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Bioengineering

Preparación de la matriz extracelular fibras de proteína de Brillouin Spectroscopy

Published: September 15, 2016
doi:
10.3791/54648
, , , , , ,
1School of Physics and Astronomy,University of Exeter, 2Department of Physics and Geology,University of Perugia, 3Istituto Officina dei Materiali del CNR,Unità di Perugia

Summary

We present a protocol for the application of Brillouin light scattering spectroscopy to elastin and trypsin-purified type I collagen fibers of the extracellular matrix to extract their full elastic properties.

Abstract

Brillouin spectroscopy is an emerging technique in the biomedical field. It probes the mechanical properties of a sample through the interaction of visible light with thermally induced acoustic waves or phonons propagating at a speed of a few km/sec. Information on the elasticity and structure of the material is obtained in a nondestructive contactless manner, hence opening the way to in vivo applications and potential diagnosis of pathology. This work describes the application of Brillouin spectroscopy to the study of biomechanics in elastin and trypsin-digested type I collagen fibers of the extracellular matrix. Fibrous proteins of the extracellular matrix are the building blocks of biological tissues and investigating their mechanical and physical behavior is key to establishing structure-function relationships in normal tissues and the changes which occur in disease. The procedures of sample preparation followed by measurement of Brillouin spectra using a reflective substrate are presented together with details of the optical system and methods of spectral data analysis.

Introduction

El efecto de dispersión de luz de Brillouin (BLS) fue descubierto por Léon Brillouin en 1922. 1 Consiste en la dispersión inelástica de luz visible por fonones acústicos activados térmicamente en un material. En la física de estado sólido, los fonones acústicos son vibraciones coherentes de todos los átomos de una celosía. Una cadena unidimensional de dos tipos alternativos de átomos en una red es un modelo simple que ilustra la diferencia entre los fonones acústicos, reveladas por BLS y fonones ópticos, sondeadas por absorción IR y Raman de dispersión (Figura 1). fonones acústicos son movimientos en fase de átomos en la cadena con un desplazamiento a lo largo de la dirección de propagación (fonones acústicos longitudinales) o perpendicular a la dirección de propagación (transversales fonones acústicos), mientras que los fonones ópticos son movimientos fuera de la fase de los átomos la producción de un momento dipolar eléctrico oscilante (modos transversales longitudinal o).

Spectro BLSscopy se ha utilizado en la ciencia analítica desde la década de 1920; Sin embargo, sólo a partir de la década de 1980 han sido posibles las mediciones de alto contraste a través del uso de múltiples pases del espectrómetro de Fabry-Perot tándem. Desde entonces, un número cada vez mayor de los avances en la BLS para aplicaciones analíticas en la materia condensada (que se explota la interacción fotón-fonón) 2-4 y magnéticas de materiales (a través de la interacción fotón-Magnon) 5 ha sido provocada. Trabajos seminales sobre aplicaciones biomédicas 6-8 han allanado el camino para el desarrollo de diversos enfoques, incluyendo la que se aplica aquí y la anteriormente descrita 9 utilizando un sustrato reflectante en una configuración similar a las plaquetas para conseguir la descripción completa del tensor de elasticidad de una muestra.

En el presente trabajo, se aplica la espectroscopia BLS a los constituyentes fundamentales de la matriz extracelular en los tejidos conectivos, las proteínas fibrosas de elastina y colágeno de tipo I. Tipo I colágeno es una molécula helicoidal rígida, triple, que ensambla lateral y longitudinalmente con extensa reticulación para formar fibras esencialmente rígidos en tejidos tales como tendones. Redes de colágeno a menudo coexisten con las redes de la elastina, una proteína que, excepcionalmente, genera la elasticidad de largo alcance a través de una combinación de entropía y las interacciones hidrofóbicas con su entorno y es esencial para las funciones de los tejidos como el de pulmón y piel. Ambas fibras se modelan mediante un modelo de cristal hexagonal en la investigación actual. 9 En la parte 1, se describe el protocolo para extraer las fibras de los tejidos animales y para preparar la muestra para las mediciones espectroscópicas. En la parte 2, se presenta el procedimiento para configurar el aparato de Brillouin y la adquisición de los espectros de las fibras. Parte 3 da detalles de análisis de datos aplicadas a los espectros de Brillouin para extraer la información relevante contenida en la misma mecánica. A continuación, los resultados representativos se presentan y discuten yare.

Protocol

Precaución: Por favor, consulte los protocolos de seguridad biológicas, todas las fichas de datos de seguridad de materiales pertinentes (MSDS) antes de usar. El láser empleado en estos experimentos es un láser de Clase 3B; Se requiere el cumplimiento de las normas locales para un uso seguro del sistema. Por favor, use todas las prácticas de seguridad apropiadas cuando se realiza una medición de espectroscopia láser incluyendo el uso de equipos de protección individual (gafas de seguridad). tendones de cola se obtuvieron a partir de 7-8 semanas de edad ratas Wistar sacrificados para otros fines, de acuerdo con la regulación de la UE 1099/2009 y el Bienestar de los Animales (masacre o matanza) Reglamento de 1995. bovino ligamentos de la nuca se obtuvieron de un matadero local. 1. Preparación de la muestra Las fibras NOTA: fibras de proteína de la matriz extracelular se pueden extraer de diversos tejidos, utilizando diferentes procedimientos. Protocolos se refinaron en base a los procedimientos aplicados ampliamente. <strong> La extracción de las fibras de colágeno de cola de rata Sacrificar una rata por inyección intra-peritoneal de 100 mg / kg de pentobarbital de sodio de peso corporal. A continuación, cortar la cola directamente en el punto de contacto con el cuerpo, presionando hacia abajo con una hoja de afeitar de un solo filo. Envuelva la cola en papel film y la almacena congelado a -20 ° C hasta su utilización. Recoger la cola del congelador, cortar un segmento de 20 mm de largo desde el extremo proximal, mientras que todavía congelado y luego dejar que se descongele en una placa de Petri llena de solución salina tamponada con fosfato (PBS) (pH 7,4) a TA. Una vez que se descongela la cola, hacer una incisión a lo largo de la longitud del segmento usando un escalpelo para dividir la piel. A continuación, pelar para revelar cuatro haces tendinosos enfundados sobre la vértebra de la cola. Con unas pinzas finas y teniendo cuidado de no aplicar ningún pre-deformación, dibujar suavemente cada fibra de la vaina y lo coloca en un vial que contiene agua destilada con un 0,01% w / v de azida de sodio (NaN3) al prel crecimiento bacteriano evento y consérvelo en refrigerador. Una sola cola produce una treintena de fibras del tendón. Para obtener el tipo fibroso puro colágeno I, aplicar un proceso de digestión enzimática tres partes 10 a las fibras del tendón para eliminar los proteoglicanos y todos los demás materiales no colágena. En primer lugar, sumergir las fibras en 0.125 U / ml de condroitinasa ABC en tampón 0,05 M Tris y acetato de sodio 0,06 M (CH 3 COONa) a pH 8,0 durante 24 horas a 37 ° C en una incubadora de agitación a 200 rpm. A continuación, sumergir las fibras en 1 U / hialuronidasa de Streptomyces ml en tampón Tris 0,05 M y cloruro de sodio 0,15 M (NaCl) a pH 6,0 y volver a la incubadora con agitación durante 24 horas a 37 ° C. Finalmente, sumergir las fibras en 1 mg / ml de tripsina en 0,05 M de fosfato de sodio (NaHPO 4) y 0,15 M de NaCl a pH 7,2 durante 16 horas en la incubadora con agitación a 37 ° C. Almacenar las fibras purificadas refrigerados en viales que contienen agua destilada, wiTH 0,01% NaN 3 para evitar el crecimiento de bacterias, hasta que sea necesario para la medición. La extracción de las fibras de elastina de ligamento nucal bovino Obtener ligamento nucal bovino desde el matadero, se envuelve en papel film y la almacena congelado a -20 ° C hasta su uso. Para producir elastina pura, recoger el ligamento del congelador, deje que se descongele a temperatura ambiente, desengrasar utilizando un bisturí y digerir el ligamento en un baño de agua hirviendo de acuerdo con el procedimiento de Lansing, 11 de la siguiente manera. Preparar una solución de hidróxido de sodio (NaOH) en agua destilada 0,1 M y añadirlo al ligamento desgrasada en un matraz cónico, que cubre el tejido. Hervir el matraz en un baño de agua a 95 ° C durante 45 min. Retire el ligamento del matraz de digestión y se lava el bloque de tejido insoluble repetidamente en agua destilada hasta que se obtiene pH 7,0 (controlado utilizando un medidor de pH). Retire el tejido de la finallavar la solución y sumergirlo en agua destilada (mezclado con 0,01% NaN 3 para evitar el crecimiento bacteriano) en un recipiente sellado y almacenar refrigerado. Recoger el tejido de la nevera y, con cuidado de no aplicar demasiada fuerza y pre-deformación, utilizar pinzas para tirar suavemente de elastina segmentos más pequeños (20 a 50 mm de largo, aproximadamente 2 mm de espesor) de distancia del bloque más grande y colocarlos en una placa de Petri con una solución de PBS (pH 7,4). Con unas pinzas finas, se burlan suavemente pequeños haces de fibras alrededor de 1 mm de espesor y cortar a trozos de unos pocos mm con un bisturí. La transferencia de las fibras a viales que contienen agua destilada (con 0,01% NaN 3 para evitar el crecimiento bacteriano) y almacenarlos refrigeradas hasta que sea necesario para la medición. El montaje de las fibras sobre sustrato reflectante Usando un cortador de diamante, cortar un trozo de diapositivas de silicona reflectante. Para crear un compartme hidratadont, cortar una tira de Parafilm para ajustarse sobre el portaobjetos de silicona con un corte hueco en el centro (lo suficientemente grande como para caber una fibra) y colocarlo sobre el sustrato de silicona. NOTA: Para las mediciones de fibras secas, cortar el Parafilm en forma de U de modo que uno de los cuatro lados queda abierto al aire cuando se sella en el paso 1.3.4. Retire las fibras de la nevera, utilizar un par de pinzas finas para recoger una sola fibra de la solución de almacenamiento y colocarlo en una pequeña placa de Petri llena de agua pura a temperatura ambiente durante 5 min para lavar la muestra. Después, recoger la fibra y la transfiere al centro de la hondonada Parafilm sobre el sustrato de silicona. Cuidado: Evite dañar la fibra mediante el estiramiento durante esta operación, y evitar la reorientación de la muestra sobre el sustrato ya que esto puede causar un cambio en las propiedades mecánicas. Colocar un cubreobjetos de vidrio delgada sobre la fibra y sellar la cámara haciendo pasar un soldador se calienta suavemente sobre la superficie de vidrio para fundir la parafina por debajoel cristal. Cuidado: Evite dañar la fibra al no haber puesto la punta de soldadura demasiado cerca o calentar el sustrato en exceso. Coloque la cámara sellada sobre una superficie plana bajo un peso pequeño y se deja durante alrededor de 12 horas para lograr un buen contacto entre el sustrato de la muestra y el silicio, evitando daños en la muestra. Retire el peso y asegurar la cámara en posición sobre el sustrato, utilizando tornillos. 2. Configuración del Experimento de Brillouin y la adquisición de la fibra Spectra Preparación de compartimiento de la muestra Montar la muestra preparada como en la parte 1.3 sobre un soporte vertical equipado con un goniómetro para permitir la rotación en el plano de la muestra mientras se mantiene un ángulo de dispersión constante (2 Φ = 90 °; ver Figura SI-1) y la dispersión de la posición de volumen. Realizar un ajuste de enfoque preciso de la luz láser en la muestra a través de la lens. 9 Cuidado: La potencia de salida del láser puede ser demasiado alta y producir una quemadura en la muestra. Asegúrese de que está configurado suficientemente alta para dar una buena sensibilidad, pero no demasiado alta para evitar daños en la muestra. Aquí hemos utilizado una potencia de ca. 76 mW en la muestra. Esto fue suficiente para obtener una buena sensibilidad sin quemar la muestra, también teniendo en cuenta que es delgado y en contacto con un sustrato que ayuda a disipar el calor generado por la iluminación láser. Coloque la muestra en un ángulo de 45 ° (Φ) para el haz láser incidente utilizando una escala de Vernier. Lograr un posicionamiento óptimo mediante la ejecución de una medición y la maximización de la intensidad de los picos en el espectro (ver abajo). Configuración del espectrómetro Abra el software para la adquisición y manipulación de los datos y configurar la adquisición de un espectro de Brillouin de la muestra 12. El procedimiento descrito aquí se aplica a la multipass interferómetro tándem (Figura SI-1A). Alinear los dos interferómetros Fabry-Perot (FP) que cambian de forma independiente los voltajes aplicados al piezoeléctrico por la unidad de control. Para este procedimiento de pre-alineación, observe la luz reflejada por cada FP. Cuando la intensidad reflejada por los dos programas marco tiende a cero, se alcanza la alineación correcta. Calibrar el espectro: la gama de frecuencias accesible, o rango espectral libre (FSR), depende de la distancia entre los dos espejos de la primera cavidad FP, L, a través de FSR = c / 2 L, donde c es la velocidad de la luz y L se mide por una línea de calibre. Sincronizar las imágenes escaneadas de los dos interferómetros de PF y cambiar el sistema óptico a la configuración en tándem muchas pasadas. Un control de retroalimentación de la intensidad de la luz láser transmitida mantendrá automáticamente la alineación de los dos programas marco durante la medición. medir el tif Brillouin Spectra Cuidado: El espectro de Brillouin es dependiente de la temperatura y la hidratación de la muestra y de control de modo cuidadoso de estos parámetros altamente es clave para la obtención de espectros reproducible. Iniciar la adquisición de un espectro de Brillouin de la muestra y ejecutarlo hasta que se logre una buena relación señal-ruido. Esto puede tardar varios minutos dependiendo de la sección transversal de dispersión, concentración y espesor de la muestra. NOTA: No hay una regla de oro para la relación señal-ruido, pero la calidad espectral está marcada por el experimentador en base a la muestra específica analizada. Hay un compromiso entre la calidad espectral y la duración de la medición, por lo tanto, los parámetros experimentales deben ser seleccionados de acuerdo con la aplicación específica. Para la medición de una muestra seca, tomar espectros sucesivos – para cada uno de ellos, después del paso 2.3.1 – hasta que no los cambios en la posición de los picos is observaron. Esto se logra cuando la muestra está en equilibrio con la atmósfera de la habitación y no más allá de secado afectará el espectro. Seleccione la polarización de la luz (VV o VH; V significa vertical y H de la dirección horizontal de la polarización de la luz en relación con el plano de dispersión) y adquirir los espectros en cada ángulo de eje de la fibra (θ; Figura SI-1) mediante la rotación de la muestra en avión con la mano. Guarde los espectros de Brillouin para presentar para su posterior procesamiento. 3. Análisis de Brillouin Spectra NOTA: el análisis de los picos de Brillouin Fit pueden llevar a cabo utilizando diversas funciones. Un oscilador armónico amortiguado (DHO) Función de 4,13 fue seleccionado como este es un modelo válido para los picos procedentes de modos acústicos amortiguadas en medios viscoelásticos. Análisis de ajustes de los picos de Brillouin Seleccione el rango espectral para el pico de interés en THespectro de Brillouin e. Activar una línea de base en el ajuste si el fondo espectral es mucho mayor que cero. NOTA: La línea de base puede variar entre los espectros. Asegúrese de que la corrección se aplica de una manera sistemática y reproducible. Aplicar una detallada mínimos cuadrados ajustados utilizando una función de DHO 4,13 al pico Brillouin de interés de forma iterativa hasta que se alcanza la convergencia y se obtiene la mejor curva de ajuste. A continuación, guardar los resultados ajustados a presentar. Obtener valores medios de los parámetros de ajuste de los dos picos de cada doblete de Brillouin. Calcular la velocidad de la onda acústica de la frecuencia pico (utilizando la expresión a continuación). Representar gráficamente los resultados ajusten a través de gráficos, por ejemplo, velocidad de la onda acústica función del ángulo de eje de la fibra, θ Y aplicar modelos pertinentes (por ejemplo, para los sistemas acústicamente anisotrópicas 9) para extraer cantidades mecánicas tales como coeficientes de elasticidad del tensor.

Representative Results

El aparato de espectroscopía Brillouin usado en este experimento (Figura SI-1A) se ha descrito previamente. 9 Emplea un único modo 532 de láser de estado sólido nm con potencia de salida 76 mW en la muestra. Una lente acromática 20 cm enfoca la luz láser sobre la muestra y recoge la luz dispersada de la muestra en una geometría de retrodispersión. Un tándem multipaso interferómetro Fabry-Perot se utiliza para el filtrado de la luz dispersada, que se detecta entonces mediante un detector de fotodiodo de bajo ruido. Este enfoque da un contraste extremadamente alto (alrededor de 120 dB) y la estabilidad a través del auto-alineación piezo-escaner de etalones. Un polarizador y el analizador se introducen para seleccionar la polarización de la luz incidente y dispersada. Los espectros se obtiene normalmente con el polarizador mantiene fija la selección de la dirección vertical (V) de la polarización de la luz incidente y el analizador de seleccionar alternativamente la vertical (V) or horizontal (H) dirección de la polarización de luz dispersa. En esta configuración, los modos acústicos longitudinales y transversales se detectan respectivamente. Un espectro típico de Brillouin tiene un pico central intensa debido a la dispersión elástica y uno o más conjuntos de picos igualmente desplazado, o dobletes de Brillouin, que son la firma de la mecánica de la muestra. En estas mediciones, la luz dispersada se puede originar tanto a partir de fonones a granel que viajan cuasi-ortogonal a la muestra y, después de la reflexión de la luz incidente en la superficie de la muestra-sustrato, de fonones a granel que viajan paralelo a la superficie (modos PS). 9 La Figura 2 muestra los espectros de BLS de fibras de colágeno de tipo tripsina digerido secos y hidratados obtenidos con polarización VV a 0,2 GHz resolución, con un rango espectral libre 30 GHz y aproximadamente el tiempo de recogida de 10 minpor espectro. Cada espectro corresponde a un ángulo específico de rotación, θ (Figura SI-1C). En la fibra de colágeno seco en θ = 0 °, modos longitudinales dan lugar a un pico mayor a (18,92 ± 0,02) GHz mientras que el modo de PS está en (9,85 ± 0,03) GHz (Figura 2A). El pico PS se desplaza hacia frecuencias más bajas como θ va desde 0 ° (fonones sondear la orientación axial de la fibra) y 90 ° (fonones sondeando la orientación radial), mientras que el pico mayor sólo un poco de color rojo-Cambios en la cambio de θ en el mismo rango (fonón de sondeo una dirección casi radial a lo largo de la rotación). En la fibra de colágeno húmedo, los dos picos debido a los fonones longitudinales son esencialmente sin cambios durante todo el experimento, con el pico mayor a aproximadamente 10,5 GHz y el pico PS en 4,9 GHz (Figura 2B). Esto indica una reducción del 80 al 100% en la frecuencia de pico (en relación con los datos de 18,92y 9,85 GHz, respectivamente), y por lo tanto de la rigidez del material, debido a la hidratación. Tenga en cuenta que los modos granel y PS de colágeno hidratado se encuentran cerca de la frecuencia de los modos de agua pura, lo que sugiere que sus constantes elásticas son una combinación de los aportes de agua y fibra, con un papel dominante que desempeña el agua. La Figura 3 muestra un espectro de fibra de colágeno digerida con tripsina seco medido a θ = 30 ° con VH de polarización; una fuga de la polarización VV permite que el PS y los picos a granel que deben observarse todavía. Modos transversales representan un pico en (4,1 ± 0,2) GHz (θ = 0 °), que ligeramente azul en turnos como cambios theta de 0 ° a 90 °. También se muestran los resultados aptos tanto para el transversal y picos PS. Se extrajeron los parámetros de pico y velocidades de las ondas acústicas se derivaron como V L = v λ / √2, donde <em> v es la frecuencia del modo obtenido por análisis de la curva de ajuste de los picos y λ es la longitud de onda de excitación, 532 nm. Nótese que en esta geometría, no se requiere el conocimiento del índice de refracción del material para obtener la velocidad modo acústico (debido a la geometría de dispersión, q s = 2 k i sen (Φ); Figura SI-1b, c), por lo tanto, haciendo de este enfoque especialmente ventajoso. La Figura 4 es un gráfico de las velocidades de las ondas acústicas obtenidas de modos longitudinales y transversales (picos PS y T) como una función de la θ ángulo . El análisis ajustaron a un modelo de forma hexagonal simétrica sólido elástico 7 – Ecuaciones A1 y ​​A2 abajo – proporciona los cinco componentes del tensor de elasticidad de tipo tripsina digerido seca que las fibras de colágeno (Tabla 1). <p class="jove_content" fo:keep-together.wentro-page = "1"> Las velocidades de las ondas acústicas longitudinales y transversales están dadas por 9 , (A1) , (A2) donde ρ es la densidad del material, y c 11, c 33, c 44 c y 13 son cuatro de los cinco constantes elásticas que caracterizan a los sistemas con una simetría hexagonal. La quinta constante, c 12, se puede derivar de la relación aproximada c 12 ~ c 11 -. 2 c 44 7 Los coeficientes son similares a los obtenidos anteriormente a partir de fibe colágeno sin purificarrs. 9 Una diferencia notable se produce para el coeficiente c 13 que se refleja en valores similares de los módulos de elasticidad E y E ǁ (Aproximadamente el 7,2 y el 7,7 GPa) para el colágeno purificado. La Figura 5 es un gráfico de la velocidad de la onda acústica longitudinal de colágeno húmedo frente a θ . En este caso, no se observa cambio periódico en frecuencia, dando una velocidad constante dentro del error. La figura 6 muestra los espectros de las fibras de elastina y secos hidratados medidos a theta = 0 °. modos transversales no se detectaron para estas muestras. En elastina seco, el pico mayor se produce a 16,8 GHz, mientras que el modo de PS a 8,2 GHz 9 (13 y 20% más bajos que los correspondientes picos de colágeno seco). las fibras de elastina húmedos presentan una mayor pEAK al (12.30 ± 0.01) GHz (un 37% más baja en la frecuencia que el pico mayor de la elastina en seco). El modo de PS de la elastina en húmedo no es evidente en el espectro debido a la intensa cola del pico elástico en esas frecuencias. Por otra parte, el pico a aproximadamente 7,5 GHz se atribuye al agua a granel. La Figura 7 muestra la dependencia de la velocidad de onda acústica en fibra elastina seca en θ. A partir de estos datos, los componentes del tensor de elasticidad (y módulos mecánica) se obtuvieron (Tabla 1). 9 Como en colágeno húmedo, hay evidencia de isotropía en el módulo mecánico de las fibras de elastina hidratadas. Estos resultados indican cómo la espectroscopia de Brillouin puede dar información relevante sobre la rigidez, la composición y los aspectos estructurales de un material. Figura 1. acústica y fonones ópticos en cadena unidimensional de átomos. Diagrama esquemático de vibraciones acústicas y ópticas en una cadena diatómico unidimensional. Los átomos tienen una masa m 1 y m 2 y se alternan. Las flechas indican los desplazamientos de los átomos. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 2. Espectros de Brillouin de tipo tripsina purificada I fibras de colágeno de tendón de cola de rata. Spectra de (A) de fibra seca y (B) hidratado de fibra a partir de mediciones VV en un ángulo diferente a la fibra de eje θ, en grados. También se muestra un espectro de agua destilada pura. Los espectros se normalizaron a la intensidad (altura) del pico mayor. Las etiquetas B y PS denotan picos relacionados con mayor y los modos en paralelo a la superficie, respectivamente. Las barras de error indican el error estándar (raíz cuadrada del número de cuentas). Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 3. espectro de Brillouin de tipo tripsina purificado seco me fibras de colágeno de tendón de cola de rata. Espectro de una medición de VH en θ = 30 °. Las etiquetas T, PS y B denotan picos relacionados con los modos transversales, paralelas-tierra y áridos, respectivamente. También se muestran los resultados del análisis de ajuste utilizando un modelo de oscilador armónico amortiguado (DHO) para ambos modos T y PS. Las barras de error indican el error estándar (raíz cuadrada del número de cuentas)./54648fig3large.jpg "Target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 4. Gráfico de la velocidad de la onda acústica en el colágeno de tipo tripsina purificado seco vs ángulo de eje de la fibra. Velocidades de la onda acústica longitudinal y transversal de la fibra de colágeno seco derivados del análisis de ajuste de los picos de Brillouin. Los datos se ajustaron a un modelo de sólido elástico hexagonal simétrica. Línea roja: Ecuación A1 (R2 = 0,99); línea azul: La ecuación A2 (R2 = 0,36). Las barras de error indican los errores estándar obtenidos a partir de la raíz cuadrada de los elementos diagonales de la matriz de covarianza después de un no-lineales de Levenberg-Marquardt ajuste de mínimos cuadrados de los espectros de Brillouin. Haga clic aquí para conocer el Versi más grandes el de esta figura. Figura 5. Gráfico de la velocidad de la onda acústica longitudinal en el colágeno de tipo tripsina purificada húmeda vs ángulo de eje de la fibra. Velocidad de la onda acústica longitudinal de las fibras de colágeno hidratado derivado del análisis de ajuste de los picos de Brillouin. La línea mostrada es una guía para el ojo y da el valor medio de la velocidad de la onda acústica en este rango. Las barras de error indican los errores estándar obtenidos a partir de la raíz cuadrada de los elementos diagonales de la matriz de covarianza después de un no-lineales de Levenberg-Marquardt ajuste de mínimos cuadrados de los espectros de Brillouin. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. jpg "/> Figura 6. Brillouin espectros de fibras de elastina de ligamento nucal bovino. Spectra de fibra seca e hidratada en θ = 0 °. Los espectros se normalizaron a la intensidad (altura) del pico mayor. Las etiquetas B y PS denotan picos relacionados con mayor y los modos en paralelo a la superficie, respectivamente. B F y B W se refieren a los picos a granel de la fibra y el agua, respectivamente. Las barras de error indican el error estándar (raíz cuadrada del número de cuentas). Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 7. Diagrama de la velocidad de la onda acústica longitudinal en la elastina seco respecto al ángulo de eje de la fibra. Velocidad de la onda acústica longitudinal de fib elastina secaer ajuste derivado del análisis de los picos de Brillouin. Los datos se ajustaron a un modelo de sólido elástico hexagonal simétrica. Línea roja: Ecuación A1 9 (R2 = 0,74). Las barras de error indican los errores estándar obtenidos a partir de la raíz cuadrada de los elementos diagonales de la matriz de covarianza después de un no-lineales de Levenberg-Marquardt ajuste de mínimos cuadrados de los espectros de Brillouin. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura SI-1. Esquema de la Brillouin configuración y BLS geometría de dispersión. (A) la luz incidente emitida por un láser de estado sólido se envía a la muestra a través de una lente acromática. La luz dispersada por fonones acústicos a granel y por las que resultan de reflreflexión de la luz en la superficie del sustrato, que está en contacto con la muestra, es recogida por la lente, se filtró por un interferómetro Fabry-Perot en tándem multipaso y detectada por un fotomultiplicador. FP1 y FP2 indican los dos interferómetros que constituyen el tándem puesta a punto. Un polarizador selecciona la polarización de la luz incidente, y un analizador se utiliza para seleccionar la polarización de la luz dispersada. (B) la geometría BLS con una muestra en contacto con la superficie de un sustrato de silicio reflectante. Un portaobjetos de vidrio (no mostrada) se coloca encima de la muestra para sellar el compartimiento, y una suave presión se aplica a través de almohadillas en las esquinas del sustrato. La luz incidente (k i) pasa a través de la lente, se refracta en la interfase aire-muestra (k 'i) y se centró en la interfaz de la muestra-substrato. La luz dispersada recogida por el mismo objetivo (k 's) se debe a la interacción con los dos fonones a granel (qb) y aquellos que viajan PS de la muestra (q s). . Ángulos entre las direcciones de la luz y la normal a la superficie se indican como Φ y Φ '(C) Diagrama esquemático de la muestra y del sistema de coordenadas adoptado; z define el eje extraordinario paralelo a la dirección de las fibras. Ángulos θ y α son las que existen entre la dirección de fonones q s y q b para el eje x z, respectivamente k i, k 'i, k s, k' s:. Números de onda de la luz incidente y dispersado; b q, q s, vectores de onda de los modos PS y mayor, respectivamente. (Tomado de ref 9.) Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. <pclass = "jove_content" fo: keep-con-next.within-page = "always"> Tabla 1. Los coeficientes del tensor elástico de ajuste derivados del análisis de las velocidades de las ondas acústicas coeficientes tensores elásticos de tipo seco tripsina purificada de colágeno I (fibras. este trabajo) y las fibras de elastina (ref 9). muestra coeficientes elásticos (ACP) colágeno digerido con tripsina c 33 18,7 ± 0,1 c 11 14,4 ± 0,2 c 44 3,4 ± 0,1 c 12 7,2 ± 0,2 c 13 11,2 ± 0,3 elastina c 33 11,5 ± 0,2 c 11 10,4 ± 0,1 c 44 1,9 ± 0,2 c 12 6,6 ± 0,2 c 13 6,8 ± 0,3

Discussion

espectroscopía Brillouin dispersión es una herramienta única por la que los componentes individuales del tensor de elasticidad de una fibra de proteína se pueden caracterizar en detalle sin precedentes. Por otra parte, las mediciones se pueden realizar en una escala microscópica y por lo tanto nos proporcionará nuevos conocimientos sobre los mecanismos de micro-escala de las estructuras biológicas, lo que nos permite, por primera vez, para entender la mecánica, y probablemente funcional, la importancia de las complejidades en la arquitectura de la matriz y la bioquímica que se ha revelado en los últimos años.

La técnica mide propiedades mecánicas en un rango de frecuencia GHz. Este dominio nunca ha sido explorado antes de biopolímeros estructurales y que tanto eleva y proporciona los medios para responder a las preguntas fundamentales acerca de los mecanismos moleculares de la elasticidad.

Describimos los pasos para extraer las fibras de colágeno y elastina de los tejidos animales y para medir scatteri Brillouinespectros ng utilizando un sustrato reflectante para lograr la descripción completa de la biomecánica de la fibra. Los pasos críticos en el protocolo son los que aseguran que las fibras se obtienen purificadas y las condiciones experimentales adecuadas están en su lugar para mediciones reproducibles de las proteínas fibrosas. Sin embargo, hay que tener en cuenta que los procedimientos de extracción pueden modificar las propiedades mecánicas de las fibras.

Las modificaciones de la técnica implican el acoplamiento con el microscopio óptico para la dispersión de Brillouin microfocused y mapeo se acerca 13 y la posible combinación con técnicas complementarias (por ejemplo, la dispersión Raman). Las aplicaciones actuales de la técnica se centran principalmente en materiales biológicos extirpados, pero los acontecimientos importantes, por ejemplo, los basados ​​en múltiples etalones VIPA 14, están haciendo posible la traducción de esta técnica de la mesa de trabajo a la cama con una gama de aplicaciones ya demoniotrado 15,16 incluyendo potencial en aplicaciones in vivo. El enfoque VIPA es una alternativa a lo que describimos; que tiene el tiempo de adquisición más rápido, pero no es necesariamente adecuado en el caso de muestras opacas tales como los analizados aquí. Por otra parte, el uso de un sustrato reflectante no es práctico en montajes que utilizan los etalones VIPA porque su contrario no sería suficiente para rechazar la luz cuasi-elástica. Limitaciones relacionadas con la velocidad de la adquisición de un conjunto de datos espectrales y la sección eficaz de dispersión inherentemente débil del material pueden limitar las aplicaciones a sistemas biológicos dinámicos y a la adquisición de los datos de las profundidades de los tejidos, pero refinamientos técnicos pueden mejorar el rendimiento actual.

BLS promete ser una herramienta importante en la investigación biofísica fundamental sobre la matriz extracelular y por lo tanto para producir nuevos conocimientos sobre la evolución de las propiedades mecánicas durante el crecimiento de la matriz y su pérdida en patológicadegeneración. Sin embargo, es importante recordar que las mediciones son no invasivos y, por tanto, pueden llevarse a cabo in vivo. De hecho, esto ya se ha logrado en la córnea 16 y tal trabajo puede proporcionar una plataforma para el desarrollo de nuevas herramientas de diagnóstico para una amplia gama de trastornos del tejido conectivo.

El ultrasonido elastografía y la microscopía de fuerza atómica (AFM) son métodos alternativos de medición de micromecánica, pero la técnica BLS ofrece una mejor resolución espacial (en una escala subcelular) que el anterior y, a diferencia de AFM, no impone fuerzas mecánicas en la muestra y no se limita a el análisis sólo de características de la superficie. módulos de Brillouin de colágeno y elastina están en el rango GPa, mientras que los módulos de Young de las cepas macroscópicas son del orden de MPa (más detalles serán reportados en otra parte). Este resultado indica un módulo de elasticidad diferencial con una fuerte dependencia de la frecuencia de excitación, debido ael comportamiento viscoelástico de las fibras. BLS se pueden aplicar a una amplia gama de problemas y materiales en la ciencia biomédica. Puede ayudar a la hora de responder preguntas sobre la fisiología y patología de los tejidos biológicos, así como proporcionar una herramienta física para la comprensión fundamental de los materiales y las interacciones a nivel molecular.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported by the Engineering and Physical Sciences Research Council [grant number EP/M028739/1]. RSE was supported by a Santander Postgraduate Research Award 2015.

Materials

Chondroitinase ABC Sigma-Aldrich C2905
Tris Buffer Fluka 93358
Sodium Acetate Fisher Scientific S608-500
PBS Sigma-Aldrich P4417
Sodium Azide Fisher Scientific S2002
Streptomyces Hyaluronidase  Sigma-Aldrich H1136-1AMP
Sodium Chloride Fisher Scientific S7653
Trypsin Sigma-Aldrich T4665
Sodium Phosphate Sigma-Aldrich S9638
Sodium Hydroxide Fisher Scientific S320-500
Pure Water Millipore ZRQS0P3WW Produced In-House 
Distilled Water Bibby Scientific Limited D4000 Produced In-House from water still
Euthatal Merial  J01601A 
Tandem Interferometer TFP-1 JRS Scientific Instruments
Freezer Lec TU55144
Refrigerator Zanussi ZBA15021SA
Hot Plate Fisher Scientific SP88857206
Clamps VWR 241-7311 & 241-7201
Clamp Stand VWR  241-0093
Thermometer Fisher Scientific 13-201-401
Cling Film Sainsbury's 7650540
Parafilm Sigma-Aldrich P7793-1EA
Silicone IDB Technologies N/A No catalogue number. Order upon request
Cover Glass VWR 631-1571
Conical Flask VWR 214-1175
Beaker VWR 213-0469
Measuring Cylinder VWR 612-3838
Vial VWR 548-0051 & 548-0863
Petri Dish VWR 391-0441
Scalpel Swann Morton Ltd  0914 & 0308
Diamond Scribe RS Instruments 394-217
Soldering Iron RS Instruments 231-5332
Fine Forceps VWR 232-0188
Double Micro-Spatula VWR Various Sizes
pH Meter Hanna Instruments HI-2210-02
Orbital Shaker IKA  0002819000
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References

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Edginton, R. S., Mattana, S., Caponi, S., Fioretto, D., Green, E., Winlove, C. P., Palombo, F. Preparation of Extracellular Matrix Protein Fibers for Brillouin Spectroscopy. J. Vis. Exp. (115), e54648, doi:10.3791/54648 (2016).
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