We present a protocol for the application of Brillouin light scattering spectroscopy to elastin and trypsin-purified type I collagen fibers of the extracellular matrix to extract their full elastic properties.
Brillouin spectroscopy is an emerging technique in the biomedical field. It probes the mechanical properties of a sample through the interaction of visible light with thermally induced acoustic waves or phonons propagating at a speed of a few km/sec. Information on the elasticity and structure of the material is obtained in a nondestructive contactless manner, hence opening the way to in vivo applications and potential diagnosis of pathology. This work describes the application of Brillouin spectroscopy to the study of biomechanics in elastin and trypsin-digested type I collagen fibers of the extracellular matrix. Fibrous proteins of the extracellular matrix are the building blocks of biological tissues and investigating their mechanical and physical behavior is key to establishing structure-function relationships in normal tissues and the changes which occur in disease. The procedures of sample preparation followed by measurement of Brillouin spectra using a reflective substrate are presented together with details of the optical system and methods of spectral data analysis.
פיזור אור ברילואן (BLS) האפקט התגלה על ידי לאון ברילואן בשנת 1922. 1 הוא מורכב של הפיזור הקשיח של אור הנראה על ידי פונונים אקוסטי מופעלים תרמית בחומר. בפיסיקה של מצב מוצק, פונונים אקוסטי הן תנודות קוהרנטית של כל האטומים בסריג. שרשרת חד ממדית של שני סוגי לסירוגין של אטומים בסריג היא מודל פשוט הממחיש את ההבדל בין פונונים אקוסטית, נחשפו על ידי BLS, ו פונונים אופטי, נחקרו על ידי קליטת IR ו פיזור ראמאן (איור 1). פונונים אקוסטיות נמצאים פאזיים תנועות של אטומים בשרשרת עם תזוזה לאורך כיוון התפשטות (פונונים אקוסטי האורך) או בניצב לכיוון התפשטות (רוחבי פונונים אקוסטית), תוך פונונים אופטי הם מחוץ פאזיים תנועות של אטומים הפקת מומנט דיפול חשמלי נדנוד (אורך או מצבים רוחביים).
spectro BLSscopy נעשה שימוש במדע אנליטיים מאז 1920; עם זאת, רק מאז 1980 יש מדידות ניגודיות גבוהה התאפשרה הודות לשימוש ספקטרומטר פברי פרו- multipass טנדם. מאז, מספר גדל והולך של ההתקדמות BLS עבור יישומים אנליטיים החומר המעובה (שבו האינטראקציה-פונון פוטון מנוצלת) 2-4 ומגנטיות חומרים (באמצעות אינטראקציה פוטון-מניון) 5 הובא על. עבודות הזרע על יישומים ביו 6-8 סללו את הדרך לפיתוח גישות שונות, כולל אחת מיושם פה אחד שתואר לעיל 9 באמצעות מצע רעיוני בתצורה דמוי טסיות להשיג את התיאור המלא של מותח גמישות דוגמית.
בעבודה הנוכחית, אנו מיישמים ספקטרוסקופיה BLS אל מרכיביו הבסיסיים של תאי מטריקס ברקמות חיבור, החלבונים הסיביים אלסטין Type I-קולגן. Type לי קולגן הוא מולקולת סליל נוקשה, משולשת אשר מרכיבה רוחבי longitudinally עם לחצות קישור נרחב ליצירה סיבית נוקשה למעשה ברקמות כגון גידים. רשתות של קולגן שלרוב מתקיימות עם רשתות של אלסטין, חלבון אשר, באופן יוצא דופן, יוצר גמישות לטווח ארוך באמצעות שילוב של אנטרופיה אינטראקציות הידרופוביות עם הסביבה והוא חיוני לפונקציות של רקמות כגון ריאות ועור. סיבי שניהם מודל באמצעות מודל קריסטל משושה במחקר הנוכחי. 9 בחלק 1, אנו מתארים את הפרוטוקול לחלץ סיבים מרקמות של בעלי חיים כדי להכין את המדגם עבור מדידות ספקטרוסקופיות. בחלק 2, ההליך להקמת המנגנון ברילואן ורכישת ספקטרה מסיבי מוצג. חלק 3 נותן פרטים של ניתוח נתונים להחיל את ספקטרום ברילואן כדי לחלץ את המידע המכאני הרלוונטי הכלול בו. לאחר מכן, תוצאות נציגים מוצגות discusseד.
ספקטרוסקופיה ברילואן הפיזור היא כלי ייחודי שבו הרכיבים הבודדים של מותח האלסטיות של סיבי חלבון ניתן לאפיין בפירוט חסר תקדים. יתר על כן, המדידות יכולות להתבצע על בקנה מידה מיקרוסקופי ובכך תספקנה לנו תובנה רומן לתוך מכניקת מייקרו בקנה המידה של מבנים ביולוגיים, מה שמאפשרים לנו, בפעם הראשונה, כדי להבין את המכנים, וכנראה תפקודי, משמעות של המורכבויות באדריכלות וביוכימיה מטריקס אשר נחשף בשנים האחרונות.
הטכניקה מודדת תכונות מכאניות בתחום תדרי GHz. תחום זה לא נחקר לפני עבור biopolymers מבני וזה הוא מעלה מספק את האמצעים כדי לענות על שאלות בסיסיות אודות מנגנונים מולקולריים של גמישות.
תיארנו את השלבים הדרושים כדי לחלץ סיבי קולגן ואלסטין מרקמות של בעלי חיים כדי למדוד ברילואן scattering ספקטרום באמצעות מצע רעיוני כדי להשיג את התיאור המלא של ביומכניקה סיבים. צעדים קריטיים בתוך הפרוטוקול הם אלה המבטיחים כי סיבי מטוהרים מתקבלים תנאי ניסוי מתאימים נמצאים במקום למדידות לשחזור של החלבונים הסיביים. עם זאת, הוא חייב לזכור כי הליכי המיצוי רשאיים לשנות את התכונות המכאניות של הסיבים.
שינויים של הטכניקה כרוך הצימוד עם מיקרוסקופיה אופטית עבור פיזור ברילואן microfocused ומיפוי מתקרב 13 ואת השילוב האפשרי עם טכניקות משלימות (למשל, פיזור ראמאן). יישומים נוכחיים של הטכניקה הם התמקדו בעיקר חומרים ביולוגיים ניכרים, אבל התפתחויות חשובות, למשל, אלה המבוססים על etalons VIPA מספר 14, עושים אפשרי התרגום של טכניקה זו מן המעבדתיים אל מיטתו עם מגוון רחב של יישומים כבר שדstrated 15,16 כולל פוטנציאל ביישומים vivo. גישת VIPA מהווה חלופה למה שאנו מתארים; יש לו זמן רכישה מהר אבל אינו מתאים בהכרח במקרה של דגימות אטומות כגון אלה נתחו כאן. יתר על כן, השימוש מצע רעיוני אינו מעשי קופצים להגדיר המשתמשות etalons VIPA כי בניגוד שלהם לא יהיה מספיק כדי לדחות את האור מעין-אלסטי. מגבלות הקשורות למהירות של רכישת מערך נתונים ספקטרליים ואת חתך פיזור החלש מטבעו של החומר עלולות להגביל יישומים למערכות ביולוגיות דינמיות לרכישת נתונים ממעמקי רקמות, אבל חידודים טכניים עשויים לשפר על ביצועים נוכחיים.
BLS מבטיח להיות כלי מרכזי במחקר ביו-יסודי על תאי מטריקס ובכך לייצר תובנות חדשות אודות האבולוציה של תכונות מכניות במהלך הצמיחה מטריקס ההפסד שלהם פתולוגינִווּן. עם זאת, חשוב לזכור כי המדידות הן לא פולשנית, ולפיכך עלולה להתבצע in vivo. ואכן, זה כבר הושג בתוך הקרנית 16 ו עבודה כזו עשויה לספק פלטפורמה לפיתוח כלי אבחון חדש עבור מגוון רחב של הפרעות רקמות חיבור.
elastography אולטראסאונד במיקרוסקופ כוח אטומי (AFM) הם שיטות חלופיות המדידה micromechanical, אבל הטכניקה BLS מציעה רזולוציה מרחבית טובה יותר (בסולם subcellular) מאשר לשעבר, ובניגוד AFM, מטילה שום כוחות מכניים על הדגימה אינו מוגבל הניתוח רק של תכונות פני השטח. moduli ברילואן של קולגן ואלסטין הם בטווח GPA, תוך moduli של צעירים זנים מקרוסקופית הם בסדר גודל של מגפ"ס (לפרטים נוספים ידווחו במקום אחר). תוצאה זו מצביעה על מודולוס הפרש אלסטי עם תלות חזקה על תדר העירור, בשלהתנהגות viscoelastic של הסיבים. BLS ניתן ליישם במגוון רחב של בעיות וחומרים במדעים ביו. זה יכול לעזור לענות על שאלות על הפיזיולוגיה והפתולוגיה של רקמות ביולוגיות, כמו גם לספק כלי פיזי עבור הבנה בסיסית של חומרים ואינטראקציות ברמה המולקולרית.
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by the Engineering and Physical Sciences Research Council [grant number EP/M028739/1]. RSE was supported by a Santander Postgraduate Research Award 2015.
Chondroitinase ABC | Sigma-Aldrich | C2905 | |
Tris Buffer | Fluka | 93358 | |
Sodium Acetate | Fisher Scientific | S608-500 | |
PBS | Sigma-Aldrich | P4417 | |
Sodium Azide | Fisher Scientific | S2002 | |
Streptomyces Hyaluronidase | Sigma-Aldrich | H1136-1AMP | |
Sodium Chloride | Fisher Scientific | S7653 | |
Trypsin | Sigma-Aldrich | T4665 | |
Sodium Phosphate | Sigma-Aldrich | S9638 | |
Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | S320-500 | |
Pure Water | Millipore | ZRQS0P3WW | Produced In-House |
Distilled Water | Bibby Scientific Limited | D4000 | Produced In-House from water still |
Euthatal | Merial | J01601A | |
Tandem Interferometer TFP-1 | JRS Scientific Instruments | ||
Freezer | Lec | TU55144 | |
Refrigerator | Zanussi | ZBA15021SA | |
Hot Plate | Fisher Scientific | SP88857206 | |
Clamps | VWR | 241-7311 & 241-7201 | |
Clamp Stand | VWR | 241-0093 | |
Thermometer | Fisher Scientific | 13-201-401 | |
Cling Film | Sainsbury's | 7650540 | |
Parafilm | Sigma-Aldrich | P7793-1EA | |
Silicone | IDB Technologies | N/A | No catalogue number. Order upon request |
Cover Glass | VWR | 631-1571 | |
Conical Flask | VWR | 214-1175 | |
Beaker | VWR | 213-0469 | |
Measuring Cylinder | VWR | 612-3838 | |
Vial | VWR | 548-0051 & 548-0863 | |
Petri Dish | VWR | 391-0441 | |
Scalpel | Swann Morton Ltd | 0914 & 0308 | |
Diamond Scribe | RS Instruments | 394-217 | |
Soldering Iron | RS Instruments | 231-5332 | |
Fine Forceps | VWR | 232-0188 | |
Double Micro-Spatula | VWR | Various Sizes | |
pH Meter | Hanna Instruments | HI-2210-02 | |
Orbital Shaker | IKA | 0002819000 |