Preparazione della matrice extracellulare fibre proteiche per Brillouin Spettroscopia

L'apparecchiatura spettroscopia Brillouin utilizzato in questo esperimento (Figura SI-1A) è stata precedentemente descritta. 9 Si impiega una modalità singola 532 nm laser a stato solido con potenza di uscita 76 mW a campione. Una lente acromatica 20 centimetri focalizza la luce laser sul campione e raccoglie la luce diffusa dal campione in una geometria backscattering. Un tandem multipass Fabry-Perot è utilizzato per filtrare la luce diffusa, che viene rilevata da un rilevatore fotodiodo basso rumore. Questo approccio dà contrasto estremamente elevato (circa 120 dB) e la stabilità attraverso l'auto-allineamento piezo-scansione dei etalon. Un polarizzatore e analizzatore vengono introdotti per selezionare la polarizzazione della luce incidente e diffusa. Gli spettri vengono solitamente ottenuta con il polarizzatore mantenuto fisso selezionando la direzione verticale (V) della luce incidente polarizzazione e l'analizzatore selezionando alternativamente verticale (V) or orizzontale (H) in direzione della polarizzazione della luce diffusa. In questa configurazione, modi acustici longitudinali e trasversali vengono rilevati rispettivamente. Un tipico spettro Brillouin ha un intenso picco centrale a causa di diffusione elastica e uno o più insiemi di picchi equamente spostate, o doppietti Brillouin, che sono la firma della meccanica del campione. In queste misurazioni, la luce diffusa può provenire sia da fononi bulk viaggiano quasi-ortogonale al campione e, dopo la riflessione della luce incidente all'interfaccia campione-substrato, da fononi bulk viaggiano parallelamente alla superficie (modalità PS). 9 La figura 2 mostra BLS spettri delle fibre di collagene tripsina-digeriti secchi e idrati ottenuti con VV polarizzazione ad una risoluzione di 0,2 GHz, con una gamma spettrale gratuita di 30 GHz e circa il tempo di raccolta 10 minper ogni spettro. Ogni spettro corrisponde ad un determinato angolo di rotazione, θ (Figura SI-1C). In fibre collagene secco a θ = 0 °, modi longitudinali danno luogo ad un picco massa a (18.92 ± 0.02) GHz mentre la modalità PS è a (9,85 ± 0,03) GHz (Figura 2A). I turni PS picco a frequenze più basse come θ va da 0 ° (fononi sondare l'orientamento assiale della fibra) a 90 ° (fononi sondare l'orientamento radiale), mentre il picco di massa solo leggermente rosso-sposta al variare θ nello stesso intervallo (fonone sondare una direzione quasi-radiale durante la rotazione). In fibre collagene bagnato, i due picchi dovuti alla fononi longitudinali sono sostanzialmente immutato durante l'esperimento, con il picco massa a circa 10,5 GHz e il picco PS a 4,9 GHz (Figura 2B). Questo indica una riduzione dall'80 al 100% in frequenza di picco (relative ai dati di 18.92e 9,85 GHz, rispettivamente), e quindi della rigidità del materiale, a causa di idratazione. Notare che i modi rinfusa e PS di collagene idratato trovano vicino in frequenza per i modi di acqua pura, suggerendo che le sue costanti elastiche sono una combinazione dei contributi acqua e fibre, con un ruolo dominante svolto da acqua. La figura 3 mostra uno spettro di secca fibre collagene tripsina digerito misurato a θ = 30 ° con VH polarizzazione; una perdita della polarizzazione VV permette al PS e picchi di massa per ancora essere osservati. Modi trasversali rappresentano un picco a (4.1 ± 0.2) GHz (θ = 0 °) che leggermente blu-turni i cambiamenti θ da 0 ° a 90 °. risultati Fit sia per la trasversale e picchi di PS sono mostrati anche. Parametri di picco sono stati estratti e velocità delle onde acustiche sono state derivate da V L = v λ / √2, dove <em> v è la frequenza del modo ottenuta mediante analisi della curva-fit dei picchi e λ è la lunghezza d'onda di eccitazione, 532 nm. Si noti che in questa geometria, la conoscenza dell'indice di rifrazione del materiale non è richiesto per ottenere la velocità modalità acustica (grazie alla geometria di scattering, q s = 2 k i sin (Φ); Figura SI-1b, c), quindi rendendo questo approccio particolarmente vantaggioso. La figura 4 è un grafico delle velocità delle onde acustiche ottenuti modi longitudinali e trasversali (picchi PS e T) in funzione della θ angolare . Analisi Adatta ad un modello di esagonale simmetrica solido elastico 7 – Equazioni A1 e A2 sotto – fornisce i cinque componenti del tensore elastico di tipo tripsina-digerito secco collagene fibre (Tabella 1). <p class="jove_content" fo:keep-together.wntro-page = "1"> Le velocità delle onde acustiche longitudinali e trasversali sono date da 9 , (A1) , (A2) dove ρ è la densità del materiale, ec 11, c 33, c 44 c 13 sono quattro dei cinque costanti elastiche che caratterizzano i sistemi a simmetria esagonale. Il quinto costante, c 12, può essere derivata dalla relazione approssimata c ~ 12 c 11 -. 2 c 44 7 I coefficienti sono simili a quelli precedentemente ottenuti da non purificato fibe collageners. 9 A differenza notevole si verifica per il coefficiente c 13 che si riflette in valori simili dell'elastico moduli E ǁ ed E (Circa 7,2 e 7,7 GPa) per il collagene purificato. La figura 5 è un grafico della velocità longitudinale onda acustica di collagene bagnato rispetto θ . In questo caso, nessun cambiamento periodico in frequenza è osservato, dando una velocità costante entro l'errore. La Figura 6 mostra lo spettro di fibre di elastina secchi e idrati misurati a θ = 0 °. modi trasversali non sono stati rilevati per questi campioni. In elastina secca, il picco di massa si verifica a 16.8 GHz, mentre la modalità PS a 8,2 GHz 9 (13 e 20% inferiore ai corrispondenti picchi di collagene secca). le fibre di elastina Wet presentano una massa peak a (12,30 ± 0,01) GHz (37% più basso in frequenza rispetto al picco di massa di elastina secco). La modalità PS di elastina bagnato non risulta nello spettro causa dell'intenso coda del picco elastica a quelle frequenze. D'altro canto, il picco a circa 7,5 GHz è attribuita all'acqua bulk. La Figura 7 mostra la dipendenza della velocità dell'onda acustica in fibra di elastina asciutto su θ. Da questi dati, i componenti elasticità tensore (e moduli meccanici) sono stati ottenuti (Tabella 1). 9 Come nel collagene bagnato, vi è evidenza di isotropia nel modulo meccanica delle fibre di elastina idrati. Questi risultati indicano come la spettroscopia Brillouin può dare informazioni rilevanti sulla rigidità, composizione e aspetti strutturali di un materiale. Fifigura 1. acustica e fononi ottici a catena unidimensionale di atomi. Schema di vibrazioni acustiche e ottiche in una catena biatomica unidimensionale. Gli atomi hanno massa m 1 e m 2 e si alternano. Le frecce indicano gli spostamenti degli atomi. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura. Figura 2. Brillouin spettri di tipo tripsina-purificata collagene fibre di coda di topo tendine. Spectra di (A) di fibra secca e (B) idratata fibra da misure VV ad angolo diverso da all'asse della fibra θ, in gradi. è anche mostrato Uno spettro di acqua distillata pura. Gli spettri sono stati normalizzati all'intensità (altezza) del picco di massa. Le etichette B e PS denotano picchi relativi alla massa e modalità parallela-superficie, rispettivamente. Le barre di errore indicano l'errore standard (radice quadrata del numero di conteggi). Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura. Figura 3. spettro Brillouin di tipo tripsina-secco purificato collagene fibre di coda di topo tendine. Spectrum da una misura VH a θ = 30 °. Etichette T, PS e B denotano picchi relativi alla trasversale, modalità parallela-superficie e sfusi, rispettivamente. sono mostrati anche i risultati delle analisi in forma utilizzando un modello di oscillatore armonico smorzato (DHO) per entrambe le modalità T e PS. Le barre di errore indicano l'errore standard (radice quadrata del numero di conteggi)./54648fig3large.jpg "Target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. Figura 4. Trama della velocità delle onde acustiche in collagene tripsina-purificato secco vs angolo all'asse della fibra. Velocità longitudinali e trasversali onde acustiche di fibre collagene secca derivati ​​da analisi in forma dei picchi di Brillouin. I dati sono montati su un modello di esagonale simmetrica solido elastico. Linea rossa: Equazione A1 (R 2 = 0,99); linea blu: Equazione A2 (R 2 = 0,36). Le barre di errore indicano gli errori standard ottenuti dalla radice quadrata degli elementi diagonali della matrice di covarianza, dopo un non lineari Levenberg-Marquardt minimi quadrati di spettri Brillouin. Cliccate qui per visualizzare un Versi più grandi su questa figura. Figura 5. Trama della velocità delle onde acustiche longitudinali in collagene tripsina-purificato bagnato vs angolo all'asse della fibra. Velocità dell'onda acustica longitudinale delle fibre collagene idratato derivato da analisi in forma dei picchi di Brillouin. La linea indicata è una guida per l'occhio e fornisce il valore medio della velocità dell'onda acustica in questo intervallo. Le barre di errore indicano gli errori standard ottenuti dalla radice quadrata degli elementi diagonali della matrice di covarianza, dopo un non lineari Levenberg-Marquardt minimi quadrati di spettri Brillouin. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura. jpg "/> Figura 6. Brillouin spettri delle fibre di elastina da bovini legamento nucale. Spettri di fibra secca e idratata a θ = 0 °. Gli spettri sono stati normalizzati all'intensità (altezza) del picco di massa. Le etichette B e PS denotano picchi relativi alla massa e modalità parallela-superficie, rispettivamente. B F e B W riferiscono ai picchi di massa di fibra e di acqua, rispettivamente. Le barre di errore indicano l'errore standard (radice quadrata del numero di conteggi). Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura. Figura 7. Trama della velocità delle onde acustiche longitudinali in elastina secca vs angolo all'asse della fibra. Velocità dell'onda acustica longitudinale secca fib elastinaer derivato da analisi in forma dei picchi di Brillouin. I dati sono montati su un modello di esagonale simmetrica solido elastico. Linea rossa: Equazione A1 9 (R 2 = 0,74). Le barre di errore indicano gli errori standard ottenuti dalla radice quadrata degli elementi diagonali della matrice di covarianza, dopo un non lineari Levenberg-Marquardt minimi quadrati di spettri Brillouin. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura. Figura SI-1. Schema del Brillouin set-up e la geometria di scattering BLS. (A) La luce incidente emessa da un laser a stato solido viene inviato al campione attraverso una lente acromatica. La luce diffusa dalla fononi acustici di massa e da quelli derivanti da riflezione di luce alla superficie del substrato, che è in contatto con il campione, viene raccolta dalla lente, filtrato da un tandem-multipasso Fabry-Perot e rivelata da un fotomoltiplicatore. FP1 e FP2 indicano i due interferometri che costituiscono il tandem set-up. Un polarizzatore seleziona la polarizzazione della luce incidente, ed un analizzatore viene usato per selezionare la polarizzazione della luce diffusa. (B) geometria BLS con un esemplare in contatto con la superficie di un substrato di silicio riflettente. Un vetrino (non mostrato) è disposto sopra il campione per sigillare il vano e leggera pressione viene applicata attraverso rilievi agli angoli del substrato. La luce incidente (k i) passa attraverso l'obiettivo, viene rifratta all'interfaccia aria-campione (k 'i) e concentrato all'interfaccia campione-substrato. La luce diffusa raccolti dalla stessa lente (K 's) i risultati di interazione sia con i fononi rinfusa (qb) e quelli che viaggiano PS del campione (q s). . Angoli tra le direzioni di luce e la normale alla superficie sono indicati come Φ e Φ '(C) Schema del campione e del sistema di coordinate adottata; z definisce l'asse straordinario parallelo alla direzione delle fibre. Angoli θ e α sono quelli tra la direzione di fononi q s e q b per z -axis rispettivamente k i, k 'I, K s, k' s:. Numeri d'onda del incidente e luce diffusa; q b, q s, vettori d'onda del prodotto sfuso e modalità PS, rispettivamente. (Ristampato da ref 9.) Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. <pclass = "jove_content" fo: keep-con-next.within-page = "always"> Tabella 1. coefficienti del tensore elastico derivati ​​da analisi in forma delle velocità delle onde acustiche coefficienti tensori elastici di secca tipo tripsina-purificata collagene fibre (. questo lavoro) e fibre di elastina (rif 9). campione coefficienti elastici (GPa) collagene tripsina digerito c 33 18.7 ± 0.1 c 11 14.4 ± 0.2 c 44 3.4 ± 0.1 c 12 7.2 ± 0.2 c 13 11.2 ± 0.3 elastina c 33 11.5 ± 0.2 c 11 10.4 ± 0.1 c 44 1.9 ± 0.2 c 12 6.6 ± 0.2 c 13 6.8 ± 0.3