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Bioengineering

Preparação de Matriz Extracelular fibras de proteína de Brillouin Spectroscopy

Published: September 15, 2016
doi:
10.3791/54648
, , , , , ,
1School of Physics and Astronomy,University of Exeter, 2Department of Physics and Geology,University of Perugia, 3Istituto Officina dei Materiali del CNR,Unità di Perugia

Summary

We present a protocol for the application of Brillouin light scattering spectroscopy to elastin and trypsin-purified type I collagen fibers of the extracellular matrix to extract their full elastic properties.

Abstract

Brillouin spectroscopy is an emerging technique in the biomedical field. It probes the mechanical properties of a sample through the interaction of visible light with thermally induced acoustic waves or phonons propagating at a speed of a few km/sec. Information on the elasticity and structure of the material is obtained in a nondestructive contactless manner, hence opening the way to in vivo applications and potential diagnosis of pathology. This work describes the application of Brillouin spectroscopy to the study of biomechanics in elastin and trypsin-digested type I collagen fibers of the extracellular matrix. Fibrous proteins of the extracellular matrix are the building blocks of biological tissues and investigating their mechanical and physical behavior is key to establishing structure-function relationships in normal tissues and the changes which occur in disease. The procedures of sample preparation followed by measurement of Brillouin spectra using a reflective substrate are presented together with details of the optical system and methods of spectral data analysis.

Introduction

O efeito de luz espalhamento de Brillouin (BLS) foi descoberto por Léon Brillouin em 1922. 1 Consiste na espalhamento inelástico da luz visível por fônons acústicos termicamente ativados em um material. Em física do estado sólido, fônons acústicos são vibrações coerentes de todos os átomos em uma grade. Uma cadeia unidimensional de dois tipos alternados de átomos numa estrutura é um modelo simples que ilustra a diferença entre fonões acústicos, reveladas por BLS, e fonões ópticos, sondados por absorção de IV e Raman (Figura 1). fonões acústicos estão em fase movimentos de átomos na cadeia com um deslocamento ao longo da direcção de propagação (fonões acústicos longitudinais) ou perpendicular à direcção de propagação (transversais fonões acústicas), enquanto fonões ópticos são movimentos fora-de-fase dos átomos a produção de um momento de dipolo eléctrico oscilante (longitudinal ou modos transversais).

BLS spectroscopy tem sido utilizado em ciência analítica desde 1920; No entanto, apenas desde a década de 1980 medições de alto contraste foi possível através da utilização do conjunto de passagem múltipla espectrómetro de Fabry-Perot. Desde então, um número crescente de avanços em SBV para aplicações analíticas em matéria condensada (onde a interação fóton-phonon é explorada) 2-4 e magnéticas de materiais (através da interação fóton-magnon) 5 foi trazido. Obras seminais sobre aplicações biomédicas 6-8 abriram o caminho para o desenvolvimento de várias abordagens, incluindo o aplicado aqui e o descrito anteriormente 9 utilizando um substrato reflexivo em uma configuração semelhante a plaquetas para conseguir a descrição completa do tensor elasticidade da uma amostra.

No presente trabalho, nós aplicamos a espectroscopia BLS para os constituintes fundamentais da matriz extracelular em tecidos conjuntivos, as proteínas fibrosas elastina e tipo I-colágeno. Tipo I colagénio é uma molécula helicoidal rígida, triplo que monta lateralmente e longitudinalmente, com extensa de ligações cruzadas para formar fibras essencialmente rígidos em tecidos tais como tendões. Redes de colágeno, muitas vezes co-existir com as redes de elastina, uma proteína que, excepcionalmente, gera de longo alcance elasticidade através de uma combinação de entropia e interações hidrofóbicas com o seu ambiente e é essencial para as funções de tecidos tais como pulmões e pele. Ambas as fibras são modeladas utilizando um modelo de cristal hexagonal na pesquisa atual. 9 Na parte 1, nós descrevemos o protocolo para extrair as fibras de tecidos animais e para preparar a amostra para as medições espectroscópicas. Na parte 2, o procedimento para configurar o aparelho de Brillouin e aquisição de espectros a partir das fibras é apresentado. Parte 3 apresenta detalhes da análise de dados aplicados aos espectros de Brillouin para extrair a informação relevante mecânica nele contidas. Em seguida, os resultados representativos são apresentados e Discussed.

Protocol

Cuidado: Por favor, consulte os protocolos de segurança biológica e todas as folhas de dados de segurança pertinentes (MSDS) antes do uso. O laser utilizado nestas experiências é um laser de Classe 3B; conformidade com as regras locais para uma utilização segura do sistema é necessária. Por favor, use todas as práticas de segurança adequadas ao realizar uma medição de espectroscopia a laser, incluindo o uso de equipamento de proteção individual (óculos de segurança). tendões da cauda foram obtidas de 7-8 semanas de idade ratos Wistar sacrificados para outros fins, em conformidade com a regulamentação da UE 1099/2009 e o bem-estar dos Animais (abate ou morte) Regulations 1995. Bovinos ligamento da nuca foram obtidos a partir de um matadouro local. 1. Preparação da Amostra As fibras NOTA: fibras de proteína da matriz extracelular podem ser extraídos a partir de vários tecidos, utilizando procedimentos diferentes. Protocolos foram refinados com base em procedimentos amplamente aplicadas. <strong> Extração de fibras de colagénio de cauda de rato Sacrificar um rato por injecção intra-peritoneal de 100 mg / kg de pentobarbitona de sódio de peso corporal. Em seguida, cortar a cauda diretamente para o ponto de contato com o corpo, pressionando para baixo com uma lâmina de ponta única. Enrole a cauda em película aderente e armazená-lo congeladas a -20 ° C até ser necessário. Recolhe-se o rabo do congelador, cortar um segmento de 20 mm de comprimento a partir da extremidade proximal, enquanto ainda congelado e, em seguida, deixar a descongelar em uma placa de Petri cheio com solução salina tamponada (PBS), solução de fosfato (pH 7,4) à temperatura ambiente. Uma vez que a cauda é descongelada, fazer uma incisão ao longo do comprimento do segmento utilizando um bisturi para dividir a pele. Em seguida, descasque para trás para revelar quatro pacotes tendão bainha sobre a vértebra da cauda. Usando uma pinça fina e tomando cuidado para não aplicar qualquer pré-tensão, gentilmente desenhar cada fibra de fora da bainha e colocá-lo em um frasco contendo água destilada com 0,01% w / v de azida de sódio (NaN 3) para prcrescimento bacteriano evento, e armazenar refrigerado. A cauda único produz cerca de trinta fibras do tendão. Para obter o tipo fibroso puro colágeno I, aplicar um processo de digestão enzimática de três porções 10 das fibras do tendão para remover os proteoglicanos e todos os outros materiais noncollagenous. Em primeiro lugar, as fibras de mergulhar em 0,125 U / ml de condroitinase ABC em tampão Tris 0,05 M e acetato de sódio 0,06 M (CH3 COONa) a pH 8,0 durante 24 horas a 37 ° C numa incubadora com agitação a 200 rpm. Em seguida, mergulhar as fibras em 1 U / ml de hialuronidase de Streptomyces em tampão Tris 0,05 M e 0,15 M de cloreto de sódio (NaCl) a pH 6,0 e retornar para o incubador com agitação durante 24 h a 37 ° C. Finalmente, as fibras imergir em 1 mg / ml de tripsina em tampão fosfato de sódio 0,05 M (NaHPO4) e NaCl 0,15 M a pH 7,2 durante 16 horas na incubadora com agitação a 37 ° C. Armazenar as fibras purificadas refrigerados em frascos contendo água destilada, with 0,01% de NaN3 para prevenir o crescimento bacteriano, até ser necessário para a medição. Extração de fibras de elastina do ligamento da nuca bovina Obter ligamento da nuca bovina do matadouro, envolvê-la em filme plástico e guarde-congeladas a -20 ° C até o uso. Para produzir elastina puro, recolher o ligamento do congelador, permitir a descongelar à temperatura ambiente, secar-lo utilizando um bisturi e digerir o ligamento num banho de água em ebulição de acordo com o procedimento Lansing, 11 como se segue. Prepara-se uma solução de hidróxido de sódio (NaOH), em água destilada a 0,1 M e adicioná-lo ao ligamento desengordurada num balão cónico, cobrindo o tecido. Ferver o balão num banho de água a 95 ° C durante 45 min. Remover o ligamento do frasco de digestão e lavar o bloco de tecido insolúvel na água destilada repetidamente até pH 7,0 (monitorizado utilizando um medidor de pH) é obtido. Remover o tecido a partir da últimasolução de lavagem e pode ser mergulhado em água destilada (misturado com 0,01% de NaN3 para prevenir o crescimento bacteriano) num recipiente selado e armazená-lo refrigerado. Recolher o tecido do frigorífico e, tomando cuidado para não aplicar muita força e pré-tensão, use uma pinça para puxar delicadamente segmentos menores elastina (20 a 50 mm de comprimento, cerca de 2 mm de espessura) de distância do bloco maior e colocá-los numa placa de Petri com solução de PBS (pH 7,4). Usando uma pinça fina, gentilmente provocar pequenos feixes de fibras em torno de 1 mm de espessura e cortá-los em comprimentos de alguns mm utilizando um bisturi. Colocar as fibras para frascos contendo água destilada (com 0,01% de NaN3 para prevenir o crescimento bacteriano) e armazená-los refrigerado até ser necessário para a medição. Montagem das fibras no substrato reflexivo Usando um cortador de diamante, corte um pedaço de slides silicone reflexiva. Para criar um compartme hidratadont, corte uma tira de Parafilm para caber sobre a lâmina de silicone com um corte oco no centro (grande o suficiente para caber uma fibra) e colocá-lo sobre o substrato de silicone. NOTA: Para medições de fibra seca, cortada a parafilme em forma de U de modo a que um dos quatro lados fica aberto para o ar, quando selada no passo 1.3.4. Remover as fibras do frigorífico, usar um par de fórceps finos para recolher uma única fibra a partir da solução de armazenamento e colocá-la numa pequena placa de Petri cheia de água pura à temperatura ambiente durante 5 minutos para lavar a amostra. Em seguida, recolher a fibra e transferi-la para o centro da cavidade parafilme no substrato de silicone. Atenção: Evite danificar a fibra esticando-lo durante esta operação, e evitar a reorientação da amostra sobre o substrato, pois isso pode causar uma mudança nas propriedades mecânicas. Coloque uma lamela de vidro fino sobre a fibra e selar a câmara pela passagem de um ferro de solda aquecido suavemente sobre a superfície do vidro para derreter o parafilme abaixoo copo. Atenção: Evite danificar a fibra por não trazer a ponta de solda muito perto ou aquecimento do substrato excessivamente. Coloque a câmara selada sobre uma superfície plana sob um peso pequeno e deixá-lo durante cerca de 12 horas para atingir um bom contacto entre a amostra e substrato de silício, evitando danos à amostra. Remover o peso e fixar a câmara no lugar sobre o substrato, por meio de parafusos. 2. Configurando o Experimento de Brillouin e aquisição de fibra Spectra Preparação de amostra do compartimento Monte da amostra preparada como na parte 1.3 em um suporte vertical, equipado com um goniómetro para permitir a rotação no plano da amostra, mantendo um ângulo de espalhamento constantes (2 Φ = 90 °, ver a figura SI-1) e dispersando a posição de volume. Execute um ajuste de foco preciso da luz do laser sobre a amostra através do lens. 9 Cuidado: A potência de saída do laser pode ser demasiado elevada e produzir uma queimadura na amostra. Certifique-se de que ele está definido suficientemente elevado para dar uma boa sensibilidade, mas não muito alto para evitar danos à amostra. Aqui usamos uma potência de cerca de 76 mW na amostra. Este foi suficiente para obter uma boa sensibilidade sem queima da amostra, considerando também que este é fina e em contacto com um substrato que ajuda a dissipar o calor gerado pela iluminação do laser. Posicionar a amostra num ângulo de 45 ° (Φ) para o feixe de laser incidente, utilizando uma escala de Vernier. Atingir o posicionamento óptimo, executando uma medida e maximizar a intensidade dos picos no espectro (ver abaixo). Configurando o espectrômetro Abra o software de aquisição e manipulação dos dados e configurar a aquisição de um espectro de Brillouin da amostra 12. O procedimento aqui descrito é aplicável à MUltipass interferómetro em tandem (Figura SI-1A). Alinhar as duas Fabry-Perot (FP) interferómetros de mudança de forma independente as tensões aplicadas ao piezo pela unidade de controlo. Para este procedimento de pré-alinhamento, observar a luz refletida por cada FP. Quando a intensidade reflectida pelos dois PQ tende para zero, o alinhamento correcto é atingido. Calibra-se o espectro de: a gama de frequências acessível, ou livre gama espectral (FSR), está dependente da distância entre os dois espelhos da primeira cavidade de PF, G, através FSR = c / 2 L, onde C é a velocidade da luz e L é medido por um medidor-marcação. Sincronizar os scans dos dois interferômetros FP e mudar o sistema óptico para a configuração tandem multipass. Um controlo de realimentação de intensidade de luz laser transmitida irá manter automaticamente o alinhamento dos dois PQ durante a medição. medição of Brillouin Spectra Cuidado: O espectro de Brillouin é altamente dependente da temperatura e hidratação da amostra e de controlo de forma cuidadosa destes parâmetros é a chave para a obtenção de espectros reprodutível. Iniciar a aquisição de um espectro de Brillouin da amostra e executá-lo até uma boa relação sinal-ruído é alcançado. Isso pode levar vários minutos, dependendo do espalhamento de seção transversal, a concentração ea espessura da amostra. NOTA: Não há uma regra de ouro para a relação sinal-ruído, mas a qualidade espectral é verificada pelo experimentalista com base na amostra específica analisada. Há um trade-off entre a qualidade ea duração da medição espectral, portanto, os parâmetros experimentais precisam ser selecionados de acordo com a aplicação específica. Para a medição de uma amostra seca, tomar espectros sucessiva – para cada um deles, seguindo o passo 2.3.1 – até que não haja mudanças na posição dos picos is observados. Isto é conseguido quando a amostra está em equilíbrio com a atmosfera ambiente e sem secagem adicional irá afectar o espectro. Seleccionar a polarização de luz (VV ou VH; V meios vertical e H para a direcção horizontal da polarização da luz em relação ao plano de espalhamento) e adquirir espectros em cada ângulo em relação ao eixo da fibra (θ; Figura SI-1), rodando a amostra em de avião com a mão. Salve o espectro de Brillouin para o arquivo para posterior processamento. 3. Análise de Brillouin Spectra NOTA: análise de ajuste de Brillouin picos pode ser realizada utilizando várias funções. Uma função de oscilador harmônico (DHO) 4,13 amortecida foi selecionado como este é um modelo válido para picos provenientes de modos acústicos amortecidos em meio visco-elástico. Análise de ajuste de picos de Brillouin Selecione a faixa espectral para o pico de interesse em the espectro de Brillouin. Activar uma linha de base no ajuste se o fundo espectral é muito maior do que zero. NOTA: A linha de base pode variar entre espectros. Certifique-se de que a correção é aplicada de forma sistemática e reproduzível. Aplicar um detalhado mínimos quadrados ajustadas usando uma função DHO 4,13 para o pico Brillouin de interesse de forma iterativa até atingir a convergência ea melhor ajuste de curva é obtida. Em seguida, salve os resultados de ajuste para o arquivo. Obter valores médios dos parâmetros de ajuste dos dois picos de cada dupleto Brillouin. Calcula-se a velocidade da onda acústica da frequência de pico (usando a expressão abaixo). Plotar os resultados de ajuste através de gráficos, por exemplo, a velocidade da onda acústica vs. ângulo para eixo da fibra, θ E aplicar modelos relevantes (por exemplo, para sistemas acusticamente anisotrópicos 9) para extrair quantidades mecânicas, tais como coeficientes de elasticidade tensor.

Representative Results

O aparelho de espectroscopia de Brillouin utilizado nesta experiência (Figura 1A-SI) foi anteriormente descrito. 9 Ela emprega um único modo de 532 nm do laser de estado sólido com potência de saída de 76 mW a amostra. Uma lente acromática 20 centímetros foca a luz de laser sobre a amostra e recolhe a luz dispersa a partir da amostra de uma geometria de retroespalhamento. Um conjunto de passagem múltipla de Fabry-Perot é usado para filtrar a luz dispersa, que é então detectado por um detector de fotodiodo de baixo ruído. Esta abordagem dá um contraste extremamente elevado (cerca de 120 dB) e estabilidade através de auto-alinhamento piezo-digitalização dos etalons. Um polarizador e o analisador são introduzidos para seleccionar a polarização da luz incidente e espalhada. Os espectros são obtidos geralmente com o polarizador mantido fixo seleccionando o sentido vertical (V) da polarização da luz incidente e o analisador seleccionar alternativamente à vertical (V) OR (H) horizontal da direcção da polarização da luz difundida. Nesta configuração, os modos acústicos longitudinais e transversais são detectados, respectivamente. Um espectro de Brillouin típico tem um pico central intensa devido à dispersão elástica e um ou mais conjuntos de picos igualmente deslocado, ou dupletos de Brillouin, que são o assinatura da mecânica da amostra. Nestas medições, a luz dispersa pode ter origem, tanto a partir de fonões granel que viajam quasi-ortogonal para a amostra e, depois da reflexão da luz incidente na interface substrato-amostra, de fonões granel viajar paralela à superfície (modos PS). 9 A Figura 2 mostra os espectros de SBV de fibras de colagénio digerido com tripsina e secos hidratados obtidos com polarização VV em 0.2 resolução GHz, com uma gama espectral livre de 30 GHz e cerca de 10 min de tempo de recolhapor espectro. Cada espectro corresponde a um ângulo específico de rotação, θ (Figura SI-1C). Em fibra de colagénio seco a θ = 0 °, modos longitudinais dar origem a um pico de massa a (18,92 ± 0,02) GHz, enquanto o modo de PS é de (9,85 ± 0,03) GHz (Figura 2A). As mudanças PS pico para frequências mais baixas como θ vai de 0 ° (phonon sondando a orientação axial da fibra) e 90 ° (phonon sondando a orientação radial), enquanto que o pico de massa apenas ligeiramente vermelha-Deslocamentos ao mudar θ no mesmo intervalo (phonon sondando uma direção quasi-radial ao longo da rotação). Em fibras de colágeno molhado, os dois picos devido a fônons longitudinais são essencialmente inalterada durante todo o experimento, com o pico de massa a cerca de 10,5 GHz eo pico PS em 4.9 GHz (Figura 2B). Isto indica uma redução de 80 a 100% na frequência de pico (em relação aos dados de 18,92e 9.85 GHz), respectivamente, e, portanto, da rigidez do material, devido à hidratação. Note-se que os modos granel e PS de colágeno hidratado se encontram perto da frequência aos modos de água pura, sugerindo que suas constantes elásticas são uma combinação das contribuições de água e fibra, com um papel dominante desempenhado pela água. A Figura 3 mostra um espectro de fibra de colagénio digerido por tripsina seco medido no θ = 30 ° com VH de polarização; um vazamento de polarização VV permite que o PS e os picos de massa para ainda ser observados. Modos transversais representam um pico a (4,1 ± 0,2) GHz (θ = 0 °) que leve azul-turnos como mudanças q de 0 ° a 90 °. resultados de ajuste tanto para a transversal e picos PS são também mostrados. Parâmetros de pico foram extraídos e velocidades de ondas acústicas foram derivados como V L = λ v / √2, onde <em> v é a frequência de modo a obtida por análise de ajuste de curva dos picos e λ é o comprimento de onda de excitação, 532 nm. Note que nesta geometria, o conhecimento do índice de refracção do material não é necessária para obter a velocidade de modo acústico (devido à geometria do espalhamento, q s = 2 k i sin (Φ); Figura SI-1b, c), daí tornando esta abordagem especialmente vantajosa. A Figura 4 é um gráfico das velocidades de ondas acústicas obtidos a partir de modos longitudinais e transversais (picos PS e T) como uma função do ângulo θ . Análise de ajuste para um modelo de hexagonal simétrica elástica sólida 7 – Equações A1 e A2 abaixo – oferece os cinco componentes do tensor elasticidade do tipo digerido por tripsina seco I fibras de colágeno (Tabela 1). <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page = "1"> As velocidades de ondas acústicas longitudinais e transversais são dadas por 9 , (A1) , (A2) onde ρ é a densidade do material, e C 11, C 33, C 44 e C 13 são quatro dos cinco constantes elásticas que caracterizam os sistemas com uma simetria hexagonal. O quinto constante, C 12, pode ser derivada a partir da relação aproximada C ~ 12 C 11 -. 2 C 44 7 Os coeficientes são semelhantes aos anteriormente obtido a partir de colagénio não purificada fibers. 9 A diferença notável ocorre para o coeficiente c 13 que se reflete em valores similares do módulo elástico E ǁ e E (Aproximadamente 7,2 e 7,7 GPa) para o colagénio purificado. A Figura 5 é um gráfico da velocidade de onda acústica longitudinal do colagénio molhado contra θ . Neste caso, nenhuma mudança periódica da frequência é observada, dando uma velocidade constante dentro do erro. A Figura 6 mostra os espectros de fibras de elastina e secos hidratados medidos em q = 0 °. modos transversais não foram detectados por estas amostras. Em elastina seca, o pico de massa ocorre a 16,8 GHz, enquanto o modo PS em 8,2 GHz 9 (13 e 20% menor do que os picos correspondentes de colágeno seca). fibras de elastina molhadas apresentar um volume pEAK em (12,30 ± 0,01) GHz (37% mais baixa em frequência do que o pico de grandes quantidades de elastina seco). O modo de PS de elastina molhada não é evidente no espectro devido à intensa cauda do pico elástica nessas frequências. Por outro lado, o pico a cerca de 7,5 GHz é atribuída à água a granel. A Figura 7 mostra a dependência da velocidade de onda acústica em fibras de elastina seca sobre θ. A partir destes dados, as componentes do tensor (elasticidade e módulos mecânica) foram obtidos (Tabela 1). 9 Tal como no colagénio molhados, há evidências de isotropia do módulo de mecânica de fibras de elastina hidratadas. Estes resultados indicam como espectroscopia de Brillouin pode dar informação relevante sobre a rigidez, a composição e os aspectos estruturais do material. Figura 1. acústica e fonões ópticos em cadeia unidimensional de átomos. Diagrama esquemático de vibrações acústicas e ópticos numa cadeia diatómico unidimensional. Átomos têm massa m 1 e m 2 e são alternadas. As setas indicam os deslocamentos dos átomos. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 2. Espectros de Brillouin do tipo-tripsina purificada eu fibras de colagénio de tendão de cauda de rato. Os espectros de (A) fibra seca e (B) a partir de medições de fibra hidratado VV em ângulo diferente em relação ao eixo θ fibra, em graus. Um espectro de água destilada pura também é mostrada. Os espectros foram normalizados para a intensidade (altura) do pico de massa. Etiquetas B e PS denota picos relacionados com grandes quantidades e modos paralelos-a-superfície, respectivamente. As barras de erro indicam o erro padrão (raiz quadrada do número de contagens). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 3. espectro de Brillouin do tipo purificado-tripsina seco I fibras de colágeno de tendão de cauda de rato. Espectro de uma medição de VH em θ = 30 °. Etiquetas T, PS e B denotam picos relacionados com transversais, modos paralelas-a-superfície e em massa, respectivamente. Os resultados de análise de ajuste utilizando um modelo amortecida oscilador harmónico (DHO) para ambos os modos de T e de PS também são mostrados. As barras de erro indicam o erro padrão (raiz quadrada do número de contagens)./54648fig3large.jpg "Target =" _ blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 4. Lote da velocidade de onda acústica em colagénio purificado por tripsina seco vs ângulo em relação ao eixo da fibra. Velocidades de onda acústica longitudinais e transversais de fibra de colagénio seco derivados de análise de ajuste dos picos de Brillouin. Os dados são ajustados a um modelo de um sólido elástico hexagonal simétrico. A linha vermelha: Equação A1 (R 2 = 0,99); linha azul: Equação A2 (R 2 = 0,36). As barras de erro indicam os erros-padrão obtidos a partir da raiz quadrada dos elementos da diagonal da matriz de covariância depois de um não-lineares Levenberg-Marquardt mínimos quadrados ajuste dos espectros de Brillouin. Por favor clique aqui para ver uma versi maiores em dessa figura. Figura 5. Lote de velocidade da onda acústica longitudinal no colágeno purificado-tripsina molhada vs ângulo para eixo da fibra. Velocidade da onda acústica longitudinal da fibra de colágeno hidratado derivada de análise de ajuste dos picos de Brillouin. A linha mostrada é um guia para o olho e o valor médio da velocidade de onda acústica nesta gama. As barras de erro indicam os erros-padrão obtidos a partir da raiz quadrada dos elementos da diagonal da matriz de covariância depois de um não-lineares Levenberg-Marquardt mínimos quadrados ajuste dos espectros de Brillouin. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura. jpg "/> Figura 6. Espectros de Brillouin das fibras de elastina de ligamento de bovino da nuca. Espectros de fibra seca e hidratada em θ = 0 °. Os espectros foram normalizados para a intensidade (altura) do pico de massa. Etiquetas B e PS denota picos relacionados com grandes quantidades e modos paralelos-a-superfície, respectivamente. B F B e W referem-se aos picos de massa da fibra e água, respectivamente. As barras de erro indicam o erro padrão (raiz quadrada do número de contagens). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 7. Parcela da velocidade da onda acústica longitudinal na elastina seco vs ângulo para eixo da fibra. Velocidade da onda acústica Longitudinal de lorota elastina secoer derivada de análise de ajuste dos picos de Brillouin. Os dados são ajustados a um modelo de um sólido elástico hexagonal simétrico. Linha vermelha: Equação A1 9 (R 2 = 0,74). As barras de erro indicam os erros-padrão obtidos a partir da raiz quadrada dos elementos da diagonal da matriz de covariância depois de um não-lineares Levenberg-Marquardt mínimos quadrados ajuste dos espectros de Brillouin. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura SI-1. Esquemático do Brillouin definir-se e BLS geometria espalhamento. (A) A luz incidente emitida por um laser de estado sólido é enviado para a amostra através de uma lente acromática. A luz dispersa por fônons acústicos granel e por aqueles resultantes de reflec ç ã o da luz na superfície do substrato, que está em contacto com a amostra, é recolhido pela lente, filtrada por um interferómetro de Fabry-Perot em tandem-multipasse e detectada por um fotomultiplicador. FP1 e FP2 indicar os dois interferômetros que constituem o conjunto set-up. Um polarizador selecciona a polarização da luz incidente, e um analisador é utilizado para seleccionar a polarização da luz dispersa. (B) geometria BLS com uma amostra em contacto com a superfície de um substrato de silício reflexivo. Uma lâmina de vidro (não mostrado) está colocado por cima do espécime para selar o compartimento, e uma leve pressão é aplicada através das almofadas nos cantos do substrato. A luz incidente (K i) passa através da lente, é refractada na interface ar-amostra (K 'i) e focada na interface substrato-amostra. A luz dispersa recolhida pela mesma lente (k 's) resulta da interação com ambos os fônons granel (qb) aqueles que viajam e PS da amostra (q s). . Ângulos entre as direcções de luz e a normal à superfície são indicados como Φ e Φ '(C) Diagrama esquemático da amostra e do sistema de coordenadas adotadas; Z define o eixo extraordinária paralela à direcção das fibras. Ângulos θ e α são aquelas entre a direcção de fonões q e q s b o a z -axis, respectivamente k i, k 'i, k s, K' s:. Números de onda da luz incidente e espalhados; b Q, Q s, vetores de onda da massa e modos PS, respectivamente. (Reproduzido de ref 9.) Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura. <pclass = "jove_content" fo: manter-com-next.within-page = "always"> Tabela 1. Coeficientes de tensores elásticos derivados da análise de ajuste das velocidades de ondas acústicas coeficientes tensores elásticos do tipo purificado-tripsina seco I fibras de colágeno (. este trabalho) e fibras de elastina (ref 9). amostra coeficientes elásticos (ACP) colagénio digerido por tripsina C 33 18,7 ± 0,1 C 11 14,4 ± 0,2 c 44 3,4 ± 0,1 C 12 7,2 ± 0,2 c 13 11,2 ± 0,3 elastina C 33 11,5 ± 0,2 C 11 10,4 ± 0,1 c 44 1,9 ± 0,2 C 12 6,6 ± 0,2 c 13 6,8 ± 0,3

Discussion

espectroscopia de difusão de Brillouin é uma ferramenta única, através da qual os componentes individuais do tensor de elasticidade de uma fibra de proteína pode ser caracterizada em detalhe sem precedentes. Além disso, as medições podem ser feitas em uma escala microscópica e, assim, vai nos fornecer novas perspectivas sobre os mecanismos de micro-escala de estruturas biológicas, permitindo, pela primeira vez, para compreender a mecânica, e provavelmente funcional, a significância das complexidades na arquitectura de matriz e bioquímica que foi revelado nos últimos anos.

A técnica mede propriedades mecânicas em uma faixa de freqüência GHz. Este domínio nunca foi explorado antes de biopolímeros estruturais e ambos levanta e fornece os meios para responder a perguntas fundamentais sobre mecanismos moleculares de elasticidade.

Nós descrevemos as etapas para extrair as fibras de colágeno e elastina em tecidos animais e para medir Brillouin scatteriOs espectros ng utilizando um substrato reflectora para conseguir a descrição completa da biomecânica da fibra. As etapas críticas no âmbito do protocolo são aqueles que asseguram que as fibras purificadas são obtidos e as condições experimentais apropriados estão no local para medições reprodutíveis das proteínas fibrosas. No entanto, deve ter-se em conta que os processos de extracção pode modificar as propriedades mecânicas das fibras.

Modificações da técnica envolve o acoplamento com microscopia óptica de espalhamento de Brillouin microfototerapia e mapeamento se aproxima de 13 e a possível combinação com técnicas complementares (por exemplo, espalhamento Raman). As aplicações atuais da técnica estão principalmente concentradas em materiais biológicos excisadas, mas os desenvolvimentos importantes, como por exemplo, aquelas baseadas em múltiplas etalons Vipa 14, estão tornando possível a tradução desta técnica a partir da bancada à cabeceira com uma gama de aplicações já demonstrated 15,16 incluindo potencial em aplicações in vivo. A abordagem VIPA é uma alternativa ao que descrevemos; que tem o tempo de aquisição mais rápida, mas não é necessariamente adequado, no caso de amostras opacos, tais como aqueles aqui analisados. Além disso, a utilização de um substrato reflectora não é prático em set-ups que utilizam os etalons Vipa porque o seu contraste não seria suficiente para rejeitar a luz quasi-elástica. Limitações relacionadas com a velocidade de aquisição de um conjunto de dados espectrais e da secção transversal da dispers� inerentemente fraco do material pode limitar aplicações para sistemas biológicos dinâmicos e para a aquisição de dados de dentro de tecidos, mas aperfeiçoamentos técnicos podem melhorar o desempenho atual.

BLS promete ser uma ferramenta importante na investigação biofísica fundamental sobre a matriz extracelular e, assim, produzir novos insights sobre a evolução das propriedades mecânicas durante o crescimento da matriz e sua perda no patológicadegeneração. No entanto, é importante lembrar que as medições são não-invasiva e, portanto, pode ser realizada in vivo. Com efeito, este já tiver sido atingido na córnea 16 e esse trabalho pode fornecer uma plataforma para o desenvolvimento de novos instrumentos de diagnóstico para uma larga gama de doenças do tecido conjuntivo.

O ultra-som a elastografia e microscopia de força atómica (AFM) são métodos alternativos de medição micromecânica, mas a técnica BLS oferece melhor resolução espacial (numa escala subcelular) do que o anterior e, ao contrário da AFM, não impõe forças mecânicas sobre o espécime e não se restringe a a análise única de características da superfície. módulos de Brillouin de colagénio e elastina são na gama GPa, enquanto módulos de Young a partir de estirpes macroscópicas são da ordem de Mpa (mais detalhes serão relatadas em outra). Este resultado indica um módulo de elasticidade diferencial com uma forte dependência da frequência de excitação, em virtudeo comportamento visco-elástico das fibras. BLS pode ser aplicado a uma ampla gama de problemas e materiais em ciências biomédicas. Pode ajudar a responder a perguntas sobre a fisiologia e patologia dos tecidos biológicos, assim como proporcionar um instrumento físico para a compreensão fundamental dos materiais e das interacções ao nível molecular.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported by the Engineering and Physical Sciences Research Council [grant number EP/M028739/1]. RSE was supported by a Santander Postgraduate Research Award 2015.

Materials

Chondroitinase ABC Sigma-Aldrich C2905
Tris Buffer Fluka 93358
Sodium Acetate Fisher Scientific S608-500
PBS Sigma-Aldrich P4417
Sodium Azide Fisher Scientific S2002
Streptomyces Hyaluronidase  Sigma-Aldrich H1136-1AMP
Sodium Chloride Fisher Scientific S7653
Trypsin Sigma-Aldrich T4665
Sodium Phosphate Sigma-Aldrich S9638
Sodium Hydroxide Fisher Scientific S320-500
Pure Water Millipore ZRQS0P3WW Produced In-House 
Distilled Water Bibby Scientific Limited D4000 Produced In-House from water still
Euthatal Merial  J01601A 
Tandem Interferometer TFP-1 JRS Scientific Instruments
Freezer Lec TU55144
Refrigerator Zanussi ZBA15021SA
Hot Plate Fisher Scientific SP88857206
Clamps VWR 241-7311 & 241-7201
Clamp Stand VWR  241-0093
Thermometer Fisher Scientific 13-201-401
Cling Film Sainsbury's 7650540
Parafilm Sigma-Aldrich P7793-1EA
Silicone IDB Technologies N/A No catalogue number. Order upon request
Cover Glass VWR 631-1571
Conical Flask VWR 214-1175
Beaker VWR 213-0469
Measuring Cylinder VWR 612-3838
Vial VWR 548-0051 & 548-0863
Petri Dish VWR 391-0441
Scalpel Swann Morton Ltd  0914 & 0308
Diamond Scribe RS Instruments 394-217
Soldering Iron RS Instruments 231-5332
Fine Forceps VWR 232-0188
Double Micro-Spatula VWR Various Sizes
pH Meter Hanna Instruments HI-2210-02
Orbital Shaker IKA  0002819000
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References

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Extracellular MatrixCollagenElastinBrillouin SpectroscopyTendonChondroitinase ABCStreptomyces HyaluronidaseTrypsinBovine Nuchal LigamentSodium HydroxideWater Bath

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Edginton, R. S., Mattana, S., Caponi, S., Fioretto, D., Green, E., Winlove, C. P., Palombo, F. Preparation of Extracellular Matrix Protein Fibers for Brillouin Spectroscopy. J. Vis. Exp. (115), e54648, doi:10.3791/54648 (2016).
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