JoVE Journal > Bioengineering
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Nederlands

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Bioengineering

Bereiding van extracellulaire matrix eiwit vezels voor Brillouin Spectroscopie

Published: September 15, 2016
doi:
10.3791/54648
, , , , , ,
1School of Physics and Astronomy,University of Exeter, 2Department of Physics and Geology,University of Perugia, 3Istituto Officina dei Materiali del CNR,Unità di Perugia

Summary

We present a protocol for the application of Brillouin light scattering spectroscopy to elastin and trypsin-purified type I collagen fibers of the extracellular matrix to extract their full elastic properties.

Abstract

Brillouin spectroscopy is an emerging technique in the biomedical field. It probes the mechanical properties of a sample through the interaction of visible light with thermally induced acoustic waves or phonons propagating at a speed of a few km/sec. Information on the elasticity and structure of the material is obtained in a nondestructive contactless manner, hence opening the way to in vivo applications and potential diagnosis of pathology. This work describes the application of Brillouin spectroscopy to the study of biomechanics in elastin and trypsin-digested type I collagen fibers of the extracellular matrix. Fibrous proteins of the extracellular matrix are the building blocks of biological tissues and investigating their mechanical and physical behavior is key to establishing structure-function relationships in normal tissues and the changes which occur in disease. The procedures of sample preparation followed by measurement of Brillouin spectra using a reflective substrate are presented together with details of the optical system and methods of spectral data analysis.

Introduction

De Brillouin lichtverstrooiing (BLS) effect werd ontdekt door Léon Brillouin in 1922. 1 Het bestaat uit de inelastische verstrooiing van zichtbaar licht door thermisch geactiveerd akoestische fononen in een materiaal. In de vaste stof fysica, akoestische fononen zijn coherent trillingen van alle atomen in een rooster. Een eendimensionale keten van twee afwisselende soorten atomen in een rooster is een eenvoudig model illustreert het verschil tussen akoestische fononen, geopenbaard door BLS en optische fononen, gesondeerd met IR absorptie en Raman verstrooiing (Figuur 1). Akoestische fononen in fase bewegingen van atomen in de keten met een verplaatsing langs de voortplantingsrichting (longitudinale akoestische fononen) of loodrecht op de voortplantingsrichting (dwars acoustic fononen), terwijl optische fononen out-of-fase beweging van de atomen het produceren van een oscillerende elektrische dipool moment (lengte of de breedte modes).

BLS spectroscopie is gebruikt in de analytische wetenschap sinds de jaren 1920; echter pas sinds 1980 een hoog contrast metingen mogelijk is door het gebruik van de tandem multipass Fabry-Perot spectrometer. Sindsdien, een toenemend aantal ontwikkelingen in de BLS voor analytische toepassingen in de gecondenseerde materie (waar de foton-fonon interactie wordt benut), 2-4 en magnetische materialen (door middel van het foton-Magnon interactie) 5 is tot stand gebracht. Rudimentaire werken op biomedische toepassingen 6-8 hebben de weg naar de ontwikkeling van verschillende benaderingen geplaveid, waaronder de hier toegepaste ene en het eerder beschreven 9 met een reflecterend substraat in een bloedplaatjes-achtige configuratie te bereiken volledige beschrijving van de elasticiteit tensor een voorbeeld.

In het onderhavige werk, passen we BLS spectroscopie de fundamentele bestanddelen van de extracellulaire matrix van bindweefsels, de vezelachtige proteïnen elastine en type I-collageen. TYPE I collageen is een stijf, drievoudige helixvormige molecuul dat zijdelings en in langsrichting assembleert met uitgebreide verknoping in wezen stijve vezels in weefsels zoals pezen vormen. Netwerken van collageen vaak bestaan ​​naast netwerken van elastine, een eiwit dat ongewoon genereert lange afstand elasticiteit door een combinatie van entropie en hydrofobe interacties met de omgeving en is essentieel voor de functie van weefsels zoals de longen en de huid. Beide vezels worden gemodelleerd met behulp van een hexagonaal kristal model in het huidige onderzoek. 9 In deel 1, beschrijven we het protocol bij de vezels van dierlijke weefsels te halen en om het monster voor de spectroscopische metingen te bereiden. In deel 2 wordt de procedure voor het instellen van de Brillouin inrichting en het verwerven van de spectra vezels gepresenteerd. Deel 3 geeft de details van de data-analyse toegepast op de Brillouin spectra naar de relevante mechanische daarin opgenomen informatie te halen. Daarna worden representatieve resultaten gepresenteerd en discussed.

Protocol

Let op: Neem contact op biologische veiligheid protocollen en alle relevante veiligheidsinformatiebladen (VIB) voor gebruik. De laser die werkzaam zijn in deze experimenten is een klasse 3B laser; naleving van de lokale regels voor een veilig gebruik van het systeem nodig. Gebruik alle passende veiligheidsmaatregelen in acht bij het uitvoeren van een laser spectroscopie meting inclusief het gebruik van persoonlijke beschermingsmiddelen (veiligheidsbril). Staart pezen werden verkregen 7-8 weken oude Wistar ratten gedood voor andere doeleinden in overeenstemming met de EU-verordening 1099/2009 en het welzijn van dieren (slachten of doden) Regulations 1995. Bovine nekband werden verkregen van een lokale slachthuis. 1. Bereiding van Monster Fibers OPMERKING: Eiwit vezels van de extracellulaire matrix kan worden geëxtraheerd uit verschillende weefsels, met behulp van verschillende procedures. Protocollen werden verfijnd op basis van schaal toegepast procedures. <strong> Extraction van collageen vezels uit rattenstaart Offeren rat door intraperitoneale injectie van 100 mg / kg lichaamsgewicht natriumpentobarbiton. scheiden dan de staart direct bij het punt van contact met het lichaam, drukken met een enkele rand scheermesje. Wikkel de staart in plasticfolie en bewaar het bevroren bij -20 ° C totdat ze nodig waren. Verzamel de staart van de vriezer, snijd een 20 mm lange segment van het proximale uiteinde terwijl nog bevroren en vervolgens laten ontdooien in een petrischaal gevuld met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) (pH 7,4) bij kamertemperatuur. Zodra de staart wordt ontdooid, een insnijding langs de lengte van het segment met een scalpel om de huid te splitsen. schillen dan terug naar vier omhulde pees bundels over de staart wervel te onthullen. Met behulp van fijne tang en voorzichtig om geen pre-stam toe te passen, zachtjes trekken elke vezel uit de schede en plaats deze in een flacon met gedestilleerd water met 0,01% w / v natriumazide (NaN3) te prgebeurtenis de groei van bacteriën, en gekoeld bewaren. Een enkele staart levert zo'n dertig pees vezels. Om pure vezelige type I collageen te verkrijgen, breng dan een driedelige enzymatische afbraak proces 10 aan de pees vezels aan de proteoglycanen en alle andere collagene materiaal te verwijderen. Eerst, dompel de vezels van 0,125 U / ml chondroitinase ABC in 0,05 M Tris buffer en 0,06 M natriumacetaat (CH 3 COONa) bij pH 8,0 gedurende 24 uur bij 37 ° C in een schuddend incubator bij 200 rpm. Vervolgens dompel de vezels 1 U / ml Streptomyces-hyaluronidase in 0,05 M Tris buffer en 0,15 M natriumchloride (NaCl) bij pH 6,0 en terugkeren naar de schudincubator gedurende 24 uur bij 37 ° C. Tenslotte dompel de vezels in 1 mg / ml trypsine in 0,05 M natriumfosfaat (NaHPO 4) en 0,15 M NaCl bij pH 7,2 gedurende 16 uur in de incubator schudden bij 37 ° C. Bewaar het gezuiverde vezels gekoeld in flacons met gedestilleerd water, with 0,01% NaN3 om bacteriële groei te voorkomen, tot het moment van meting. Extractie van elastine vezels van runderen nuchal ligament Verkrijgen van runderen nekregio ligament van het slachthuis, wikkel het in plasticfolie en bewaar het bevroren bij -20 ° C tot gebruik. Zuivere elastine, laat het ligament van de vriezer, laat het ontdooien bij kamertemperatuur, ontvetten met behulp van een scalpel en verteren het ligament in een kokend waterbad volgens de procedure Lansing, 11 als volgt. Bereid een 0,1 M oplossing van natriumhydroxide (NaOH) in gedestilleerd water toevoegen aan de ontvette ligament in een conische kolf, die het weefsel. Kook de kolf in een waterbad bij 95 ° C gedurende 45 minuten. Verwijder het ligament van ontsluitingsrecipiënt en was de onoplosbare weefselblokje herhaaldelijk gedestilleerd water tot pH 7,0 (geanalyseerd met een pH meter) verkregen. Verwijder het weefsel van de uiteindelijkewasoplossing en onderdompelen in gedestilleerd water (gemengd met 0,01% NaN3 om bacteriële groei te voorkomen) in een afgesloten houder en opslaan gekoeld. Verzamel het weefsel uit de koelkast en voorzichtig te veel kracht en pre-stam pincet kleinere segmenten elastine trek niet toe te passen (20 tot 50 mm lang, ongeveer 2 mm dik) van het grotere blok en plaats ze in een petrischaal met PBS (pH 7,4). Met behulp van fijne tang voorzichtig te plagen kleine vezelbundels ongeveer 1 mm dik en snijd ze tot een lengte van een paar mm met behulp van een scalpel. De vezels overbrengen flesjes met gedestilleerd water (met 0,01% NaN3 om bacteriële groei te voorkomen) en bewaar ze gekoeld tot het moment van meting. Montage van de vezels op reflecterende ondergrond Met behulp van een diamantslijper, snijd een stuk van reflecterende siliconen dia. Om een ​​gehydrateerd compartim creërennt, snijd een strook van Parafilm om te passen over de siliconen dia met een holle gesneden in het midden (groot genoeg om een ​​vezel te passen) en plaats deze op de siliconen substraat. OPMERKING: Voor de droge vezel metingen stuurde de parafilm in een U-vorm zodat een van de vier zijden blijft aan de lucht wanneer verzegeld in stap 1.3.4. Verwijder de vezels uit de koelkast, gebruik een paar fijne tang om een ​​vezel te verzamelen van de opslagoplossing en plaats deze in een kleine petrischaal gevuld met zuiver water bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten om het monster te wassen. Verzamel dan de vezel en overbrengen naar het midden van de parafilm hol van siliconen substraat. Voorzichtig: Voorkom schade aan de vezel door strekken tijdens deze operatie, en te voorkomen dat het heroriënteren van het monster op de ondergrond, omdat dit een verandering in de mechanische eigenschappen kan veroorzaken. Plaats een dunne glazen dekglaasje over de vezel en sluit de kamer door het passeren van een verhitte soldeerbout zachtjes over het glasoppervlak van de parafilm eronder smeltenhet glas. Voorzichtig: Voorkom schade aan de vezel door niet de soldeerpunt te dicht of het verwarmen van het substraat overdreven. Plaats de afgesloten kamer op een vlakke ondergrond onder een kleine gewicht en laat het ongeveer 12 uur om een ​​goed contact tussen het monster en silicium substraat te bereiken, terwijl het vermijden van schade aan het monster. Verwijder het gewicht en zet de kamer in plaats van de ondergrond, met schroeven. 2. Instellen van de Brillouin Experiment en het verwerven van Fiber Spectra Voorbereiding van het monster compartiment Monteer het monster bereid zoals in deel 1,3 op een verticale houder voorzien van een goniometer in-vlak rotatie van het monster mogelijk met behoud van een constante verstrooiingshoek (2 Φ = 90 °, zie fig SI-1) en verstrooiing volumepositie. Voer een nauwkeurige focusinstelling van het laserlicht op het monster door de lens. 9 Let op: De laser uitgangsvermogen kan te hoog zijn en produceren een burn in het monster. Zorg ervoor dat deze voldoende hoog is ingesteld op een goede gevoeligheid geven maar niet te hoog om schade aan het monster te voorkomen. Hier gebruikten we een vermogen van ca. 76 mW op het monster. Dit was voldoende om een ​​goede gevoeligheid te krijgen zonder het branden van het monster, ook gezien het feit dat deze is dun en in contact met een substraat dat helpt bij het afvoeren van de warmte die door laser verlichting. Plaats het monster in een 45 ° hoek (Φ) de invallende laserstraal met een Vernier schaal. Bereiken optimale positionering door het uitvoeren van een meting en het maximaliseren van de intensiteit van de pieken in het spectrum (zie hieronder). Het opzetten van de spectrometer Open de software voor de acquisitie en manipulatie van de gegevens en het opzetten van de verwerving van een Brillouin spectrum van het monster 12. De hier beschreven procedure geldt voor de multipass tandem interferometer (Figuur SI-1A). Lijn de twee Fabry-Perot (FP) interferometers onafhankelijk veranderen de op de piëzo door de besturingseenheid spanningen. Voor deze pre-alignment procedure, acht het licht gereflecteerd door elke FP. Wanneer de intensiteit gereflecteerd door de twee KP neigt naar nul, wordt de juiste uitlijning bereikt. Kalibreer het spectrum: de toegankelijke frequentiebereik of vrije spectrale gebied (FSR), afhankelijk van de afstand tussen de twee spiegels van de eerste FP holte L door FSR = c / 2 L, waarbij c de lichtsnelheid en L wordt gemeten met een dial gauge. Synchroniseer de scans van de twee FP interferometers en zet het optische systeem om de tandem multipass configuratie. Een terugkoppeling van de uitgezonden laser lichtintensiteit zal de uitlijning van de twee KP's automatisch te handhaven tijdens de meting. meting of Brillouin Spectra Opgelet De Brillouin spectrum is sterk afhankelijk van de temperatuur en hydratatie van het monster en dus een zorgvuldige controle van deze parameters is essentieel voor het verkrijgen van reproduceerbare spectra. Start de verwerving van een Brillouin spectrum van het monster en laat deze lopen totdat een goede signaal-ruisverhouding wordt bereikt. Dit kan enkele minuten duren afhankelijk van de verstrooiende doorsnede, concentratie en dikte van monsterneming. LET OP: Er is geen vuistregel voor de signaal-ruisverhouding, maar de spectrale kwaliteit wordt gecontroleerd door de experimentator op basis van de specifieke monster geanalyseerd. Er is een wisselwerking tussen spectrale kwaliteit en duur van de meting, waardoor de experimentele parameters moeten worden gekozen volgens de specifieke toepassing. Voor het meten van een droog monster nemen opeenvolgende spectra – voor elk daarvan na stap 2.3.1 – tot er geen veranderingen in de positie van de pieken is waargenomen. Dit wordt bereikt wanneer het monster in evenwicht met het ruimteklimaat en geen verdere droging wordt het spectrum beïnvloeden. Selecteer de lichtpolarisatie (VV en VH, V staat voor verticale en H horizontale richting van de polarisatie van het licht ten opzichte van de verstrooiing vlak) en het verwerven spectra bij elke hoek vezelas (θ Figuur SI-1) door verdraaiing van het monster in vliegtuig met de hand. Sla de Brillouin spectra tot het dossier voor verdere verwerking. 3. Analyse van Brillouin Spectra LET OP: Fit analyse van Brillouin pieken kunnen worden uitgevoerd met behulp van verschillende functies. Een gedempte harmonische oscillator (DHO) functie 4,13 werd geselecteerd omdat dit een geldig model pieken afkomstig van gedempte akoestische modes viscoelastische media. Fit analyse van Brillouin pieken Selecteer de spectrale bereik voor de piek van belang in the Brillouin spectrum. Zorgen voor een basislijn in de draagkracht wanneer de spectrale achtergrond veel hoger dan nul. NB: De basislijn kan variëren tussen spectra. Zorg ervoor dat de correctie wordt toegepast op een systematische en reproduceerbare wijze. Breng een gedetailleerde kleinste kwadraten fitting een DHO functie 4,13 de Brillouin piek plaats iteratief totdat convergentie is bereikt en de best passende curve wordt verkregen. Sla het fit resultaten naar bestand. Verkrijgen gemiddelden van de fit parameters van de twee pieken van elk Brillouin doublet. Bereken de akoestische golf snelheid van de piek frequentie (met behulp van de onderstaande uitdrukking). Plot de pasvorm resultaten door middel van grafieken, bijvoorbeeld, acoustic wave velocity vs. hoek naar glasvezel as, θ En relevante modellen toe te passen (bijvoorbeeld voor akoestisch anisotrope systemen 9) om mechanische grootheden uit te pakken zoals elasticiteit tensor coëfficiënten.

Representative Results

De Brillouin spectroscopie voorzieningen die bij dit experiment (figuur SI-1A) is eerder beschreven. 9 Het gebruik van een single-mode 532 nm halfgeleiderlaser met 76 mW vermogen bij het ​​monster. Een 20 cm achromatische lens focusseert het laserlicht op het monster en verzamelt het verstrooide licht van het monster in een terugverstrooiing geometrie. Een tandem multipass Fabry-Perot interferometer wordt gebruikt voor het filteren van het verstrooide licht, dat vervolgens door een geluidsarme fotodiode detector wordt gedetecteerd. Deze aanpak geeft extreem hoog contrast (ca. 120 dB) en stabiliteit door zelfrichtende piëzo-scanning van de Etalons. Een polarisator en analyzer maken kennis met de polarisatie van het incident en verstrooide licht te selecteren. Spectra worden gewoonlijk verkregen met de polarisator vast blijft selecteren van de verticale (V) richting van het invallende licht en de polarisatie analysator afwisselend selecteren van de verticale (V) or horizontale (H) richting van het verstrooide licht polarisatie. In deze configuratie worden akoestische longitudinale en transversale modi respectievelijk gedetecteerd. Een typische Brillouin spectrum heeft een intense centrale piek als gevolg van elastische verstrooiing en één of meer groepen eveneens verschoven pieken of Brillouin doubletten, waarop de handtekening van de mechanica van het monster. In deze metingen kan het verstrooide licht afkomstig van zowel bulk fononen reizen quasi-loodrecht op het monster en, na reflectie van het invallende licht op het monster-substraatgrensvlak, bulkgoed fononen reist evenwijdig aan het oppervlak (PS modi). 9 Figuur 2 toont BLS spectra van droge en gehydrateerde-trypsine verteerd collageenvezels verkregen met VV polarisatie op 0,2 GHz-resolutie, met een 30 GHz vrije spectrale bereik en ongeveer 10 min collectie tijdper spectrum. Elk spectrum komt overeen met een bepaalde rotatiehoek θ (Figuur SI-1C). In droge collageen vezel bij θ = 0 °, longitudinale modes aanleiding geven tot een bulk piek bij (18.92 ± 0.02) GHz, terwijl de PS-modus is (9.85 ± 0.03) GHz (Figuur 2A). De PS piekverschuivingen lagere frequenties θ gaat van 0 ° (fonon sonderen van de axiale oriëntatie van de vezel) tot 90 ° (fonon sonderen van de radiale richting), terwijl de grootste piek nauwelijks roodverschuiving bij verandering θ in hetzelfde bereik (phonon indringende een quasi-radiale richting tijdens de rotatie). In natte collageenvezels, de twee pieken tengevolge van longitudinale fononen blijven nagenoeg ongewijzigd gedurende het experiment, waarvan het grootste piek bij ca. 10,5 GHz en de PS piek bij 4,9 GHz (figuur 2B). Dit wijst op een 80 tot 100% vermindering piekfrequentie (ten opzichte van de gegevens van 18,92en 9,85 GHz, respectievelijk), en derhalve van de stijfheid van het materiaal, als gevolg van hydratatie. Merk op dat het grootste en PS wijzen van gehydrateerde collageen liggen dicht in frequentie de wijzen van zuiver water, wat suggereert dat de elastische constanten zijn een combinatie van water en vezels bijdragen, met een dominante rol van water. Figuur 3 toont een spectrum van droge-trypsine gedigereerde collageenvezels gemeten bij θ = 30 ° VH polarisatie; een lekkage van de VV polarisatie maakt de PS en bulk pieken nog steeds in acht worden genomen. Dwarsmodi vertegenwoordigen een piek bij (4,1 ± 0,2) GHz (θ = 0 °) die enigszins blauw-verschuivingen θ verandert van 0 ° tot 90 °. Geschikte resultaten voor zowel de dwars- als PS pieken worden ook getoond. Peak parameters werden geëxtraheerd en akoestische golf snelheden werden afgeleid als V L = v λ / √2, waarbij <em> v de frequentie van de verkregen curve-fit analyse van de pieken en λ modus is de excitatie golflengte 532 nm. Merk op dat in deze geometrie kennis van de brekingsindex van het materiaal is niet vereist om de akoestische modus snelheid te verkrijgen (vanwege de verstrooiing geometrie, q s = 2 k i sin (Φ) Figuur SI-1b, c), waardoor waardoor deze benadering bijzonder gunstig. Figuur 4 een grafiek is van de akoestische golf snelheden verkregen uit longitudinale en transversale modi (PS en T pieken) als functie van de hoek θ . Fit analyse een model van hexagonaal symmetrische elastische massieve 7 – Vergelijkingen A1 en A2 onder – geeft de vijf componenten van de elasticiteit tensor droge-trypsine gedigereerde type I collageen vezels (tabel 1). <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page = "1"> De longitudinale en transversale akoestische golf snelheden worden gegeven door 9 (A1) , (A2) waarbij ρ de dichtheid van het materiaal, en c 11 c 33 c 44 c en 13 zijn vier van de vijf elastische constanten die karakteristiek zijn met hexagonale symmetrie. De vijfde constante, c 12, kan worden afgeleid uit de geschatte verhouding c 12 c 11 ~ -. C 2 44 7 Coëfficiënten komen overeen met die welke eerder verkregen ongezuiverde collageen fibers. 9 een merkbaar verschil treedt op voor de coëfficiënt c 13, dat tot uiting komt in de vergelijkbare waarden van de elastische moduli E ǁ en E (Ongeveer 7,2 en 7,7 GPa) voor het gezuiverde collageen. Figuur 5 is een grafiek van de longitudinale akoestische golfsnelheid natte collageen versus θ . In dit geval wordt geen periodieke verandering in de frequentie aangetroffen hetgeen een constante snelheid in de fout. Figuur 6 toont de spectra van droge en gehydrateerde elastinevezels gemeten bij θ = 0 °. Dwarsmodi niet zijn waargenomen voor deze monsters. In droge elastine, het grootste piek treedt op bij 16,8 GHz, terwijl de PS-modus bij 8,2 GHz 9 (13 en 20% lager dan de overeenkomstige toppen van droog collageen). Natte elastinevezels presenteren een bulk peak bij (12.30 ± 0.01) GHz (37% lager in frequentie dan het grootste hoogtepunt van droge elastine). De PS wijze van natte elastine is niet zichtbaar in het spectrum vanwege de intense staart van de elastische piek bij die frequenties. Anderzijds, wordt de piek bij ongeveer 7,5 GHz toegeschreven aan het grootste deel water. Figuur 7 toont de afhankelijkheid van akoestische golfsnelheid in droge elastine vezels op θ. Uit deze gegevens, de elasticiteit tensorcomponenten (en mechanische moduli) werden verkregen (Tabel 1). 9 Zoals in natte collageen, sprake is van isotropie van de mechanische modulus gehydrateerde elastinevezels. Deze resultaten geven aan hoe Brillouin spectroscopie relevante gegevens over stijfheid, samenstelling en structurele aspecten van een materiaal geven. Figuur 1. Akoestische en optische fononen in eendimensionale keten van atomen. Schematische weergave van akoestische en optische trillingen in een eendimensionale diatomische keten. Atomen massa m 1 en m 2 en worden afgewisseld. Pijlen geven de verplaatsingen van de atomen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 2. Brillouin-spectra van trypsine gezuiverde Type I collageen vezels uit rattenstaart pees. Spectra van (A) en droge vezel (B) gehydrateerd vezel uit VV metingen bij verschillende hoek θ vezelas in graden. Een spectrum van zuiver gedestilleerd water wordt ook getoond. Spectra werden genormaliseerd op de intensiteit (hoogte) van het grootste piek. Labels B PS duiden pieken verband met bulk en parallel-naar-oppervlakte-modus, respectievelijk. Fout balken geven de standaardfout (vierkantswortel van het aantal tellingen). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 3. Brillouin spectrum van droge-trypsine gezuiverde type I collageen vezels uit rattenstaart pees. Spectrum van een VH-meting bij θ = 30 °. Labels T, PS en B duiden pieken betrekking tot overdwarse, parallel-naar-oppervlak en bulk modi respectievelijk. Resultaten van geschikte analyse met een gedempte harmonische oscillator (DHO) model voor zowel T- als PS modi worden ook getoond. Fout balken geven de standaardfout (vierkantswortel van het aantal tellingen)./54648fig3large.jpg "Target =" _ blank "> Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 4. Plot van de akoestische golf snelheid in droge-trypsine gezuiverd collageen vs hoek naar glasvezel as. Lengte- en dwarsrichting acoustic wave snelheden van droog collageen vezels afkomstig zijn van fit analyse van de Brillouin pieken. Gegevens zijn gemonteerd op een model van hexagonaal symmetrische elastische vaste stof. Rode lijn: Vergelijking A1 (R 2 = 0,99); blauwe lijn: Vergelijking A2 (R 2 = 0,36). Fout balken geven de standaard fouten verkregen uit de wortel van de diagonale elementen van de covariantiematrix na een Levenberg-Marquardt niet-lineaire kleinste kwadraten van Brillouin spectra. Klik hier om een grotere versi bekijken op van dit cijfer. Figuur 5. Plot van de longitudinale akoestische golf snelheid in nat-trypsine gezuiverd collageen vs hoek naar glasvezel as. Longitudinal akoestische golf snelheid van gehydrateerde collageen vezels afkomstig zijn van fit analyse van de Brillouin pieken. De getoonde lijn is een leidraad voor het oog en geeft de gemiddelde waarde van de akoestische golf snelheid in dit bereik. Fout balken geven de standaard fouten verkregen uit de wortel van de diagonale elementen van de covariantiematrix na een Levenberg-Marquardt niet-lineaire kleinste kwadraten van Brillouin spectra. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. jpg "/> Figuur 6. Brillouin spectra van elastinevezels van runderen nekregio ligament. Spectra van droge en gehydrateerde vezel bij θ = 0 °. Spectra werden genormaliseerd op de intensiteit (hoogte) van het grootste piek. Labels B PS duiden pieken verband met bulk en parallel-naar-oppervlakte-modus, respectievelijk. B F en B W verwijzen naar de grootste pieken van de vezels en water, resp. Fout balken geven de standaardfout (vierkantswortel van het aantal tellingen). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 7. Plot van de longitudinale akoestische golf snelheid in droge elastine vs hoek naar glasvezel as. Longitudinal akoestische golf snelheid van droge elastine fiber afgeleid van fit analyse van de Brillouin pieken. Gegevens zijn gemonteerd op een model van hexagonaal symmetrische elastische vaste stof. Rode lijn: Vergelijking A1 9 (R 2 = 0,74). Fout balken geven de standaard fouten verkregen uit de wortel van de diagonale elementen van de covariantiematrix na een Levenberg-Marquardt niet-lineaire kleinste kwadraten van Brillouin spectra. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur SI-1. Schema van de Brillouin instellen en BLS verstrooiing geometrie. (A) Het invallende licht uitgezonden door een halfgeleiderlaser wordt door een achromatische lens om het monster gestuurd. Het licht dat door bulk acoustic fononen en door die voortvloeien uit reflectie van licht aan het substraatoppervlak, dat in contact met het monster, wordt opgevangen door de lens, gefilterd door een tandem-multipass Fabry-Perot interferometer en gedetecteerd door een fotomultiplicator. FP1 en FP2 geven de twee interferometers die de tandem set-up. Een polarisator selecteert de polarisatierichting van invallend licht, en een analysator gebruikt om de polarisatie van verstrooide licht te selecteren. (B) BLS geometrie met een monster in contact met het oppervlak van een reflecterend siliciumsubstraat. Een glasplaatje (niet getoond) boven het monster geplaatst om het compartiment af te dichten en lichte druk wordt via elektroden op de hoeken van het substraat. Het invallende licht (k i) door de lens, wordt gebroken in de lucht-monster interface (k 'i) en gericht op het monster-substraat interface. De verstrooide licht door dezelfde lens verzameld (k 's) het resultaat van de interactie met zowel bulk fononen (qb) en die reist PS van het monster (qs). . Hoeken tussen de richtingen van het licht en de normaal op het oppervlak worden aangeduid als Φ en Φ '(C) Schematische weergave van het monster en van de aangenomen assenstelsel; z bepaalt de buitengewone as parallel aan de vezelrichting. Hoeken θ en α zijn die tussen de richting van fononen q s en q b om de z-as, respectievelijk k i, k 'i, k s, k' s:. Golfgetallen van het incident en verstrooid licht, q b, q s, golf vectoren van de bulk en PS standen, respectievelijk. (Herdruk van ref 9.) Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. <pclass = "jove_content" fo: keep-met-next.within-page = "always"> Tabel 1. Elastische tensor coëfficiënten afgeleid van fit analyse van de akoestische golf snelheden Elastic tensor coëfficiënten van droge-trypsine gezuiverde type I collageen vezels (. dit werk) en elastine vezels (ref 9). monster elastische coëfficiënten (GPA) Trypsine-gedigereerde collageen c 33 18,7 ± 0,1 c 11 14,4 ± 0,2 c 44 3.4 ± 0.1 c 12 7.2 ± 0.2 c 13 11,2 ± 0,3 elastine c 33 11,5 ± 0,2 c 11 10,4 ± 0,1 c 44 1,9 ± 0,2 c 12 6.6 ± 0.2 c 13 6,8 ± 0,3

Discussion

Brillouin verstrooiing spectroscopie is een uniek instrument waarmee de afzonderlijke componenten van de elasticiteit tensor van een eiwit vezel kan worden gekenmerkt ongekend detail. Bovendien kunnen de metingen worden verricht op een microscopische schaal en daardoor zal ons voorzien van nieuwe inzichten in de micro-schaal mechanica van biologische structuren, zodat we voor de eerste keer aan de mechanische, en waarschijnlijk functioneel, de betekenis van de complexiteit te begrijpen in matrix architectuur en biochemie die is geopenbaard in de afgelopen jaren.

De techniek meet mechanische eigenschappen in een GHz frequentiebereik. Dit domein is nog nooit eerder onderzocht voor structurele biopolymeren en het zowel verhoogt en zorgt voor de middelen om fundamentele vragen over de moleculaire mechanismen van de elasticiteit te beantwoorden.

We beschreven de stappen om collageen en elastine vezels te extraheren uit dierlijke weefsels en Brillouin scatteri metenng spectra met behulp van een reflecterend substraat te bereiken de volledige beschrijving van vezels biomechanica. Kritische stappen in het protocol zijn degenen die ervoor zorgen dat gezuiverde vezels worden verkregen en de juiste experimentele omstandigheden zijn in de plaats voor reproduceerbare metingen van de vezelachtige eiwitten. Er moet echter worden bedacht dat de winning procedures van de mechanische eigenschappen van de vezels kan wijzigen.

Modificaties van de techniek hebben betrekking op de koppeling met optische microscopie voor microfocused Brillouin verstrooiing en in kaart brengen benadert 13 en de mogelijke combinatie met aanvullende technieken (bijvoorbeeld Raman scattering). Huidige toepassingen van de techniek zijn voornamelijk gericht op excised biologische materialen, maar belangrijke ontwikkelingen, bijvoorbeeld die op basis van meerdere VIPA etalons 14, maken het mogelijk de vertaling van deze techniek uit de stationaire naar het bed met een reeks toepassingen reeds demontoond 15,16 inclusief mogelijke in vivo toepassingen. De VIPA benadering is een alternatief voor wat we beschrijven; zij sneller acquisitietijd die niet noodzakelijkerwijze geschikt bij ondoorzichtige monsters zoals hier onderzocht. Bovendien is het gebruik van een reflecterend substraat niet praktisch setups die VIPA etalons gebruiken omdat hun contrast niet voldoende om de quasi-elastic light verwerpen zou zijn. Beperkingen met betrekking tot de snelheid van de overname van een spectrale dataset en de inherent zwakke verstrooiing dwarsdoorsnede van het materiaal kunnen aanvragen om dynamische biologische systemen en aan de overname van gegevens uit diep in de weefsels te beperken, maar de technische verfijningen kan verbeteren op de huidige prestaties.

BLS belooft een belangrijk instrument in fundamenteel biofysisch onderzoek naar de extracellulaire matrix en daardoor tot nieuwe inzichten in de evolutie van de mechanische eigenschappen tijdens matrix groei en hun verlies in pathologische producerendegeneratie. Het is echter belangrijk om te onthouden dat de metingen invasief en kan derhalve in vivo worden uitgevoerd. Inderdaad, dit is reeds bereikt in het hoornvlies 16 en deze werkzaamheden kan een platform voor de ontwikkeling van nieuwe diagnostische instrumenten voor een breed scala van bindweefsel stoornissen.

Ultrasound elastography en atomic force microscopie (AFM) zijn alternatieve micromechanische meting, maar de BLS techniek biedt betere ruimtelijke resolutie (op subcellulair schaal) dan de eerdere, in tegenstelling AFM legt geen mechanische krachten op het monster en is niet beperkt tot de analyse enige oppervlaktekenmerken. Brillouin moduli van collageen en elastine in de GPa range, terwijl Young's moduli van macroscopische stammen zijn in de orde van MPa (verdere details zullen elders worden gerapporteerd). Dit resultaat geeft een differentiële elasticiteitsmodulus met een sterke afhankelijkheid van de excitatiefrequentie wegenshet visco-elastische gedrag van de vezels. BLS kan worden toegepast op een groot aantal problemen en materialen biomedische wetenschap. Het kan helpen bij het beantwoorden van vragen over fysiologie en pathologie van biologisch weefsel, en verstrekt een fysieke hulpmiddel voor het doorgronden van materialen en interacties op moleculair niveau.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported by the Engineering and Physical Sciences Research Council [grant number EP/M028739/1]. RSE was supported by a Santander Postgraduate Research Award 2015.

Materials

Chondroitinase ABC Sigma-Aldrich C2905
Tris Buffer Fluka 93358
Sodium Acetate Fisher Scientific S608-500
PBS Sigma-Aldrich P4417
Sodium Azide Fisher Scientific S2002
Streptomyces Hyaluronidase  Sigma-Aldrich H1136-1AMP
Sodium Chloride Fisher Scientific S7653
Trypsin Sigma-Aldrich T4665
Sodium Phosphate Sigma-Aldrich S9638
Sodium Hydroxide Fisher Scientific S320-500
Pure Water Millipore ZRQS0P3WW Produced In-House 
Distilled Water Bibby Scientific Limited D4000 Produced In-House from water still
Euthatal Merial  J01601A 
Tandem Interferometer TFP-1 JRS Scientific Instruments
Freezer Lec TU55144
Refrigerator Zanussi ZBA15021SA
Hot Plate Fisher Scientific SP88857206
Clamps VWR 241-7311 & 241-7201
Clamp Stand VWR  241-0093
Thermometer Fisher Scientific 13-201-401
Cling Film Sainsbury's 7650540
Parafilm Sigma-Aldrich P7793-1EA
Silicone IDB Technologies N/A No catalogue number. Order upon request
Cover Glass VWR 631-1571
Conical Flask VWR 214-1175
Beaker VWR 213-0469
Measuring Cylinder VWR 612-3838
Vial VWR 548-0051 & 548-0863
Petri Dish VWR 391-0441
Scalpel Swann Morton Ltd  0914 & 0308
Diamond Scribe RS Instruments 394-217
Soldering Iron RS Instruments 231-5332
Fine Forceps VWR 232-0188
Double Micro-Spatula VWR Various Sizes
pH Meter Hanna Instruments HI-2210-02
Orbital Shaker IKA  0002819000
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brillouin, L. Diffusion de la lumière et des rayonnes X par un corps transparent homogène; influence de l’agitation thermique. Ann. Phys. 17, 88-122 (1922).
  2. Caponi, S., Corezzi, S., Mattarelli, M., Fioretto, D. Stress effects on the elastic properties of amorphous polymeric materials. J. Chem. Phys. 141 (21), 214901 (2014).
  3. Mattarelli, M., Montagna, M., Still, T., Schneider, D., Fytas, G. Vibration spectroscopy of weakly interacting mesoscopic colloids. Soft Matter. 8 (15), 4235-4243 (2012).
  4. Comez, L., Masciovecchio, C., Monaco, G., Fioretto, D., Robert, E. C., Robert, L. S. . Solid State Physics. 63, 1-77 (2012).
  5. Madami, M., et al. Direct observation of a propagating spin wave induced by spin-transfer torque. Nat. Nanotechnol. 6 (10), 635-638 (2011).
  6. Harley, R., James, D., Miller, A., White, J. W. Phonons and the elastic moduli of collagen and muscle. Nature. 267 (5608), 285-287 (1977).
  7. Cusack, S., Miller, A. Determination of the elastic constants of collagen by Brillouin light scattering. J. Mol. Biol. 135 (1), 39-51 (1979).
  8. Vaughan, J. M., Randall, J. T. Brillouin scattering, density and elastic properties of the lens and cornea of the eye. Nature. 284 (5755), 489-491 (1980).
  9. Palombo, F., et al. Biomechanics of fibrous proteins of the extracellular matrix studied by Brillouin scattering. J. R. Soc. Interface. 11 (101), (2014).
  10. Sivan, S. S., et al. Age-related accumulation of pentosidine in aggrecan and collagen from normal and degenerate human intervertebral discs. Biochem. J. 399 (1), 29-35 (2006).
  11. Soskel, N. T., Wolt, T. B., Sandberg, L. B., Leon, W. C. . Methods in Enzymology. 144, 196-214 (1987).
  12. Fioretto, D., Scarponi, F. Dynamics of a glassy polymer studied by Brillouin light scattering. Mater. Sci. Eng. A. 521-522, 243-246 (2009).
  13. Palombo, F., Madami, M., Stone, N., Fioretto, D. Mechanical mapping with chemical specificity by confocal Brillouin and Raman microscopy. Analyst. 139 (4), 729-733 (2014).
  14. Scarcelli, G., Yun, S. H. Multistage VIPA etalons for high-extinction parallel Brillouin spectroscopy. Opt. Express. 19 (11), 10913-10922 (2011).
  15. Scarcelli, G., Kim, P., Yun, S. H. In Vivo Measurement of Age-Related Stiffening in the Crystalline Lens by Brillouin Optical Microscopy. Biophys. J. 101 (6), 1539-1545 (2011).
  16. Scarcelli, G., Yun, S. H. In vivo Brillouin optical microscopy of the human eye. Opt. Express. 20 (8), 9197-9202 (2012).

Tags

Extracellular MatrixCollagenElastinBrillouin SpectroscopyTendonChondroitinase ABCStreptomyces HyaluronidaseTrypsinBovine Nuchal LigamentSodium HydroxideWater Bath

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Edginton, R. S., Mattana, S., Caponi, S., Fioretto, D., Green, E., Winlove, C. P., Palombo, F. Preparation of Extracellular Matrix Protein Fibers for Brillouin Spectroscopy. J. Vis. Exp. (115), e54648, doi:10.3791/54648 (2016).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image