Çok elektrot dizilerde Spiral Ganglion Nöron Eksplantasyon Kültür ve Elektrofizyoloji
Summary
We present a protocol to culture primary murine spiral ganglion neuron explants on multi electrode arrays to study neuronal response profiles and optimize stimulation parameters. Such studies aim to improve the neuron-electrode interface of cochlear implants to benefit hearing in patients as well as the energy consumption of the device.
Abstract
Spiral ganglion neurons (SGNs) participate in the physiological process of hearing by relaying signals from sensory hair cells to the cochlear nucleus in the brain stem. Loss of hair cells is a major cause of sensory hearing loss. Prosthetic devices such as cochlear implants function by bypassing lost hair cells and directly stimulating SGNs electrically, allowing for restoration of hearing in deaf patients. The performance of these devices depends on the functionality of SGNs, the implantation procedure and on the distance between the electrodes and the auditory neurons.
We hypothesized, that reducing the distance between the SGNs and the electrode array of the implant would allow for improved stimulation and frequency resolution, with the best results in a gapless position. Currently we lack in vitro culture systems to study, modify and optimize the interaction between auditory neurons and electrode arrays and characterize their electrophysiological response. To address these issues, we developed an in vitro bioassay using SGN cultures on a planar multi electrode array (MEA). With this method we were able to perform extracellular recording of the basal and electrically induced activity of a population of spiral ganglion neurons. We were also able to optimize stimulation protocols and analyze the response to electrical stimuli as a function of the electrode distance. This platform could also be used to optimize electrode features such as surface coatings.
Introduction
In accordance with the World Health Organization, 360 million people worldwide suffer from hearing loss with profound consequences on professional and private life. Hearing aids can restore sensory function in moderate forms of hearing loss; however, for the most severe cases, the most effective treatment option is a prosthetic device called a cochlear implant (CI). CIs contain a linear electrode array of up to 24 electrodes, which is surgically inserted into the scala tympani of the cochlea. The electrodes directly stimulate the spiral ganglion neurons, forming the auditory nerve 1.
With more than 300,000 devices implanted worldwide, CIs are very successful medical implants and rank among the most cost-effective procedure ever reported. Despite its success the cochlear implant still has limitations such as reduced frequency resolution compared to physiological hearing. This can lead to deficits in effective communication in groups or noisy environments, and the ability to decipher very complex sounds such as music. This reduced frequency resolution is likely due to the gap between the CI electrodes and the spiral ganglion neurons, leading to stimulation of large groups of neurons. This gap is in the range of hundreds of micrometers 2,3. Elimination of this gap would facilitate the stimulation of smaller groups of neurons per electrode, thereby increasing frequency resolution and overall performance of the device 4.
To study the influence of the gap between the electrode and the neuron and the effect of various optimized stimulation protocols, we have developed an in vitro bioassay based on a non-invasive electrophysiological characterization of SGNs on multi electrode arrays (MEAs) 5. Additionally, MEAs can be easily modified to vary electrode shape, size, material and surface roughness, to optimize the neuron-electrode interface. The following is a step-by-step protocol to reproducibly obtain recordings from murine spiral ganglion neuron cultures and assess the dependency on the above-mentioned parameters.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada açıklanan protokol nasıl MEA kültür SGN eksplantlar ve hücre dışı girişimsel olmayan kayıtları ile SGN aktivitesini değerlendirmek gösterir. Bu platform ve biz son zamanlarda koklear implant ve diğer nöro-protez uygulanmasına ilişkin potansiyel ilgi ile SGN etkinleştirmek için azaltılmış enerji gereksinimleri ile sonuçlanan yeni stimülasyon protokolleri ve elektrot malzemelerinin belirlenmesi için izin 5 geliştirdik protokol. sunulan prosedürde bazı önlemler doğru ve tekrarlanabilir deneyler başarı için esastır.
spiral ganglion ve primer doku daha fazla taşıma dikkatli diseksiyon özellikle dikkat gerektirir. Bu deneyler, 5 ile 7 gün arasında C57 / BL6 fareleri kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Benzer sonuçlar aynı yaş grubundaki Wistar sıçanları kullanılarak elde edilmiştir (veriler gösterilmemiştir). Biz koklear kemik tr hala yumuşak olduğu gibi bu ince diseksiyon için en iyi yaş olduğunu düşünüyorumough kolay forseps ile çıkarılması ve Corti spiral ganglion ve org için kolayca dendrit süreçleri veya SGN Somas zarar vermeden ayrılabilir. önceki yaşlarda doku çok yumuşak ve daha sonraki aşamalarda, koklea kemik kapsülün sertleşmesi diseksiyon sırasında doku zarar riskini artırırken Corti organı, yüksek olan şansı somas birlikte SGN rip. SG Uygun izolasyon yanı sıra eksplant dikkatli kesim önemlidir. boyutunda 200-500 um MEA yüzeye bağlanmak en üst düzeye çıkarmak ve nevritler tekrar çıkar olan eksplantlar, SG mis yeterli sayıda olması ve bu aralıkta olmalıdır. Kültürün ilk günlerinde nörotrofik desteğini arttırmak için, taze BDNF günlük eklenir ve Corti organı ko-kültür yerleştirilir.
Diseksiyon hızı önemlidir. Tüm adımlar, doku bozulmasını en aza indirmek için hızlı ve buz çözeltiler kullanılarak yapılmalıdır.ötanazi ve MEA eksplant yerleştirerek arasındaki zaman 10-15 dakika arasında olması ve başarılı kültürleri için çok önemlidir olmalıdır. kültür kaplama gecikmeleri önlemek için, tüm araçlar hazır.
ince diseksiyon, kültür bakım ve orta ve donanım hazırlanmasına dahil olmak üzere tüm adımları, steril koşullar altında gerçekleştirilir. ECM çözeltisi ile MEA kaplanması zaman buz üzerinde erimesine ve daha yüksek sıcaklıklarda ECM karışımı jeller buz soğukluğunda pipet uçları ve buz gibi soğuk bir ortam kullanılması önemlidir. ÇÇA üzerinde eksplantlar yerleştirirken, ilk sonradan eksplantlar yerleştirin elektrot alanlarına orta ekleyin. ortamı, ikinci bir aşamada eklenirse, eksplantlar MEA nedeniyle yırtılma gücüne ayırmak eğilimindedir. orta, küçük miktarlar ilk 5 gün kültüre uygulandığı için, kültür ortamı buharlaştırılması en aza indirilmesi gerekir. Nedenle son derece yakın Proxim içinde PBS içeren küçük petri kaplarına kullanarak nemlendirilmiş odasına oluşturmak için tavsiye edilirÇÇA için Sığ.
Burada tarif edilen deneyler özel elektrot boyutları, kaplama malzemeleri ve intra elektrot mesafesi (alanına 2'de tarif edildiği gibi, Not) ile ticari olarak temin edilebilir MEA elektrotlar kullanılarak yapıldı. kültür koşulları belirli elektrot ızgara tasarımı nöronal kapsama maksimize etmek için buraya optimize edilmiştir. Elektrot aralığı, geometri ve yüzey diğer düzenlemeler farklı kaplamalar ya da hücre yoğunlukları gerektirebilir mümkündür. Bu adımlar, yüksek yoğunluklu kültürleri elde etmek için, ilk sorun gerektirebilir.
Kültür oda sıcaklığında hücre dışı çözeltiye, 37 ° C'de kültür ortamından transfer kayıtları başlamadan önce, elektrofizyolojik kayıtları ile ilgili olarak. kararsız kayıtları önlemek için, kültür stabilize sağlamak için yaklaşık 10 dakika boyunca bekleyin. kültür uyarma olduğunda, özel dikkat uyaran seçiminde kullanılmalıdırgibi büyük genlikleri (> 3 V) ve süreleri kültürüne zarar verebilir. Uyarım darbe şekilleri ve süresi ile ilgili bir başvuru için, başvuru 5'e bakın.
Veri toplama ve işleme, ev yapımı donanım (kayıt odasına amplifikatörler ve amplifikatörler bağlantıları) için (Malzeme Tablosu gelin 7) kullanılmış ve spesifik analiz programları seçildi. Ancak, diğer ticari MEA kurulumları ve diğer yazılım paketleri bu işlemler için de uygundur. Daha önce 3 farklı zaman noktalarında eden kültürler tepkileri değerlendirildi ve uzun süreli, kültür süresi 5, artan bir aktivite göstermiştir. Burada kayıtları için in vitro 18 gün öneririz. Steril, nemli odalarında sürekli kayıtlar için izin MEA sistemleri, her kültür türü için en uygun zaman noktalarının belirlenmesini kolaylaştırabilir.
Bu biyoassay önemli bir dezavantajı t yüksek varyasyonUyarıya yanıtları göstermek kültür başına elektrot o numara. uyarıma tepkilerin Bu oran temel olarak dört faktöre bağlıdır: kültürdeki neurites yoğunluğu, neurites ve elektrotlar, neurites veya neurites demetleri çapı ve elektrotların empedansı arasındaki temaslar. nörit yoğunluk ile ilgili olarak, en az iki elektrot üzerinde büyüyebilir yalnızca nevritler stimülasyon deneyleri için de kullanılabilir. nöritlerin ve elektrotlar arasındaki iletişim bir yandan elektrot nevritlerin izole ve böylece diğer taraftan temas kötüye veya nöritler ve çevresindeki banyosundan elektrot izole etmek ve bu şekilde artırabilir çevreleyen doku bağlıdır iletişim. Doku yoğunluğu, hem de nörit büyüklüğü, kullanılan çıkarılması ve kültür koşulları ile tanımlanır. Ayrışmış nöronal kültürler de başarılı bir şekilde test edilmiş, ancak, bu kültürlerde nöronal yoğunluğu reco azaltılmış sayıda yol, çok daha düşüktür edilmiştirrding elektrotlar. Bu nedenle hücre kültürü ele alınacak belirli bilimsel soruya adapte edilmelidir.
Son olarak, elektrot impedansı başlıca boyutu ve elektrot yüzeyine verilir. Malzeme, Şekil 3'te de gösterildiği gibi, aynı zamanda elektrot ve nöritlere 7-9 arasındaki bağlantıyı iyileştirebilir elektrot empedansı azaltılması, örneğin siyah platinyum gibi geniş bir yüzey yaratır.
Stimülasyon başarı oranını artırmak için stratejiler nedenle kültür şartlarının optimizasyonu, toplam elektrotlar veya elektrotlar yoğunluğu sayısının artışı ve elektrot yüzeyine 10 modülasyonu içerir.
Şimdiye kadar, SG nöronlannm elektrofizyolojik karakterizasyon bağlantı klemp tekniği kullanılarak gerçekleştirilmiştir edilmiştir. Bu eylem potansiyellerinin hücre içi kayıtları ve hücre içi iyonik akımların detaylı analiz için izin verirTek nöronlar. Burada aynı zamanda bir çok nöronların hücre dışı uyarım kendiliğinden aktivitesini veya yanıtları analiz spiral ganglion nöronlarının aktivitesi profilleri incelemek için kullanılabilecek bir in vitro biyolojik tayini sunulmuştur. Ayrıca, elektrot ve spiral ganglion nöronları arasındaki etkileşim okudu ve modifiye edilmiş veya yeni malzemelerin uygulama tarafından optimize edilebilir. En son uyarıcı elektrot ve Kültür aktivitesi mesafesi arasındaki ilişkiyi incelemek üzere, grubumuz 5 ile gösterildiği gibi Son olarak, burada gösterilmemiş olan bile, bu platform bir dış elektrot ile bir arada kullanılabilir, bir mikromanipülatör monte edilebilir. koklear implant elektrotlar temel özellikleri taklit ederek yeni protez tasarımı yol açabilir için tüm bu yeni yönleri izin verir.
Bizim modelimiz işitsel nöronlar ve ileri op uyarılması etkinliğini artırmak için stratejiler araştırmak için in vitro aracında bir çok yararlıetkisinin optimize CI teknolojisi. teknik hakim sonra, tek bir değişken bir dizi değişiklik için tarama öngörülüyor: a) farklı nöron popülasyonu, B) farklı bir diğer elektrot malzemeleri / boyut / empedans c) Önemli toksisite ya da elektrot stimülasyonu kaynaklı toksisitesini test etmek amacıyla, kronik deneyler, burada in vivo elektrot dizileri tarafından güvenli ve daha etkili stimülasyon protokolleri ışık tutabilir.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar deneylerle değerli teknik yardım için Bern, İsviçre Üniversitesi Fizyoloji Anabilim Dalı'nda Ruth ruble teşekkür ederim. Bu çalışma, AB-FP7-NMP programı (.; – Www.nanoci.org proje NANOCI hibe anlaşmasında no 281056) tarafından kısmen desteklenmiştir.
Materials
| culture medium | |||
| Neurobasal medium | Invitrogen | 21103-049 | 24 ml (for 25 ml) |
| HEPES | Invitrogen | 15630-080 | 250 μl (for 25 ml) |
| Glutamax | Invitrogen | 35050-061 | 250 μl (for 25 ml) |
| B27 | Invitrogen | 17504-044 | 500 μl (for 25 ml) |
| FBS | GIBCO | 10099-141 | 10% (for 25 ml) |
| BDNF | R&D Systems | 248-BD-025/CF | final 5 ng/ml (for 25 ml) |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| extracellular solution (pH 7.4) | |||
| NaCl | 145mM | ||
| KCl | 4mM | ||
| MgCl2 | 1mM | ||
| CaCl2 | 2mM | ||
| HEPES | 5mM | ||
| Na-pyruvate | 2mM | ||
| Glucose | 5mM | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| blocking solution | |||
| PBS | Invitrogen | 10010023 | |
| BSA | Sigma | A4503-50G | 2% |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | 0.01% |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Immunostaining solutions | |||
| TuJ | R&D Systems | MAB1195 | dil 1:200 |
| DAPI | Sigma | D9542 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | 4% |
| Fluoreshild | Sigma | F6057 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| plastic/tools | |||
| petri dish 35 mm | Huberlab | 7.627 102 | |
| petri dish 94 mm | Huberlab | 7.633 180 | |
| Dumont #5 tweezer | WPI | 14098 | |
| Dumont #55 tweezer | WPI | 14099 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| Enzymatic solution: Terg-a-Zyme | Sigma | Z273287-11KG | |
| Extracellular Matrix (ECM) mix: Matrigel TM | Corning | 356230 | |
| MEA electrodes | Qwane Biosciences | (Lausanne, Switzerland) | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Labview | National Instruments | Switzerland | |
| IgorPro | WaveMetrics | Lake Oswega, USA |
References
- O’Donoghue, G. Cochlear implants–science, serendipity, and success. N Engl J Med. 369 (13), 1190-1193 (2013).
- Shepherd, R. K., Hatsushika, S., Clark, G. M. Electrical stimulation of the auditory nerve: the effect of electrode position on neural excitation. Hear Res. 66 (1), 108-120 (1993).
- Tykocinski, M., et al. Comparison of electrode position in the human cochlea using various perimodiolar electrode arrays. Am J Otol. 21 (2), 205-211 (2000).
- Wilson, B. S., Dorman, M. F. Cochlear implants: current designs and future possibilities. J Rehabil Res Dev. 45 (5), 695-730 (2008).
- Hahnewald, S., et al. Response profiles of murine spiral ganglion neurons on multi-electrode arrays. J. Neural Eng. 13, (2015).
- Tscherter, A., Heuschkel, M. O., Renaud, P., Streit, J. Spatiotemporal characterization of rhythmic activity in rat spinal cord slice cultures. Eur J Neurosci. 14 (2), 179-190 (2001).
- Heim, M., Yvert, B., Kuhn, A. Nanostructuration strategies to enhance microelectrode array (MEA) performance for neuronal recording and stimulation. J Physiol Paris. 106 (3-4), 137-145 (2012).
- Kim, R., Nam, Y. Novel platinum black electroplating technique improving mechanical stability. Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc. , 184-187 (2013).
- Cellot, G., et al. Carbon nanotubes might improve neuronal performance by favouring electrical shortcuts. Nat Nanotechnol. 4 (2), 126-133 (2009).
- Spira, M. E., Hai, A. Multi-electrode array technologies for neuroscience and cardiology. Nat Nano. 8 (2), 83-94 (2013).
