеточного матрикса могут быть извлечены из различных тканей, с использованием различных процедур. Протоколы были уточнены на основе широко применяемых процедур. <stroнг> Выделение волокон коллагена из крысиного хвоста Sacrifice крысу внутрибрюшинно инъекции 100 мг / кг массы тела пентобарбитона натрия. Затем разъединить хвост непосредственно в точке контакта с телом, придавливая с бритвенным лезвием одного края. Оберните хвост в пленку и хранить ее в замороженном виде при -20 ° С, пока не требуется. Собирают хвост из морозильной камеры, разрезать длиной 20 мм отрезок от проксимального конца в то время как все еще заморожена, а затем оставить его оттаивать в чашке Петри заполнены раствором фосфатного солевого буферного раствора (PBS) (рН 7,4) при комнатной температуре. После того, как хвост размораживают, надрезают вдоль длины отрезка, используя скальпель, чтобы разделить кожу. Затем отогните выявить четыре обшил сухожилие расслоения о хвостовой позвонок. Использование тонких щипцов и быть осторожными , чтобы не применять какие – либо предварительной деформации, аккуратно начертить каждый слой из ножен и поместить его в пробирку , содержащую дистиллированную воду с 0,01% вес / об азид натрия (NaN 3) прсобытие роста бактерий, и хранить в холодильнике. Один хвост дает около тридцати сухожильных волокон. Для получения чистого волокнистого типа I коллаген, применять процесс 10 ферментативного расщепления трех частей к сухожильных волокон , чтобы удалить протеогликаны и все другие noncollagenous материал. Во- первых, погружают волокна в 0,125 Ед / мл хондроитиназы ABC в 0,05 М Трис – буфера и 0,06 М ацетата натрия (CH 3 COONa) при рН 8,0 в течение 24 ч при 37 ° C в инкубаторном шейкере со скоростью 200 оборотов в минуту. Затем погружают волокна в 1 Ед / мл Streptomyces гиалуронидазы в 0,05 М Трис-буфера и 0,15 М хлорида натрия (NaCl) при рН 6,0 и вернуться к встряхивания инкубаторе в течение 24 ч при 37 ° С. И, наконец, погружают волокна в 1 мг / мл трипсина в 0,05 М фосфата натрия (NaHPO 4) и 0,15 М NaCl при рН 7,2 в течение 16 ч в инкубаторе встряхивании при 37 ° С. Хранить очищенные волокна охлажденных во флаконах, содержащих дистиллированную воду, Wiй 0,01% NaN 3 , чтобы предотвратить рост бактерий, до тех пор , пока требуется для измерения. Добыча эластических волокон из бычьей затылочной связки Получение бычьего затылочной связки из скотобойни, завернуть его в пленку и хранить ее в замороженном виде при -20 ° С до использования. Для получения чистого эластина, собрать связку из морозилки, дайте ему оттаять при комнатной температуре, обезжирить его с помощью скальпеля и переваривать связки в кипящей водяной бане в соответствии с процедурой Lansing, 11 следующим образом . Готовят 0,1 М раствора гидроксида натрия (NaOH) в дистиллированной воде, и добавить его к обезжиренной связкой в ​​коническую колбу, покрывая ткань. Кипение в колбу на водяной бане при температуре 95 ° С в течение 45 мин. Удалите связку из переваривания колбы и промойте блок нерастворимый ткани повторно в дистиллированной воде до рН 7,0 (контролируется с помощью рН-метра) не получается. Удалите ткань из окончательныйРабочий промывочный раствор и погрузить его в дистиллированной воде ( в смеси с 0,01% NaN 3 , чтобы предотвратить рост бактерий) в герметичном контейнере и хранить его в холодильнике. Соберите ткань из холодильника и, соблюдая осторожность , чтобы не применять слишком много сил и предварительной деформации, используйте пинцет , чтобы аккуратно потянуть меньшие эластина сегментов ( от 20 до 50 мм длиной, около 2 мм толщиной) от более крупного блока и разместить их в чашку Петри с раствором PBS (рН 7,4). Использование тонких щипцов, мягко дразнить небольшие пучки волокон вокруг толщиной 1 мм и разрезают их на отрезки длиной в несколько мм скальпелем. Перенесите волокна в пробирки , содержащие дистиллированную воду (0,01% NaN 3 , чтобы предотвратить рост бактерий) и хранить их в холодильнике , пока не требуется для измерения. Монтаж волокон на отражающей подложке Используя алмазный резец, вырезать кусок отражающей силиконового слайда. Для создания гидратной compartmeнт, разрезать полосу Parafilm, чтобы соответствовать по силиконовую слайд с полой разрезом в центре (достаточно большой, чтобы соответствовать волокно) и поместите его на кремниевой подложке. Примечание: для измерений сухого волокна, разрезать парафильмом в U-образную форму так, что одна из четырех сторон остается открытым для воздуха, когда запечатан на этапе 1.3.4. Удалите волокна из холодильника, использовать пару тонких щипцов для сбора одного волокна из раствора для хранения и поместите его в небольшой чашке Петри заполнены чистой водой при комнатной температуре в течение 5 мин для отмывки образца. Затем собирают волокна и передать его в центр парафильмом впадине на кремниевой подложке. Осторожно: Избегайте повреждения волокна, растягивая его во время этой операции, и избежать переориентируют образца на подложке, так как это может привести к изменению механических свойств. Поместите тонкий покровного стекла над волокном и уплотнения камеры путем пропускания нагретого паяльника мягко по поверхности стекла, чтобы расплавить парафильмом подстакан. Осторожно: Избегайте повреждения волокон, не принося пайки наконечник слишком близко или нагрева подложки чрезмерно. Поместите герметичную камеру на плоскую поверхность под небольшим весом и оставить его в течение примерно 12 часов, чтобы добиться хорошего контакта между образцом и кремниевой подложки, избегая при этом повреждения образца. Удалите вес и закрепить камеру на месте на подложке, с помощью винтов. 2. Настройка Бриллюэна эксперимента и Эквайринг волокна Spectra Подготовка образца отсека Установить образец , полученный , как в части 1.3 на вертикальную держатель , снабженный гониометра для того, чтобы в плоскости вращения образца при сохранении постоянного угла рассеяния (2 Φ = 90 °; см рисунок SI-1) и рассеяния позиции громкости. Выполните точную регулировку фокуса лазерного луча на пробы через ленс. 9 Тщательное: выходная мощность лазера может быть слишком высокой, и произвести ожог в образце. Убедитесь, что он установлен достаточно высоко, чтобы дать хорошую чувствительность, но не слишком высоко, чтобы избежать повреждения образца. Здесь мы использовали мощность ca. 76 мВт на образце. Этого было достаточно, чтобы получить хорошую чувствительность без сжигания образца, а также учитывая, что это тонкий и в контакте с подложкой, которая помогает рассеивать тепло, вырабатываемое лазерной подсветкой. Поместите образец на 45 ° угол (Ф) к падающего лазерного луча с помощью нониуса. Достижение оптимального позиционирования путем выполнения измерений и максимизации интенсивности пиков в спектре (см ниже). Настройка спектрометра Открытое программное обеспечение для сбора и обработки данных , а также настроить приобретение Бриллюэна спектра образца 12. Процедура, описанная здесь, относится к измерительному устройствуltipass тандем интерферометр (рис SI-1A). Совместите два Фабри-Перо (FP) интерферометры независимо друг от друга изменяющихся напряжений, приложенных к пьезо блоком управления. Для этой процедуры предварительного совмещения, наблюдать свет, отраженный каждой FP. Когда интенсивность отраженного от двух FPs стремится к нулю, правильное выравнивание достигается. Калибровка спектра: диапазон доступной частоты, или свободный спектральный диапазон (FSR), зависит от расстояния между двумя зеркалами первой полости FP, L, через FSR = с / 2 L, где с скорость света и L измеряется с помощью набора датчика. Синхронизировать сканы двух интерферометров FP и переключить оптическую систему в конфигурации тандема многопроходной. Система обратной интенсивности пропускаемого лазерного излучения автоматически поддерживает выравнивание двух FPs во время измерения. Измерение OF Бриллюэна Spectra Тщательное: Спектр Бриллюэна сильно зависит от температуры и гидратации образца и поэтому тщательный контроль этих параметров является ключом к получению воспроизводимых спектров. Начните приобретение Бриллюэна спектра образца и запустить его до тех пор, хорошее отношение сигнал-шум не будет достигнуто. Это может занять несколько минут в зависимости от сечением рассеяния, концентрации и толщины образца. Примечание: Существует не правило для отношения сигнал-шум, но спектральное качество проверяется экспериментатором на основе конкретного анализируемого образца. Существует компромисс между спектральным качеством и продолжительности измерения, поэтому экспериментальные параметры должны быть выбраны в соответствии с конкретным приложением. Для измерения сухого образца, не принимают последовательные спектры – для каждого из них, после шага 2.3.1 – пока никаких изменений в положении пиков яs наблюдается. Это достигается, когда образец находится в равновесии с атмосферой комнатной, и дальнейшее высушивание не будет влиять на спектр. Выберите поляризацию света (VV или VH, V обозначает вертикальное и H для горизонтального направления поляризации света относительно плоскости рассеяния) и приобретают спектры на каждом углом к оси волокна (q, рис SI-1) путем вращения образца в плоскость вручную. Сохранение спектров Бриллюэна в файл для последующей обработки. 3. Анализ спектров Бриллюэна Примечание: Установить анализ пиков Бриллюэна может быть выполнена с использованием различных функций. Затухающего гармонического осциллятора (DHO) функция 4,13 была выбрана , так как это является допустимым модель для пиков , происходящих из затухающих акустических мод в вязкоупругих средах. Fit анализ пиков Бриллюэна Выберите спектральный диапазон для пика интереса к-йе Бриллюэна спектра. Включение базовой линии в приступе если спектральный фон значительно выше нуля. Примечание: Исходные условия могут отличаться в зависимости от спектров. Убедитесь в том, что поправка применяется на систематической и воспроизводимым образом. Примените подробный методу наименьших квадратов с использованием функции Дхо 4,13 к Бриллюэна пика интереса итеративно до сходимости не будет достигнуто и получается лучший фитинга кривой. Затем сохраните уложения результаты в файл. Получить средние значения из подгонки параметров двух пиков каждого Бриллюэна дублета. Вычислить акустическую скорость волны от пиковой частоты (используя приведенную ниже выражение). Участок уложения результатов с помощью графиков, например, скорости распространения акустических волн по сравнению с углом к оси волокна, θ И применять соответствующие модели (например, для акустически анизотропных систем 9) для извлечения механических величин , таких как тензор коэффициентов упругости.

Representative Results

Устройство Бриллюэна спектроскопии использовали в этом эксперименте (рис SI-1A) было описано ранее. 9 Она использует одномодового 532 нм твердотельный лазер с выходной мощностью 76 мВт на образце. 20 см ахроматический линза фокусирует лазерный луч на образец и собирает рассеянный свет от образца в геометрии обратного рассеяния. Тандем многопроходной интерферометр Фабри-Перо используется для фильтрации рассеянного света, который затем детектируется детектором фотодиод с низким уровнем шума. Такой подход дает очень высокую контрастность (приблизительно 120 дБ) и стабильности посредством качающейся пьезо-сканирования эталонами. Поляризатор и анализатор введены, чтобы выбрать поляризацию падающего и рассеянного света. Спектры обычно получают с поляризатор сохраняется фиксированной выбора вертикальной (V) направление падающего света поляризации и анализатор выбирающий в качестве альтернативы вертикальной (V) ог горизонтальная (H) направление поляризации рассеянного света. В этой конфигурации, продольные и поперечные акустические моды детектируемых соответственно. Типичный спектр Бриллюэна имеет интенсивный центральный пик из – за упругого рассеяния , и один или большее количество наборов одинаково сдвинутых пиков или Бриллюэна дублетов, которые подпись механики образца. В этих измерениях, рассеянный свет может исходить как от объемных фононов бегущих квазиортогональных к образцу и после отражения падающего света на границе раздела образца подложки, от объемных фононов бегущих параллельно поверхности (режимы PS). 9 На рисунке 2 показана BLS спектры сухих и гидратированных трипсина-переваренной коллагеновых волокон , полученных с помощью поляризации VV с разрешением 0,2 ГГц, с 30 ГГц свободного спектра и приблизительно 10 мин времени сборав спектре. Каждый спектр соответствует определенному углу поворота, θ (Рисунок SI-1C). В сухом коллагенового волокна при в = 0 °, продольных мод приводят к объемной пик при (18,92 ± 0,02) ГГц в то время как режим ПС находится в (9,85 ± 0,03) ГГц (фиг.2А). Пиковые PS смещается в сторону более низких частот , как θ идет от 0 ° (фонона зондирующего осевую ориентацию волокон) до 90 ° (фонона зондирующего радиальной ориентации), а объемного пика лишь слегка красные смещения при изменении пературы в том же диапазоне (фонон зондировании квази-радиальное направление вращения по всему). В мокром коллагенового волокна, два пика из – за продольных фононов, по существу , неизменными в течение всего эксперимента, с объемной пик при примерно 10,5 ГГц , а пик PS 4,9 ГГц (рис 2B). Это указывает на то сокращение на 80 до 100% с пиковой частоты (по отношению к данным 18.92и 9,85 ГГц, соответственно), и, следовательно, жесткости материала, вследствие гидратации. Следует отметить, что объемные и PS режимы гидратированного коллагена лежат близко по частоте к режимам чистой воды, предполагая, что его упругие константы представляют собой сочетание воды и волокна вкладов, с доминирующей ролью, которую играет вода. На рисунке 3 показан спектр сухого трипсина-переваренной коллагеновых волокон , измеренный при θ = 30 ° , с В.Х. поляризацией; утечка поляризации VV позволяет PS и насыпных пики по-прежнему наблюдается. Поперечные режимы учета пика в (4,1 ± 0,2) ГГц (q = 0 °) , который слегка сине-сдвигами как & thetas изменяется от 0 ° до 90 °. также показаны подходящие результаты для обоих поперечных и пиков PS. Пиковые показатели были извлечены и скорости акустических волн были получены , как V L = V Л / √2, где <eм> V является частота моды , полученной кривой посадки анализа пиков и длина волны возбуждения, 532 нм. Следует отметить , что в этой геометрии, знание показателя преломления материала не требуется , чтобы получить скорость звука в режиме (из – за геометрии рассеяния, Q s = 2 K I sin (Φ); Рисунок SI-1b, с), следовательно , что делает этот подход особенно выгодно. На рисунке 4 представлен график зависимости скоростей распространения акустических волн , полученных из продольных и поперечных мод (PS и Т – пиков) в зависимости от угла & thetas , Fit анализ к модели шестиугольной симметричного упругого твердого 7 – Уравнения А1 и А2 ниже – обеспечивает пять компонентов тензора упругости сухого трипсина-переваренной типа I коллагеновые волокна (таблица 1). <p class="jove_content" fo:keep-together.within-страница = "1"> Продольные и поперечные скорости акустических волн приведены на 9 , (А1) , (А2) где ρ является плотность материала, и с 11, C 33, C 44 и C 13 являются четыре из пяти упругих констант, характеризующих системы с гексагональной симметрией. Пятая константа, C 12, может быть получена из приближенного соотношения С12 ~ С11 -. 2 C 44 7 Коэффициенты аналогичны тем, которые ранее получены из неочищенных коллагена FibeRS. 9 заметная разница имеет место для коэффициента C 13 , что отражается в аналогичных значениях модулей упругости Е и Е ǁ (Приблизительно 7,2 и 7,7 ГПа) для очищенного коллагена. На рисунке 5 приведен график продольной акустической скорости волны влажного коллагена по сравнению с θ , В этом случае не наблюдается периодическое изменение частоты, давая постоянную скорость в пределах погрешности. На рисунке 6 приведены спектры сухих и гидратированных эластических волокон , измеренных при q = 0 °. Поперечные режимы не были обнаружены для этих образцов. В сухом эластина, основная часть пик приходится на 16.8 ГГц в то время как в режиме PS 8,2 ГГц 9 (13 и 20% ниже , чем соответствующие пики сухого коллагена). Влажные эластиновые волокна представляют собой объемную рEAK при (12,30 ± 0,01) ГГц (на 37% ниже по частоте, чем объемная пик сухого эластина). Режим PS влажного эластин не проявляется в спектре из-за интенсивного хвоста упругого пика на этих частотах. С другой стороны, пик при приблизительно 7,5 ГГц связывается с объемной воды. На рисунке 7 показана зависимость скорости распространения акустических волн в сухой эластина волокна на & thetas. Исходя из этих данных, тензора упругости компоненты (и механические модули) были получены (таблица 1). 9 Как и в мокрой коллагена, есть свидетельства изотропии в механическом модуля гидратированных эластических волокон. Эти результаты указывают на то, как Бриллюэна спектроскопия может дать соответствующую информацию о жесткости, состав и структурные аспекты материала. Fi1. Акустическая фигура и оптические фононы в одномерной цепочке атомов. Принципиальная схема акустических и оптических колебаний в одномерной двухатомной цепочки. Атомы имеют массу т 1 и М 2 и чередуют. Стрелки указывают на смещения атомов. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры. Рисунок 2. Бриллюэна спектры трипсин-очищенными типа I коллагеновых волокон крысы из сухожилий хвоста. Спектры (A) сухого волокна и (В) гидратированные волокна из измерений VV на под другим углом к оси волокна & thetas, в градусах. Спектр чистой дистиллированной воды, также показана. Спектры были нормированы на интенсивность (высота) объемного пика. Этикетки В и ПС обозначают пики, связанные с наливом и параллельно-поверхности мод, соответственно. Столбики ошибок указывают стандартную ошибку (квадратный корень из числа отсчетов). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры. Рисунок 3. Бриллюэна спектр сухого трипсина очищенного типа I коллагеновые волокна из хвоста крыс сухожилие. Спектр от измерения В.Х. При Ф = 30 °. Этикетки T, PS и B обозначают пики, связанные с поперечными, параллельно-поверхности и объемных мод, соответственно. Также показаны результаты подгонки анализа с использованием модели затухающего гармонического осциллятора (DHO) для обоих режимов T и PS. Столбики ошибок указывают стандартное отклонение (квадратный корень из числа отсчетов)./54648fig3large.jpg "Целевых =" _blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры. Рисунок 4. График зависимости скорости акустической волны в сухом трипсином очищенный коллаген против углом к оси волокна. Продольные и поперечные скорости акустической волны сухого волокна коллагена , полученные из подгонки анализа пиков Бриллюэна. Данные установлены на модели шестиугольной симметричной упругого твердого тела. Красная линия: Уравнение A1 (R 2 = 0,99); синяя линия: Уравнение A2 (R 2 = 0,36). Столбики ошибок указывают стандартные ошибки , полученные из квадратного корня из диагональных элементов ковариационной матрицы после того, как Левенберга-Марквардт нелинейных наименьших квадратов спектров Бриллюэна. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы увидеть увеличенное Versi на этой фигуре. Рисунок 5. Участок продольной скорости акустической волны в мокром трипсином очищенный коллаген против углом к оси волокна. Продольная скорость звука волна гидратированного коллагенового волокна , полученного из подгонки анализа пиков Бриллюэна. Линия показано представляет собой руководство для глаз и дает среднее значение скорости распространения акустических волн в этом диапазоне. Столбики ошибок указывают стандартные ошибки , полученные из квадратного корня из диагональных элементов ковариационной матрицы после того, как Левенберга-Марквардт нелинейных наименьших квадратов спектров Бриллюэна. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры. JPG "/> Рисунок 6. Бриллюэна спектры эластических волокон из бычьей затылочной связки. Спектры сухого и гидратированного волокна при & thetas = 0 °. Спектры были нормированы на интенсивность (высота) объемного пика. Этикетки В и ПС обозначают пики, связанные с наливом и параллельно-поверхности мод, соответственно. B F и В W относятся к объемными пиков волокна и воды, соответственно. Столбики ошибок указывают стандартную ошибку (квадратный корень из числа отсчетов). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры. Рисунок 7. Участок продольной скорости акустической волны в сухом эластина против углом к оси волокна. Продольная скорость звука волна сухой эластина FIBэр получена из подгонки анализа пиков Бриллюэна. Данные установлены на модели шестиугольной симметричной упругого твердого тела. Красная линия: Уравнение A1 9 (R 2 = 0,74). Столбики ошибок указывают стандартные ошибки , полученные из квадратного корня из диагональных элементов ковариационной матрицы после того, как Левенберга-Марквардт нелинейных наименьших квадратов спектров Бриллюэна. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры. Рисунок SI-1. Схема Бриллюэна настройки и BLS геометрии рассеяния. (A) Падающий свет , испускаемый твердотельного лазера направляется на образец через ахроматической линзы. Свет, рассеянный объемных акустических фононов и теми, в результате Reflпрогиб света на поверхности подложки, которая находится в контакте с образцом, собирают линзу, фильтруется с помощью тандем-многопроходной интерферометра Фабри-Перо и детектируется фотоумножителем. FP1 и FP2 указывают на две составляющие интерферометры тандем настройки. Поляризатор выбирает поляризацию падающего света, и анализатор используется для выбора поляризации рассеянного света. (В) , геометрия БСТ с образцом в контакте с поверхностью отражающей кремниевой подложки. Предметное стекло (не показано), помещается над образцом для герметизации отсека, и мягкое давление применяется через прокладки в углах подложки. Падающего света (к I) проходит через объектив, преломляется на границе раздела воздух-образца (к 'I) и сосредоточены на границе образца подложки. Рассеянный свет собирают ту же линзу (к 'ы) является результатом взаимодействия с обеих объемных фононов (дб) и тех , кто путешествует PS образца (д х). . Углы между направлениями света и нормали к поверхности обозначены как Φ и Φ '(C) Принципиальная схема образца и принятой системы координат; Z определяет необычайную ось , параллельную направлению волокон. Углы θ и α являются те , между направлением фононы д ы и д б к г оси х, соответственно K I, K 'I, K s, K' s:. Волновые числа падающего и рассеянного света; д б, д s, волновые векторы объемных и режимов PS, соответственно. (Перепечатано из исх 9.) Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры. <pкласс = "jove_content" ВОК: Keep-с-next.within-странице = "всегда"> Таблица 1. Упругие коэффициенты тензора , полученные из подгонки анализа скоростей акустических волн тензор упругих коэффициентов сухого трипсина очищенного типа I коллагеновые волокна (. эта работа) и эластиновых волокон (ссылка 9). образец упругие коэффициенты (GPA) трипсин-переваренной коллаген с 33 18,7 ± 0,1 с 11 14,4 ± 0,2 с 44 3,4 ± 0,1 с 12 7,2 ± 0,2 с 13 11,2 ± 0,3 эластин с 33 11,5 ± 0,2 с 11 10,4 ± 0,1 с 44 1,9 ± 0,2 с 12 6,6 ± 0,2 с 13 6,8 ± 0,3

Discussion

Бриллюэна спектроскопии является уникальным инструментом, с помощью которого отдельные компоненты тензора упругости белкового волокна можно охарактеризовать в беспрецедентных деталях. Кроме того, измерения могут быть сделаны на микроскопическом уровне и тем самым даст нам новые идеи в микромасштабных механики биологических структур, что позволяет нам, в первый раз, чтобы понять механический, и, вероятно, функциональное, значение сложности в матричной архитектуры и биохимии, который был выявлен в последние годы.

Методика измерения механических свойств в диапазоне частот ГГц. Этот домен никогда не был изучен ранее для структурных биополимеров и одновременно повышает и обеспечивает средства, чтобы ответить на фундаментальные вопросы о молекулярных механизмах упругости.

Мы описали шаги для извлечения волокон коллагена и эластина из тканей животных и для измерения Бриллюэна scatteriСпектры нг с использованием отражающей подложки для достижения полного описания волокна биомеханики. Критические шаги в рамках протокола являются те, которые обеспечивают, что очищенные волокна получены и соответствующие экспериментальные условия в месте для воспроизводимых измерений волокнистых белков. Тем не менее, следует иметь в виду, что процедуры извлечения может модифицировать механические свойства волокон.

Модификации метода включают связь с оптической микроскопии для microfocused рассеяния Бриллюэна и картографирования подходов 13 и возможные комбинации с дополнительными методами (например, комбинационное рассеяние света). В настоящее время применение техники в основном сосредоточены на срезанных биологических материалов, но важные события, например, те , которые основаны на нескольких VIPA эталонах 14, делают возможным перевод этой техники от Benchtop к постели больного с целым рядом приложений уже демонstrated 15,16 включая потенциал в естественных условиях применения. Подход VIPA является альтернативой тому, что мы описываем; она имеет более быстрое время на приобретение, но не обязательно подходит в случае непрозрачных образцов, таких, как те, которые анализируются здесь. Кроме того, использование отражающей подложки не является практичным в Наладки, которые используют эталоны VIPA, потому что их контраст не будет достаточно, чтобы отвергнуть квазиупругим свет. Ограничения, связанные со скоростью приобретения спектрального набора данных и сечения рассеяния материала по своей природе слабого может ограничить приложения для динамических биологических систем и получения данных из глубоко в тканях, но технические усовершенствования могут улучшить текущей производительности.

BLS обещает стать основным инструментом в фундаментальных биофизических исследований на внеклеточный матрикс и тем самым произвести новое понимание эволюции механических свойств в процессе роста матрицы и их потери в патологическийдегенерация. Тем не менее, важно помнить , что измерения неинвазивного и , следовательно , могут быть предприняты в естественных условиях. В самом деле, это уже достигнуто в роговице 16 , и такая работа может служить платформой для разработки новых диагностических инструментов для широкого спектра заболеваний соединительной ткани.

Ультразвуковой эластографии и атомно-силовой микроскопии (AFM), являются альтернативными методами микромеханических измерений, но техника БСТ предлагает лучшее пространственное разрешение (на субклеточном масштабе), чем первый, и, в отличие от АФМ, не накладывает никаких механических сил на образце и не ограничивается анализ только поверхностных особенностей. Бриллюэновские модули коллагена и эластина находятся в диапазоне ГПа, в то время как модули Юнга от макроскопических штаммов порядка МПа (дальнейшие подробности будут сообщены в другом месте). Этот результат указывает на дифференциальный модуль упругости с сильной зависимостью от частоты возбуждения, в силуповедение вязкоупругого волокон. BLS может быть применен к широкому кругу проблем и материалов, в биомедицинской науке. Это может помочь в ответах на вопросы по физиологии и патологии биологических тканей, а также обеспечивать физический инструмент для фундаментального понимания материалов и взаимодействий на молекулярном уровне.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported by the Engineering and Physical Sciences Research Council [grant number EP/M028739/1]. RSE was supported by a Santander Postgraduate Research Award 2015.

Materials

Chondroitinase ABC Sigma-Aldrich C2905
Tris Buffer Fluka 93358
Sodium Acetate Fisher Scientific S608-500
PBS Sigma-Aldrich P4417
Sodium Azide Fisher Scientific S2002
Streptomyces Hyaluronidase  Sigma-Aldrich H1136-1AMP
Sodium Chloride Fisher Scientific S7653
Trypsin Sigma-Aldrich T4665
Sodium Phosphate Sigma-Aldrich S9638
Sodium Hydroxide Fisher Scientific S320-500
Pure Water Millipore ZRQS0P3WW Produced In-House 
Distilled Water Bibby Scientific Limited D4000 Produced In-House from water still
Euthatal Merial  J01601A 
Tandem Interferometer TFP-1 JRS Scientific Instruments
Freezer Lec TU55144
Refrigerator Zanussi ZBA15021SA
Hot Plate Fisher Scientific SP88857206
Clamps VWR 241-7311 & 241-7201
Clamp Stand VWR  241-0093
Thermometer Fisher Scientific 13-201-401
Cling Film Sainsbury's 7650540
Parafilm Sigma-Aldrich P7793-1EA
Silicone IDB Technologies N/A No catalogue number. Order upon request
Cover Glass VWR 631-1571
Conical Flask VWR 214-1175
Beaker VWR 213-0469
Measuring Cylinder VWR 612-3838
Vial VWR 548-0051 & 548-0863
Petri Dish VWR 391-0441
Scalpel Swann Morton Ltd  0914 & 0308
Diamond Scribe RS Instruments 394-217
Soldering Iron RS Instruments 231-5332
Fine Forceps VWR 232-0188
Double Micro-Spatula VWR Various Sizes
pH Meter Hanna Instruments HI-2210-02
Orbital Shaker IKA  0002819000
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brillouin, L. Diffusion de la lumière et des rayonnes X par un corps transparent homogène; influence de l’agitation thermique. Ann. Phys. 17, 88-122 (1922).
  2. Caponi, S., Corezzi, S., Mattarelli, M., Fioretto, D. Stress effects on the elastic properties of amorphous polymeric materials. J. Chem. Phys. 141 (21), 214901 (2014).
  3. Mattarelli, M., Montagna, M., Still, T., Schneider, D., Fytas, G. Vibration spectroscopy of weakly interacting mesoscopic colloids. Soft Matter. 8 (15), 4235-4243 (2012).
  4. Comez, L., Masciovecchio, C., Monaco, G., Fioretto, D., Robert, E. C., Robert, L. S. . Solid State Physics. 63, 1-77 (2012).
  5. Madami, M., et al. Direct observation of a propagating spin wave induced by spin-transfer torque. Nat. Nanotechnol. 6 (10), 635-638 (2011).
  6. Harley, R., James, D., Miller, A., White, J. W. Phonons and the elastic moduli of collagen and muscle. Nature. 267 (5608), 285-287 (1977).
  7. Cusack, S., Miller, A. Determination of the elastic constants of collagen by Brillouin light scattering. J. Mol. Biol. 135 (1), 39-51 (1979).
  8. Vaughan, J. M., Randall, J. T. Brillouin scattering, density and elastic properties of the lens and cornea of the eye. Nature. 284 (5755), 489-491 (1980).
  9. Palombo, F., et al. Biomechanics of fibrous proteins of the extracellular matrix studied by Brillouin scattering. J. R. Soc. Interface. 11 (101), (2014).
  10. Sivan, S. S., et al. Age-related accumulation of pentosidine in aggrecan and collagen from normal and degenerate human intervertebral discs. Biochem. J. 399 (1), 29-35 (2006).
  11. Soskel, N. T., Wolt, T. B., Sandberg, L. B., Leon, W. C. . Methods in Enzymology. 144, 196-214 (1987).
  12. Fioretto, D., Scarponi, F. Dynamics of a glassy polymer studied by Brillouin light scattering. Mater. Sci. Eng. A. 521-522, 243-246 (2009).
  13. Palombo, F., Madami, M., Stone, N., Fioretto, D. Mechanical mapping with chemical specificity by confocal Brillouin and Raman microscopy. Analyst. 139 (4), 729-733 (2014).
  14. Scarcelli, G., Yun, S. H. Multistage VIPA etalons for high-extinction parallel Brillouin spectroscopy. Opt. Express. 19 (11), 10913-10922 (2011).
  15. Scarcelli, G., Kim, P., Yun, S. H. In Vivo Measurement of Age-Related Stiffening in the Crystalline Lens by Brillouin Optical Microscopy. Biophys. J. 101 (6), 1539-1545 (2011).
  16. Scarcelli, G., Yun, S. H. In vivo Brillouin optical microscopy of the human eye. Opt. Express. 20 (8), 9197-9202 (2012).

Tags

Extracellular MatrixCollagenElastinBrillouin SpectroscopyTendonChondroitinase ABCStreptomyces HyaluronidaseTrypsinBovine Nuchal LigamentSodium HydroxideWater Bath

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Edginton, R. S., Mattana, S., Caponi, S., Fioretto, D., Green, E., Winlove, C. P., Palombo, F. Preparation of Extracellular Matrix Protein Fibers for Brillouin Spectroscopy. J. Vis. Exp. (115), e54648, doi:10.3791/54648 (2016).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image