We present a protocol for the application of Brillouin light scattering spectroscopy to elastin and trypsin-purified type I collagen fibers of the extracellular matrix to extract their full elastic properties.
Brillouin spectroscopy is an emerging technique in the biomedical field. It probes the mechanical properties of a sample through the interaction of visible light with thermally induced acoustic waves or phonons propagating at a speed of a few km/sec. Information on the elasticity and structure of the material is obtained in a nondestructive contactless manner, hence opening the way to in vivo applications and potential diagnosis of pathology. This work describes the application of Brillouin spectroscopy to the study of biomechanics in elastin and trypsin-digested type I collagen fibers of the extracellular matrix. Fibrous proteins of the extracellular matrix are the building blocks of biological tissues and investigating their mechanical and physical behavior is key to establishing structure-function relationships in normal tissues and the changes which occur in disease. The procedures of sample preparation followed by measurement of Brillouin spectra using a reflective substrate are presented together with details of the optical system and methods of spectral data analysis.
L'effet de diffusion de lumière Brillouin (BLS) a été découvert par Léon Brillouin en 1922. 1 Il se compose de la diffusion inélastique de la lumière visible par les phonons acoustiques activés thermiquement dans un matériau. Dans la physique des solides, phonons acoustiques sont des vibrations cohérentes de tous les atomes dans un réseau. Une chaîne unidimensionnelle de deux types alternés d'atomes dans une maille est un modèle simple qui illustre la différence entre les phonons acoustiques, révélées par le BLS et les phonons optiques, sondé par absorption infrarouge et Raman (figure 1). phonons acoustiques sont des mouvements en phase des atomes dans la chaîne avec un déplacement le long de la direction de propagation (phonons acoustiques longitudinaux) ou perpendiculairement à la direction de propagation (transversales des phonons acoustiques), tandis que les phonons optiques sont des mouvements hors phase des atomes la production d'un moment dipolaire électrique oscillant (longitudinale ou modes transverses).
BLS spectroscopie a été utilisé dans la science analytique depuis les années 1920; cependant, seulement depuis les années 1980 ont des mesures de contraste élevé été possible grâce à l'utilisation du tandem multipass spectromètre Fabry-Perot. Depuis lors, un nombre croissant de progrès dans le BLS pour les applications analytiques de la matière condensée (où l'interaction photon-phonon est exploité) 2-4 et magnétiques des matériaux (par le biais de l'interaction photon-magnon) 5 a été provoqué. Œuvres séminales sur les applications biomédicales 6-8 ont ouvert la voie au développement de diverses approches, y compris celui qui est appliqué ici et celui précédemment décrit 9 en utilisant un substrat réfléchissant dans une configuration lamellaire pour obtenir la description complète du tenseur d'élasticité un échantillon.
Dans le présent travail, nous appliquons la spectroscopie BLS aux constituants fondamentaux de la matrice extracellulaire dans les tissus conjonctifs, les protéines fibreuses d'élastine et de collagène de type I-. Type collagène est une molécule hélicoïdale triple rigide qui assemble latéralement et longitudinalement avec croix vaste liaison pour former des fibres essentiellement rigides dans les tissus tels que les tendons. Réseaux de collagène coexistent souvent avec des réseaux d'élastine, une protéine qui, exceptionnellement, génère longue portée élasticité grâce à une combinaison de l'entropie et des interactions hydrophobes avec son environnement et est essentielle aux fonctions de tissus tels que les poumons et la peau. Les deux fibres sont modélisées à l' aide d' un modèle de cristal hexagonal dans la recherche actuelle. 9 Dans la partie 1, on décrit le protocole d' en extraire les fibres des tissus animaux et de préparer l'échantillon pour les mesures spectroscopiques. Dans la partie 2, la procédure de mise en place de l'appareil de Brillouin et l'acquisition de spectres à partir des fibres est présenté. La partie 3 donne des détails sur l'analyse des données appliquées aux spectres de Brillouin pour extraire les informations pertinentes contenues dans celui-ci mécanique. Ensuite, les résultats représentatifs sont présentés et discusseré.
spectroscopie de Brillouin est un outil unique, par lequel les différents composants du tenseur d'élasticité d'une fibre de protéine peuvent être caractérisées en détail sans précédent. En outre, les mesures peuvent être effectuées à l'échelle microscopique et ainsi nous fournira de nouveaux aperçus sur les mécanismes de micro-échelle des structures biologiques, ce qui nous permet, pour la première fois, de comprendre la mécanique, et probablement fonctionnelle, l'importance de la complexité dans l'architecture de la matrice et de la biochimie qui a été révélé au cours des dernières années.
La technique de mesure des propriétés mécaniques dans une gamme de fréquences des GHz. Ce domaine n'a jamais été explorée auparavant pour les biopolymères structurelles et à la fois élève et fournit les moyens de répondre à des questions fondamentales sur les mécanismes moléculaires de l'élasticité.
Nous avons décrit les étapes consistant à extraire les fibres de collagène et d'élastine dans les tissus animaux et pour mesurer Brillouin scatteriLes spectres ng utilisant un substrat réfléchissant pour obtenir la description complète de la biomécanique de la fibre. Les étapes critiques au sein du protocole sont ceux qui assurent que les fibres purifiées sont obtenues et les conditions expérimentales appropriées sont en place pour des mesures reproductibles des protéines fibreuses. Cependant, il faut garder à l'esprit que les procédures d'extraction peuvent modifier les propriétés mécaniques des fibres.
Des modifications de la technique impliquent le couplage par microscopie optique pour microfocused diffusion de Brillouin et une cartographie des approches 13 et la combinaison possible avec des techniques complémentaires (par exemple, la diffusion Raman). Les applications actuelles de la technique sont principalement axées sur les matériaux biologiques excisées, mais les développements importants, par exemple, celles qui sont fondées sur plusieurs étalons de VIPA 14, font possible la traduction de cette technique de la paillasse au chevet avec une gamme d'applications déjà démon15,16 tré y compris le potentiel pour des applications in vivo. L'approche VIPA est une alternative à ce que nous décrivons; il a plus rapide temps d'acquisition, mais ne sont pas nécessairement appropriés dans le cas des échantillons opaques tels que ceux analysés ici. De plus, l'utilisation d'un substrat réfléchissant est pas pratique dans set-ups qui utilisent les étalons VIPA parce que leur contraste ne serait pas suffisante pour rejeter la lumière quasi-élastique. Les contraintes liées à la vitesse d'acquisition d'un ensemble de données spectrales et la section intrinsèquement faible diffusion de la croix de la matière peuvent limiter les applications à des systèmes biologiques dynamiques et à l'acquisition de données à partir de profondeur dans les tissus, mais des améliorations techniques peuvent améliorer les performances actuelles.
BLS promet d'être un outil majeur dans la recherche biophysique fondamentale sur la matrice extracellulaire et ainsi de produire de nouvelles connaissances sur l'évolution des propriétés mécaniques lors de la croissance de la matrice et leur perte pathologiquedégénérescence. Cependant, il est important de se rappeler que les mesures sont non invasive et pourraient donc être menées in vivo. En effet, cela a déjà été réalisé dans la cornée 16 et ce travail peut fournir une plate – forme pour le développement de nouveaux outils diagnostiques pour un large éventail de maladies du tissu conjonctif.
élastographie par ultrasons et la microscopie à force atomique (AFM) sont d'autres méthodes de mesure micromécanique, mais la technique BLS offre une meilleure résolution spatiale (sur une échelle subcellulaire) que l'ancien et, contrairement à l'AFM, impose pas de forces mécaniques sur l'échantillon et ne se limite pas à l'analyse uniquement des caractéristiques de surface. moduli Brillouin de collagène et d'élastine sont dans la gamme GPa, tandis que les modules d'Young de souches macroscopiques sont de l'ordre de MPa (plus de détails seront signalés ailleurs). Ce résultat indique un module d'élasticité différentiel avec une forte dépendance à la fréquence d'excitation, grâce àle comportement viscoélastique des fibres. BLS peuvent être appliquées à un large éventail de problèmes et les matériaux en sciences biomédicales. Il peut aider à répondre aux questions sur la physiologie et la pathologie des tissus biologiques, ainsi que de fournir un outil physique pour la compréhension fondamentale des matériaux et des interactions au niveau moléculaire.
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by the Engineering and Physical Sciences Research Council [grant number EP/M028739/1]. RSE was supported by a Santander Postgraduate Research Award 2015.
Chondroitinase ABC | Sigma-Aldrich | C2905 | |
Tris Buffer | Fluka | 93358 | |
Sodium Acetate | Fisher Scientific | S608-500 | |
PBS | Sigma-Aldrich | P4417 | |
Sodium Azide | Fisher Scientific | S2002 | |
Streptomyces Hyaluronidase | Sigma-Aldrich | H1136-1AMP | |
Sodium Chloride | Fisher Scientific | S7653 | |
Trypsin | Sigma-Aldrich | T4665 | |
Sodium Phosphate | Sigma-Aldrich | S9638 | |
Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | S320-500 | |
Pure Water | Millipore | ZRQS0P3WW | Produced In-House |
Distilled Water | Bibby Scientific Limited | D4000 | Produced In-House from water still |
Euthatal | Merial | J01601A | |
Tandem Interferometer TFP-1 | JRS Scientific Instruments | ||
Freezer | Lec | TU55144 | |
Refrigerator | Zanussi | ZBA15021SA | |
Hot Plate | Fisher Scientific | SP88857206 | |
Clamps | VWR | 241-7311 & 241-7201 | |
Clamp Stand | VWR | 241-0093 | |
Thermometer | Fisher Scientific | 13-201-401 | |
Cling Film | Sainsbury's | 7650540 | |
Parafilm | Sigma-Aldrich | P7793-1EA | |
Silicone | IDB Technologies | N/A | No catalogue number. Order upon request |
Cover Glass | VWR | 631-1571 | |
Conical Flask | VWR | 214-1175 | |
Beaker | VWR | 213-0469 | |
Measuring Cylinder | VWR | 612-3838 | |
Vial | VWR | 548-0051 & 548-0863 | |
Petri Dish | VWR | 391-0441 | |
Scalpel | Swann Morton Ltd | 0914 & 0308 | |
Diamond Scribe | RS Instruments | 394-217 | |
Soldering Iron | RS Instruments | 231-5332 | |
Fine Forceps | VWR | 232-0188 | |
Double Micro-Spatula | VWR | Various Sizes | |
pH Meter | Hanna Instruments | HI-2210-02 | |
Orbital Shaker | IKA | 0002819000 |