إعداد ألياف البروتين خارج الخلية مصفوفة لBrillouin الطيفي
Summary
We present a protocol for the application of Brillouin light scattering spectroscopy to elastin and trypsin-purified type I collagen fibers of the extracellular matrix to extract their full elastic properties.
Abstract
Brillouin spectroscopy is an emerging technique in the biomedical field. It probes the mechanical properties of a sample through the interaction of visible light with thermally induced acoustic waves or phonons propagating at a speed of a few km/sec. Information on the elasticity and structure of the material is obtained in a nondestructive contactless manner, hence opening the way to in vivo applications and potential diagnosis of pathology. This work describes the application of Brillouin spectroscopy to the study of biomechanics in elastin and trypsin-digested type I collagen fibers of the extracellular matrix. Fibrous proteins of the extracellular matrix are the building blocks of biological tissues and investigating their mechanical and physical behavior is key to establishing structure-function relationships in normal tissues and the changes which occur in disease. The procedures of sample preparation followed by measurement of Brillouin spectra using a reflective substrate are presented together with details of the optical system and methods of spectral data analysis.
Introduction
تم اكتشاف تأثير الضوء Brillouin نثر (BLS) من قبل ليون برويون في عام 1922. 1 وهو يتألف من نثر غير مرن من الضوء المرئي من قبل الفونونات الصوتية تنشيط حراريا في المواد. في فيزياء الحالة الصلبة، الفونونات الصوتية والاهتزازات متماسكة من كل الذرات في شعرية. سلسلة ذات بعد واحد من نوعين بالتناوب من الذرات في شعرية هي نموذج بسيط يوضح الفرق بين الفونونات الصوتية، التي كشفت عنها BLS، والفونونات البصرية، سبرت عن طريق امتصاص الأشعة تحت الحمراء ورامان نثر (الشكل 1). الفونونات الصوتية والحركات في مرحلة من الذرات في سلسلة مع تشريد على طول اتجاه الانتشار (الفونونات الصوتية طولية) أو عمودي على اتجاه انتشار (عرضية الفونونات الصوتية)، في حين الفونونات البصرية هي حركات الخروج من مرحلة من ذرات إنتاج تتأرجح لحظة ثنائي القطب الكهربائية (طولية أو عرضية وسائط).
BLS الطيفوقد استخدم SCOPY في العلم التحليلي منذ 1920s. ومع ذلك، فقط منذ 1980s لها قياسات عالية التباين كانت ممكنة من خلال استخدام جنبا إلى جنب المتعددة الدخول مطياف فابري بيرو. ومنذ ذلك الحين، فإن عددا متزايدا من التقدم في BLS لتطبيقات تحليلية في المادة المكثفة (حيث يتم استغلال تفاعل الفوتون الطاقة الصوتية) 2-4 والمواد المغناطيسية (من خلال تفاعل الفوتون، المجنون) قد عرضت 5 عنه. وقد مهدت أعمال المنوية على التطبيقات الطبية الحيوية 6-8 الطريق إلى وضع نهج مختلف، بما في ذلك واحدة تطبق هنا واحد هو موضح سابقا 9 باستخدام الركيزة عاكسة في تكوين مثل الصفائح الدموية لتحقيق صفا كاملا للموتر مرونة عينة.
في العمل الحالي، ونحن نطبق BLS التحليل الطيفي إلى مقومات أساسية لالمصفوفة خارج الخلية في الأنسجة الضامة، والبروتينات الليفية الإيلاستين والكولاجين النوع الأول. تYPE أنا الكولاجين هو جامد، جزيء حلزوني الثلاثي الذي يجمع أفقيا وطوليا مع الصليب ربط واسعة لتشكيل الألياف جامدة أساسا في الأنسجة مثل الأوتار. شبكات الكولاجين غالبا ما تتعايش مع شبكات الإيلاستين، وهو بروتين، على غير العادة، ويولد بعيدة المدى مرونة من خلال مزيج من الكون والتفاعلات الطاردة للماء مع بيئتها وضروري لوظائف الأنسجة مثل الرئة والجلد. وعلى غرار كل من الألياف باستخدام نموذج الكريستال سداسية في البحث الحالي. 9 في الجزء 1، وصفنا بروتوكول لاستخراج الألياف من الأنسجة الحيوانية وإعداد نموذج للقياسات الطيفية. في الجزء 2، يتم تقديم إجراءات إنشاء جهاز Brillouin والحصول على أطياف من الألياف. الجزء 3 يعطي تفاصيل تحليل البيانات تطبيقها على أطياف Brillouin لاستخراج المعلومات الميكانيكية ذات الصلة الواردة فيه. ثم، يتم عرض نتائج ممثل وdiscusseد.
Protocol
Representative Results
Discussion
Brillouin تشتت الطيفي هو أداة فريدة من نوعها التي المكونات الفردية للموتر مرونة من ألياف البروتين يمكن وصفها بالتفصيل لم يسبق له مثيل. وعلاوة على ذلك، يمكن إجراء القياسات على نطاق والمجهرية، وبالتالي سوف توفر لنا رؤى جديدة في آليات الصغيرة الحجم من الهياكل البيولوجية، مما يسمح لنا، للمرة الأولى، لفهم الميكانيكية، وربما وظيفية، وأهمية التعقيدات في الهندسة المعمارية مصفوفة والكيمياء الحيوية والتي تم الكشف عنها في السنوات الأخيرة.
يقيس تقنية الخواص الميكانيكية في نطاق تردد غيغاهرتز. لم يتم البحث في هذا المجال قبل لالبوليمرات الحيوية الهيكلية وعلى حد سواء يثير ويوفر وسيلة للإجابة على الأسئلة الأساسية حول الآليات الجزيئية للمرونة.
وصفنا الخطوات لاستخراج الكولاجين والإيلاستين الألياف من الأنسجة الحيوانية ولقياس Brillouin scatteriنانوغرام الأطياف باستخدام الركيزة عاكسة لتحقيق صفا كاملا من الميكانيكا الحيوية الألياف. الخطوات الحاسمة في البروتوكول هي تلك التي تضمن أن يتم الحصول على ألياف النقاء والظروف التجريبية المناسبة في مكانها الصحيح لقياسات متكررة من البروتينات الليفية. ومع ذلك، فإنه يجب أن يوضع في الاعتبار أن إجراءات استخراج قد يغير من الخواص الميكانيكية للألياف.
إدخال تعديلات على هذه التقنية تنطوي على اقتران مع المجهر الضوئي لنثر Brillouin microfocused ورسم النهج (13) وتركيبة ممكنة مع التقنيات التكميلية (على سبيل المثال، رامان نثر). وتركز التطبيقات الحالية لهذه التقنية بشكل أساسي على المواد البيولوجية رفعه، ولكن التطورات الهامة، على سبيل المثال، تلك التي تقوم على عدة etalons VIPA 14، تبذل الممكن ترجمة هذه التقنية من الفوق إلى السرير مع مجموعة واسعة من التطبيقات بالفعل شيطانstrated 15،16 بما في ذلك إمكانية في تطبيقات الجسم الحي. النهج VIPA هو بديل لما وصفنا. انها أسرع وقت الشراء ولكن ليس بالضرورة مناسبا في حالة العينات مبهمة مثل تلك تحليلها هنا. وعلاوة على ذلك، فإن استخدام الركيزة عاكسة ليست عملية في مجموعة عمليات التي تستخدم etalons VIPA بسبب التباين من شأنه أن لا يكون كافيا لرفض ضوء شبه مرنة. القيود ذات الصلة لسرعة الحصول على مجموعة البيانات الطيفية وضعيفة بطبيعتها قسم نثر صليب المواد قد يحد من التطبيقات لالنظم البيولوجية الحيوية واكتساب البيانات من أعماق الأنسجة، ولكن التحسينات التقنية قد تحسن في الأداء الحالي.
BLS يعد بأن يكون أداة رئيسية في البحوث الفيزيائية الحيوية الأساسية في المصفوفة خارج الخلية، وبالتالي إلى إنتاج رؤى جديدة لتطور الخصائص الميكانيكية خلال النمو مصفوفة وخسارتهم في المرضيةانحطاط. ومع ذلك، من المهم أن نتذكر أن القياسات موسع، وبالتالي يمكن الاضطلاع بها في الجسم الحي. في الواقع، وقد تحقق هذا بالفعل في القرنية 16 وهذا العمل يمكن أن يوفر منصة لتطوير أدوات التشخيص الجديدة لمجموعة واسعة من الاضطرابات التي تصيب النسيج الضام.
الموجات فوق الصوتية elastography والقوة الذرية المجهر (AFM) طرق بديلة لقياس الميكرو ميكانيكية، ولكن تقدم تقنية BLS القرار المكانية أفضل (على نطاق والتحت خلوية) من السابق، وعلى عكس AFM، لا يفرض القوى الميكانيكية على عينة ولا يقتصر على تحليل فقط من السمات السطحية. الرجوعية Brillouin من الكولاجين والإيلاستين هي في حدود برنامج العمل العالمي، في حين الرجوعية الشباب من سلالات العيانية هي من ترتيب ميجا باسكال (سيتم الإبلاغ عن مزيد من التفاصيل في مكان آخر). وتشير هذه النتيجة إلى معامل المرونة التفاضلية مع الاعتماد القوي على وتيرة الإثارة، نظرا لالسلوك اللزجة من الألياف. BLS يمكن تطبيقها على مجموعة واسعة من المشاكل ومواد في العلوم الطبية الحيوية. ويمكن أن تساعد في الإجابة على الأسئلة في علم وظائف الأعضاء وعلم الأمراض والأنسجة البيولوجية، فضلا عن توفير أداة المادية لفهم أساسي من المواد والتفاعلات على المستوى الجزيئي.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Engineering and Physical Sciences Research Council [grant number EP/M028739/1]. RSE was supported by a Santander Postgraduate Research Award 2015.
Materials
| Chondroitinase ABC | Sigma-Aldrich | C2905 | |
| Tris Buffer | Fluka | 93358 | |
| Sodium Acetate | Fisher Scientific | S608-500 | |
| PBS | Sigma-Aldrich | P4417 | |
| Sodium Azide | Fisher Scientific | S2002 | |
| Streptomyces Hyaluronidase | Sigma-Aldrich | H1136-1AMP | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S7653 | |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T4665 | |
| Sodium Phosphate | Sigma-Aldrich | S9638 | |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | S320-500 | |
| Pure Water | Millipore | ZRQS0P3WW | Produced In-House |
| Distilled Water | Bibby Scientific Limited | D4000 | Produced In-House from water still |
| Euthatal | Merial | J01601A | |
| Tandem Interferometer TFP-1 | JRS Scientific Instruments | ||
| Freezer | Lec | TU55144 | |
| Refrigerator | Zanussi | ZBA15021SA | |
| Hot Plate | Fisher Scientific | SP88857206 | |
| Clamps | VWR | 241-7311 & 241-7201 | |
| Clamp Stand | VWR | 241-0093 | |
| Thermometer | Fisher Scientific | 13-201-401 | |
| Cling Film | Sainsbury's | 7650540 | |
| Parafilm | Sigma-Aldrich | P7793-1EA | |
| Silicone | IDB Technologies | N/A | No catalogue number. Order upon request |
| Cover Glass | VWR | 631-1571 | |
| Conical Flask | VWR | 214-1175 | |
| Beaker | VWR | 213-0469 | |
| Measuring Cylinder | VWR | 612-3838 | |
| Vial | VWR | 548-0051 & 548-0863 | |
| Petri Dish | VWR | 391-0441 | |
| Scalpel | Swann Morton Ltd | 0914 & 0308 | |
| Diamond Scribe | RS Instruments | 394-217 | |
| Soldering Iron | RS Instruments | 231-5332 | |
| Fine Forceps | VWR | 232-0188 | |
| Double Micro-Spatula | VWR | Various Sizes | |
| pH Meter | Hanna Instruments | HI-2210-02 | |
| Orbital Shaker | IKA | 0002819000 |
References
- Brillouin, L. Diffusion de la lumière et des rayonnes X par un corps transparent homogène; influence de l’agitation thermique. Ann. Phys. 17, 88-122 (1922).
- Caponi, S., Corezzi, S., Mattarelli, M., Fioretto, D. Stress effects on the elastic properties of amorphous polymeric materials. J. Chem. Phys. 141 (21), 214901 (2014).
- Mattarelli, M., Montagna, M., Still, T., Schneider, D., Fytas, G. Vibration spectroscopy of weakly interacting mesoscopic colloids. Soft Matter. 8 (15), 4235-4243 (2012).
- Comez, L., Masciovecchio, C., Monaco, G., Fioretto, D., Robert, E. C., Robert, L. S. . Solid State Physics. 63, 1-77 (2012).
- Madami, M., et al. Direct observation of a propagating spin wave induced by spin-transfer torque. Nat. Nanotechnol. 6 (10), 635-638 (2011).
- Harley, R., James, D., Miller, A., White, J. W. Phonons and the elastic moduli of collagen and muscle. Nature. 267 (5608), 285-287 (1977).
- Cusack, S., Miller, A. Determination of the elastic constants of collagen by Brillouin light scattering. J. Mol. Biol. 135 (1), 39-51 (1979).
- Vaughan, J. M., Randall, J. T. Brillouin scattering, density and elastic properties of the lens and cornea of the eye. Nature. 284 (5755), 489-491 (1980).
- Palombo, F., et al. Biomechanics of fibrous proteins of the extracellular matrix studied by Brillouin scattering. J. R. Soc. Interface. 11 (101), (2014).
- Sivan, S. S., et al. Age-related accumulation of pentosidine in aggrecan and collagen from normal and degenerate human intervertebral discs. Biochem. J. 399 (1), 29-35 (2006).
- Soskel, N. T., Wolt, T. B., Sandberg, L. B., Leon, W. C. . Methods in Enzymology. 144, 196-214 (1987).
- Fioretto, D., Scarponi, F. Dynamics of a glassy polymer studied by Brillouin light scattering. Mater. Sci. Eng. A. 521-522, 243-246 (2009).
- Palombo, F., Madami, M., Stone, N., Fioretto, D. Mechanical mapping with chemical specificity by confocal Brillouin and Raman microscopy. Analyst. 139 (4), 729-733 (2014).
- Scarcelli, G., Yun, S. H. Multistage VIPA etalons for high-extinction parallel Brillouin spectroscopy. Opt. Express. 19 (11), 10913-10922 (2011).
- Scarcelli, G., Kim, P., Yun, S. H. In Vivo Measurement of Age-Related Stiffening in the Crystalline Lens by Brillouin Optical Microscopy. Biophys. J. 101 (6), 1539-1545 (2011).
- Scarcelli, G., Yun, S. H. In vivo Brillouin optical microscopy of the human eye. Opt. Express. 20 (8), 9197-9202 (2012).
