Herstellung von extrazellulären Matrix Proteinfasern für Brillouin-Spektroskopie

Die Brillouin – Spektroskopie Gerät in diesem Experiment verwendet (Abbildung SI-1A) wurde zuvor beschrieben. 9 Es verwendet einen Monomode – 532 nm Halbleiterlaser mit 76 mW Ausgangsleistung bei der Probe. Eine 20 cm achromatische Linse fokussiert das Laserlicht auf die Probe und sammelt das gestreute Licht von der Probe in einer Rückstreugeometrie. Ein Tandem Multi Fabry-Perot-Interferometer zum Filtern des Streulichts verwendet wird, die dann durch einen rauscharmen Photodiodendetektor detektiert wird. Dieser Ansatz bietet eine extrem hohe Kontrast (ca. 120 dB) und der Stabilität durch selbstausrichtende piezo Abtastung der Etalons. Ein Polarisator und Analysator eingeführt, um die Polarisation des einfallenden und gestreuten Lichts auszuwählen. Spektren werden in der Regel mit der Polarisator fixiert gehalten Auswählen der vertikalen (V) Richtung des einfallenden Lichtpolarisation und den Analysator Auswählen alternativ die vertikale (V) o erhaltenr horizontalen (H) Richtung der Streulichtpolarisation. In dieser Konfiguration sind Längs- und Quer akustischen Moden jeweils detektiert. Ein typisches Brillouin Spektrum hat eine intensive zentralen Spitze aufgrund der elastischen Streuung und einen oder mehrere Sätze von gleichmäßig verschobenen Peaks oder Brillouin Dubletts, die die Signatur der Mechanik der Probe sind. Bei diesen Messungen kann das Streulicht stammen beide aus bulk Phononen reisen quasi-orthogonal zu der Probe und nach der Reflexion des einfallenden Lichts an der Probe-Substrat – Grenzfläche, aus bulk Phononen sich parallel zur Oberfläche (PS – Modus). 9 Abbildung 2 zeigt BLS – Spektren von trockenen und hydrierten trypsinverdauten Kollagenfasern mit VV Polarisation erhalten bei 0,2 GHz Auflösung, mit einem 30 – GHz – freie Spektralbereich und etwa 10 Minuten Sammelzeitpro Spektrum. Jedes Spektrum entspricht einem bestimmten Drehwinkel θ (Abbildung SI-1C). In trockenen Kollagenfaser bei θ = 0 °, Longitudinalmoden ergeben eine Massenpeak bei (18,92 ± 0,02) GHz , während die PS – Modus bei (9,85 ± 0,03) GHz (2A) ist. Die PS Peak verschiebt sich zu niedrigeren Frequenzen als θ von 0 ° (Phonon die axiale Ausrichtung des Faser Sondieren) wird auf 90 ° (Phonon die radiale Ausrichtung Sondieren), wohingegen die Schütt peak nur leicht rot-Verschiebungen auf θ im gleichen Bereich ändernden (Phononen Sondieren eine quasi-radialer Richtung auf der ganzen Drehung). In wet Kollagenfaser, sind die zwei Peaks aufgrund Längs Phononen wesentlichen unverändert während des gesamten Experiments, wobei der Groß Peak bei ca. 10,5 GHz und der PS – Peak bei 4,9 GHz (2B). Dies weist auf eine 80 bis 100% ige Verringerung der Spitzenfrequenz (bezogen auf die Daten von 18.92und 9,85 GHz, jeweils) und somit der Steifigkeit des Materials durch Hydratation. Beachten Sie, dass die Masse und das PS-Modi von hydratisiertem Kollagen nahe liegen in der Frequenz zu den Moden des reinen Wassers, was darauf hindeutet, dass seine elastischen Konstanten sind eine Kombination aus der Wasser- und Faser Beiträge, mit einer dominanten Rolle von Wasser gespielt. Figur 3 zeigt ein Spektrum von trockenem trypsinverdauten Kollagenfaser bei θ = 30 ° , gemessen mit VH Polarisation; eine Leckage der VV Polarisation ermöglicht die PS und bulk Spitzen noch beobachtet werden. Transversalmoden machen einen Spitzenwert bei (4,1 ± 0,2) GHz (θ = 0 °) , die leicht blau-Verschiebungen als θ ändert sich von 0 ° bis 90 °. Anpassungsergebnisse sowohl für die Quer- und PS Peaks sind ebenfalls gezeigt. Peak – Parameter wurden extrahiert und akustischen Wellengeschwindigkeiten wurden als V L = v λ abgeleitet / √2, wo <em> v die Frequenz des Modus durch Kurvenanpassungsanalyse der Spitzen und λ erhalten wird , die Anregungswellenlänge, 532 nm. Man beachte , dass in dieser Geometrie Kenntnis des Brechungsindex des Materials ist nicht zu erhalten , die akustischen Modus Geschwindigkeit (aufgrund der Streugeometrie, q s = 2 k i sin (Φ) ist , Fig SI-1b, c) erforderlich ist , damit dieser Ansatz macht besonders vorteilhaft. Figur 4 ist eine graphische Darstellung der Schallwellengeschwindigkeiten , erhalten aus Längs- und Quermoden (PS und T Peaks) als Funktion des Winkels θ . Fit – Analyse zu einem Modell von hexagonal symmetrischen elastischer Feststoff 7 – Gleichungen A1 und A2 unter – stellt die fünf Komponenten des Elastizitäts Tensor trockenen trypsinverdauten Typ – I – Kollagen – Fasern (Tabelle 1). <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page = "1"> Die Längs- und Querschallwellengeschwindigkeiten von 9 gegeben , (A1) , (A2) wobei ρ die Dichte des Materials ist, und c 11, c 33, c 44 und c 13 sind vier der fünf elastischen Konstanten , die Systeme mit einer hexagonalen Symmetrie charakterisieren. Die fünfte Konstante, c 12, kann von der ungefähren Beziehung c 12 ~ c 11 abgeleitet werden . – 2 c 44 7 Die Koeffizienten sind jene, die zuvor von ungereinigtem Kollagen fibe erhalten ähnlichrs. 9 einen spürbaren Unterschied tritt für den Koeffizienten c 13 , die in ähnliche Werte der Elastizitätsmodul E ǁ und E reflektiert wird (Etwa 7,2 und 7,7 GPa) für das gereinigte Kollagen. 5 ist eine graphische Darstellung der longitudinalen akustischen Wellengeschwindigkeit des nassen Collagen gegen θ . In diesem Fall ist keine periodische Änderung der Frequenz beobachtet, eine konstante Geschwindigkeit in der Störung zu geben. 6 zeigt die Spektren von trockenen und hydratisierten Elastinfasern bei θ = 0 ° gemessen. Transversale Moden wurden für diese Proben nicht nachgewiesen. In trockenen Elastin, tritt der größte Peak bei 16,8 GHz , während die PS – Modus bei 8,2 GHz 9 (13 und 20% niedriger als die entsprechenden Spitzen von trockenem Kollagen). Wet Elastinfasern stellen eine Masse peak in (12.30 ± 0.01) GHz (37% niedriger in der Frequenz als der Schütt peak trockenem Elastin). Die PS-Modus von nassen Elastin ist im Spektrum nicht offensichtlich wegen der intensiven tail des elastischen Peak bei diesen Frequenzen. Auf der anderen Seite wird der Peak bei ca. 7,5 GHz an die Wassermasse zurückgeführt. Abbildung 7 zeigt die Abhängigkeit der Schallwellengeschwindigkeit in trockenem Elastin Faser auf θ. Aus diesen Daten wurden die Elastizität Tensorkomponenten (und mechanischen Moduli) erhalten (Tabelle 1). Wie in 9 nassen Collagen, gibt es Hinweise auf die Isotropie der mechanischen Modul von hydratisiertem Elastinfasern. Diese Ergebnisse zeigen, wie Brillouin-Spektroskopie relevanten Informationen über die Steifigkeit, die Zusammensetzung und strukturelle Aspekte eines Materials geben kann. FiAbbildung 1. akustische und optische Phononen in eindimensionalen Kette von Atomen. Schematische Darstellung von akustischen und optischen Schwingungen in einem eindimensionalen zweiatomige Kette. Atome aufweisen Masse m 1 und m 2 und werden abgewechselt. Die Pfeile zeigen die Verschiebungen der Atome. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen. Abbildung 2. Brillouin – Spektren von Trypsin-gereinigten Typ – I – Kollagenfasern aus der Rattenschwanzsehne. Spektren von (A) und Trockenfaser (B) hydratisiert Faser von VV Messungen bei unterschiedlichen Winkel zur Faserachse θ in Grad. Ein Spektrum von reinem destilliertem Wasser wird ebenfalls gezeigt. Die Spektren wurden auf die Intensität (Höhe) des Schütt peak normalisiert. Etiketten B und PS bezeichnen Peaks in Bezug auf Masse und parallel zu Oberfläche Modi, respectively. Fehlerbalken zeigen den Standardfehler (Quadratwurzel Anzahl der Zählungen). Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen. Abbildung 3. Brillouin – Spektrum von trockenem Trypsin-gereinigten Kollagen Typ I – Fasern aus Rattenschwanzsehnen. Spektrum aus einer VH – Messung bei θ = 30 °. Etiketten T, PS und B bezeichnen Peaks bezogen auf Quer-, parallel zur Oberfläche und Bulk-Modi, respectively. Die Ergebnisse der Fit-Analyse einen gedämpften harmonischen Oszillator (DHO) Modell für beide T und PS-Modi sind ebenfalls dargestellt. Fehlerbalken zeigen den Standardfehler (Quadratwurzel Anzahl von Zählungen)./54648fig3large.jpg "Target =" _ blank "> Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. Abbildung 4. Auftragung der Schallwellengeschwindigkeit in trockenen Trypsin-gereinigten Kollagens vs Winkel zur Faserachse. Längs- und Querschallwellengeschwindigkeiten von trockenen Kollagenfaser aus fit Analyse der Brillouin – Peaks abgeleitet. Die Daten werden zu einem Modell aus hexagonal symmetrischen elastischer Feststoff ausgestattet. Rote Linie: Gleichung A1 (R 2 = 0,99); blaue Linie: Gleichung A2 (R 2 = 0,36). Fehlerbalken zeigen die Standardfehler aus der Quadratwurzel der Diagonalelemente der Kovarianzmatrix erhalten , nachdem ein Levenberg-Marquardt nicht – lineare Anpassung der kleinsten Quadrate Brillouin – Spektren. Bitte klicken Sie hier um eine größere versi anzuzeigen auf dieser Figur. Abbildung 5. Plot der Längsschallwellengeschwindigkeit in nassen Trypsin-gereinigten Kollagens vs Winkel zur Faserachse. Longitudinal Schallwellengeschwindigkeit von hydriertem Kollagenfaser aus fit Analyse der Brillouin – Peaks abgeleitet. Die Zeile ist ein Leitfaden für das Auge und gibt den Mittelwert der Schallwellengeschwindigkeit in diesem Bereich. Fehlerbalken zeigen die Standardfehler aus der Quadratwurzel der Diagonalelemente der Kovarianzmatrix erhalten , nachdem ein Levenberg-Marquardt nicht – lineare Anpassung der kleinsten Quadrate Brillouin – Spektren. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen. jpg "/> Abbildung 6. Brillouin – Spektren von Elastin – Fasern aus Rindernackenband. Spectra von trockenen und hydrierten Faser bei θ = 0 °. Die Spektren wurden auf die Intensität (Höhe) des Schütt peak normalisiert. Etiketten B und PS bezeichnen Peaks in Bezug auf Masse und parallel zu Oberfläche Modi, respectively. B F und B W beziehen sich auf die Masse Spitzen der Faser bzw. Wasser. Fehlerbalken zeigen den Standardfehler (Quadratwurzel Anzahl der Zählungen). Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen. Abbildung 7. Plot der Längsschallwellengeschwindigkeit in trockenen Elastin vs Winkel zur Faserachse. Longitudinal Schallwellengeschwindigkeit von trockenem Elastin fiber von Fit-Analyse der Brillouin-Peaks abgeleitet. Die Daten werden zu einem Modell aus hexagonal symmetrischen elastischer Feststoff ausgestattet. Rote Linie: Gleichung A1 9 (R 2 = 0,74). Fehlerbalken zeigen die Standardfehler aus der Quadratwurzel der Diagonalelemente der Kovarianzmatrix erhalten , nachdem ein Levenberg-Marquardt nicht – lineare Anpassung der kleinsten Quadrate Brillouin – Spektren. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen. Figur SI-1. Schematische Darstellung des Brillouin – Set-up und BLS Streugeometrie. (A) Das Licht , von einem Festkörperlaser emittiert wird , auf die Probe durch eine achromatische Linse geschickt. Das Licht, das von akustischen Volumen Phononen gestreut und durch die aus refl resultierendenection von Licht an der Substratoberfläche, die in Kontakt mit der Probe ist, wird durch die Linse gesammelt, gefiltert durch ein Tandem-Multi Fabry-Perot-Interferometer und durch einen Photomultiplier detektiert. FP1 und FP2 zeigen die beiden Interferometern das Tandem Set-up bildet. Ein Polarisator wählt die Polarisation des einfallenden Lichts, und ein Analysator verwendet wird, um die Polarisation des gestreuten Lichts auszuwählen. (B) BLS Geometrie mit einer Probe in Kontakt mit der Oberfläche eines reflektierenden Siliziumsubstrat. Ein Glasobjektträger (nicht gezeigt) ist oberhalb der Probe angeordnet, um die Kammer abzudichten, und mit leichtem Druck an den Ecken des Substrats durch pads aufgetragen. Das einfallende Licht (k i) durch die Linse, an der Luft-Proben – Grenzfläche gebrochen wird (k 'i) und konzentrierte sich auf die Probe-Substrat – Grenzfläche. Das gestreute Licht durch die gleiche Linse gesammelt (k 's) ergibt sich aus der Interaktion mit den beiden Bulk – Phononen (qb) und die Reisen PS der Probe (q n). . Winkel zwischen den Richtungen des Lichts und der Normalen zu der Oberfläche als Φ und Φ 'bezeichnet (C) Schematische Darstellung der Probe und des angenommenen Koordinatensystems; z definiert die außerordentliche Achse parallel zur Richtung der Fasern. Winkel θ und α sind die zwischen der Richtung der Phononen q s und q b zu der z -Achse bzw. k i, k 'i, k s, k' s:. Wellenzahlen von dem einfallenden und gestreuten Licht; q b, q s, Wellenvektoren der Masse und PS – Modi sind. (Nachdruck aus Lit. 9.) Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen. <pclass = "jove_content" fo: keep-mit-next.within-page = "always"> Tabelle 1 Elastic Tensorkoeffizienten abgeleitet von Fit – Analyse der akustischen Wellengeschwindigkeiten Elastic Tensorkoeffizienten trockenem Trypsin-gereinigten Typ – I – Fasern Kollagen (. diese Arbeit) und Elastin-Fasern (ref 9). Sample Elastizitätskoeffizienten (GPa) trypsinverdauten Kollagen c 33 18,7 ± 0,1 c 11 14,4 ± 0,2 c 44 3,4 ± 0,1 c 12 7,2 ± 0,2 c 13 11,2 ± 0,3 Elastin c 33 11,5 ± 0,2 c 11 10,4 ± 0,1 c 44 1,9 ± 0,2 c 12 6,6 ± 0,2 c 13 6,8 ± 0,3