دوامة العقدة العصبية يزدرع الثقافة والكهربية على موضوع الكهربائي صفائف
Summary
We present a protocol to culture primary murine spiral ganglion neuron explants on multi electrode arrays to study neuronal response profiles and optimize stimulation parameters. Such studies aim to improve the neuron-electrode interface of cochlear implants to benefit hearing in patients as well as the energy consumption of the device.
Abstract
Spiral ganglion neurons (SGNs) participate in the physiological process of hearing by relaying signals from sensory hair cells to the cochlear nucleus in the brain stem. Loss of hair cells is a major cause of sensory hearing loss. Prosthetic devices such as cochlear implants function by bypassing lost hair cells and directly stimulating SGNs electrically, allowing for restoration of hearing in deaf patients. The performance of these devices depends on the functionality of SGNs, the implantation procedure and on the distance between the electrodes and the auditory neurons.
We hypothesized, that reducing the distance between the SGNs and the electrode array of the implant would allow for improved stimulation and frequency resolution, with the best results in a gapless position. Currently we lack in vitro culture systems to study, modify and optimize the interaction between auditory neurons and electrode arrays and characterize their electrophysiological response. To address these issues, we developed an in vitro bioassay using SGN cultures on a planar multi electrode array (MEA). With this method we were able to perform extracellular recording of the basal and electrically induced activity of a population of spiral ganglion neurons. We were also able to optimize stimulation protocols and analyze the response to electrical stimuli as a function of the electrode distance. This platform could also be used to optimize electrode features such as surface coatings.
Introduction
In accordance with the World Health Organization, 360 million people worldwide suffer from hearing loss with profound consequences on professional and private life. Hearing aids can restore sensory function in moderate forms of hearing loss; however, for the most severe cases, the most effective treatment option is a prosthetic device called a cochlear implant (CI). CIs contain a linear electrode array of up to 24 electrodes, which is surgically inserted into the scala tympani of the cochlea. The electrodes directly stimulate the spiral ganglion neurons, forming the auditory nerve 1.
With more than 300,000 devices implanted worldwide, CIs are very successful medical implants and rank among the most cost-effective procedure ever reported. Despite its success the cochlear implant still has limitations such as reduced frequency resolution compared to physiological hearing. This can lead to deficits in effective communication in groups or noisy environments, and the ability to decipher very complex sounds such as music. This reduced frequency resolution is likely due to the gap between the CI electrodes and the spiral ganglion neurons, leading to stimulation of large groups of neurons. This gap is in the range of hundreds of micrometers 2,3. Elimination of this gap would facilitate the stimulation of smaller groups of neurons per electrode, thereby increasing frequency resolution and overall performance of the device 4.
To study the influence of the gap between the electrode and the neuron and the effect of various optimized stimulation protocols, we have developed an in vitro bioassay based on a non-invasive electrophysiological characterization of SGNs on multi electrode arrays (MEAs) 5. Additionally, MEAs can be easily modified to vary electrode shape, size, material and surface roughness, to optimize the neuron-electrode interface. The following is a step-by-step protocol to reproducibly obtain recordings from murine spiral ganglion neuron cultures and assess the dependency on the above-mentioned parameters.
Protocol
Representative Results
Discussion
بروتوكول الموصوفة هنا يوضح كيفية الثقافة إإكسبلنتس SGN على الشرق الأوسط وأفريقيا وتقييم النشاط SGN من التسجيلات خارج الخلية غير الغازية. هذا النظام الأساسي والبروتوكول وضعنا مؤخرا 5 سماح لتحديد بروتوكولات التحفيز الجديدة والمواد الكهربائي مما أدى إلى انخفاض احتياجات الطاقة لتنشيط SGN، باهتمام المحتملة لمواصلة تنفيذ زراعة قوقعة الأذن وغيرها من الأطراف الاصطناعية العصبية. عدة احتياطات في إجراء قدمت أساسية لإنجاز تجارب دقيقة وقابلة للتكرار.
تشريح دقيق من العقدة الحلزونية ومزيد من التعامل مع الأنسجة الابتدائية يتطلب الحذر بشكل خاص. وقد أجريت هذه التجارب باستخدام الفئران C57 / BL6 بين 5 و 7 أيام القديمة. وتم الحصول على نتائج مماثلة باستخدام فئران ويستار في نفس الفئة العمرية، (لا تظهر البيانات). ونحن نعتقد أن هذا هو أفضل سن للتشريح على ما يرام كما عظم قوقعة لا تزال لينة أونough لسهولة إزالة بواسطة ملقط، والعقدة الحلزونية وجهاز كورتي يمكن فصلها بسهولة دون تمزيق عمليات تغصناته أو SGN somas. في أعمار مبكرة أنسجة لينة جدا وفرص لمزق SGN somas جنبا إلى جنب مع جهاز كورتي هو أعلى، بينما في مراحل لاحقة، وتصلب كبسولة العظمية من القوقعة يزيد من خطر تلف الأنسجة أثناء تشريح. العزلة السليمة للسان جرمان وكذلك قطع دقيق للإإكسبلنتس أمر بالغ الأهمية. يجب أن تكون هذه في حدود 200-500 ميكرون في الحجم لزيادة التعلق على سطح الشرق الأوسط وأفريقيا وأن يكون عدد كاف من somas سان جرمان في إإكسبلنتس، والتي من neurites التي سوف تنمو. لزيادة دعم التغذية العصبية في الأيام الأولى للثقافة، يضاف عامل التغذية العصبية الطازجة يوميا ويتم وضع جهاز كورتي في الثقافة المشتركة.
سرعة تشريح مهمة أيضا. يجب أن يتم تنفيذ جميع الخطوات بسرعة وباستخدام حلول الباردة الجليد من أجل تقليل تدهور الأنسجة. الوينبغي أن يكون الوقت بين القتل الرحيم ووضع يزدرع في الشرق الأوسط وأفريقيا بين 10-15 دقيقة وحاسمة للثقافات ناجحة. لدينا جميع الأدوات جاهزة، لتجنب التأخير في الطلاء الثقافة.
يتم تنفيذ جميع الخطوات، بما في ذلك تشريح ما يرام، والحفاظ على الثقافة وإعداد المتوسطة والمعدات تحت ظروف معقمة. عندما طلاء الشرق الأوسط وأفريقيا مع الحل ECM من المهم أن ذوبان الجليد على الجليد، واستخدام نصائح ماصة المثلج والمتوسطة الجليد الباردة مثل الهلام مزيج ECM عند ارتفاع درجات الحرارة. عند وضع إإكسبلنتس على الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف، أولا إضافة المتوسطة للمناطق القطب، بعد ذلك وضع إإكسبلنتس. إذا تم إضافة المتوسطة في الخطوة الثانية، إإكسبلنتس تميل إلى فصل من الشرق الأوسط وأفريقيا بسبب القص الإجهاد. لأنه يتم تطبيق كميات صغيرة من متوسطة إلى ثقافة في أول 5 أيام، تبخر مستنبت أن يكون الحد الأدنى. لذلك فإنه ينصح بشدة إلى إنشاء غرفة ترطيب باستخدام أطباق بتري صغيرة تحتوي على برنامج تلفزيوني في بروكسيم وثيقإيتي إلى الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف.
وأجريت التجارب وصفها هنا باستخدام أقطاب الشرق الأوسط وأفريقيا المتاحة تجاريا مع أبعاد محددة القطب، مواد الطلاء والمسافة الكهربائي داخل (كما هو موضح في النقطة 2، ملاحظة). وقد تم تحسين ظروف التربية هنا من أجل تحقيق أقصى قدر من التغطية العصبية للتصميم معين القطب الشبكة. فمن الممكن أن تكوينات أخرى من القطب التباعد، وهندستها والسطوح قد تتطلب طبقات مختلفة أو كثافة الخلية. قد تتطلب هذه الخطوات استكشاف الأخطاء وإصلاحها الأولي من أجل تحقيق الثقافات ذات الكثافة السكانية العالية.
وفيما يتعلق التسجيلات الكهربية، قبل بدء التسجيلات يتم نقل الثقافة من ثقافة المتوسط عند 37 درجة مئوية إلى حل خارج الخلية في RT. من أجل تجنب التسجيلات غير مستقرة، وانتظر حوالي 10 دقيقة للسماح للثقافة لتحقيق الاستقرار. عندما تحفيز ثقافة، ينبغي توخي الحذر بشكل خاص في اختيار التحفيزسعة كبيرة كما (> 3 V) والمدد قد يسبب الضرر للثقافة. للإشارة بشأن الأشكال نبض التحفيز ومدة أنظر المرجع 5.
للحصول على البيانات وتجهيز المعدات محلية الصنع (غرفة تسجيل، وصلات إلى مكبرات الصوت ومكبرات الصوت) استخدمت وتم اختيار برامج تحليل محددة (انظر المواد جدول، أشر 7). ومع ذلك، هي مناسبة أخرى الاجهزة الشرق الأوسط وأفريقيا التجاري وحزم البرامج الأخرى فضلا عن هذه العمليات. لقد سبق بتقييم ردود ثقافاتنا في 3 نقاط زمنية مختلفة، وأظهرت نشاطا متزايدا مع مرور الوقت ثقافة مطولة 5. نحن هنا نقترح 18 يوما في المختبر للتسجيلات. أنظمة الشرق الأوسط وأفريقيا والسماح للتسجيلات مستمرة في العقيمة، وغرف مرطب، يمكن أن يسهل تحديد نقاط الوقت الأمثل لكل نوع من أنواع الثقافة.
والعيب الرئيسي لهذا الأحيائي هو التباين الكبير في تيكان عدد من الأقطاب الكهربائية في الثقافة التي تظهر الردود على التحفيز. هذا المعدل من الردود على التحفيز يعتمد بشكل رئيسي على أربعة عوامل: كثافة neurites التي في الثقافة، والاتصالات بين neurites التي والأقطاب، وقطره من neurites التي أو حزم neurites التي ومقاومة الأقطاب. وفيما يتعلق كثافة على neurite، فقط neurites التي تنمو على اثنين على الأقل من الأقطاب الكهربائية يمكن أن تستخدم للتجارب التحفيز. الاتصال بين neurites التي وأقطاب يعتمد على الأنسجة المحيطة التي يمكن من ناحية عزل neurites التي من القطب، وبالتالي تفاقم الاتصال، أو، من ناحية أخرى، عزل neurites التي والقطب من حمام المحيطة بها، وبالتالي تحسين الاتصال. كثافة الأنسجة، وكذلك حجم محوار، تم تعريفها من قبل يزدرع المستخدمة وظروف التربية. كما تم اختبارها الثقافات العصبية فصلها بنجاح ولكن كثافة الخلايا العصبية في هذه الثقافات هي أقل بكثير، مما أدى إلى انخفاض عدد ريكوأقطاب rding. ولذلك ينبغي أن تتكيف ثقافة الخلية إلى مسألة علمية محددة لمعالجتها.
وأخيرا، ونظرا للمقاومة من الأقطاب أساسا من حجم وسطح الأقطاب. المواد، وخلق سطح كبير مثل البلاتين الأسود، كما هو مبين في الشكل (3)، وخفض مقاومة الأقطاب يمكن أيضا تحسين اقتران بين الأقطاب وneurites التي 7-9.
ولذلك تتضمن استراتيجيات لتحسين معدل النجاح من التحفيز وتعظيم الاستفادة من الظروف والثقافة، وزيادة في العدد الإجمالي للأقطاب أو كثافة الأقطاب وتعديل من سطح القطب 10.
حتى الآن، وتوصيف الكهربية للخلايا العصبية سان جرمان قد أجريت باستخدام تقنيات المشبك التصحيح. وهذا يسمح للتسجيلات داخل الخلايا من إمكانات العمل وتحليل مفصل من التيارات الأيونية داخل الخلايا منالخلايا العصبية واحدة. هنا نقدم على الأحيائي في المختبر والتي يمكن استخدامها لدراسة ملامح نشاط الخلايا العصبية العقدية الحلزونية عن طريق تحليل النشاط العفوي أو ردود لتحفيز الخلية من العديد من الخلايا العصبية في وقت واحد. بالإضافة إلى ذلك، والتفاعل بين القطب والخلايا العصبية العقدية الحلزونية يمكن دراستها والأمثل من خلال تطبيق المواد المعدلة أو الجديدة. وأخيرا، حتى لو لم يكن هو موضح هنا، هذه المنصة يمكن استخدامها في تركيبة مع القطب الخارجي، التي شنت على micromanipulator كما هو مبين في الآونة الأخيرة من قبل مجموعتنا 5، من أجل دراسة العلاقة بين المسافة من تحفيز الكهربائي والثقافة النشاط. كل هذه الجوانب جديدة تسمح للمحاكاة من السمات الرئيسية من الأقطاب الكهربائية زرع قوقعة الأذن قد يؤدي إلى تصميم الأجهزة التعويضية الجديدة.
نموذجنا هو مفيد جدا في أداة المختبر للتحقيق استراتيجيات لتحسين فعالية تحفيز الخلايا العصبية السمعية ومزيد من المرجعتكنولوجيا CI timize. بمجرد يتقن هذه التقنية، يمكن للمرء أن يتصور فحص لتعديل عدد من المتغيرات: أ) مختلف السكان العصبية، ب) مواد مختلفة القطب / الحجم / ممانعات ج) أداء التجارب المزمنة لاختبار سمية سمية المواد أو القطب التحفيز التي يسببها، والتي يمكن تسليط الضوء على بروتوكولات أكثر أمنا وأكثر فعالية التحفيز من قبل في الجسم الحي صفائف الكهربائي.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
الكتاب أشكر روث Rubli في قسم علم وظائف الأعضاء في جامعة برن، سويسرا للحصول على المساعدة الفنية القيمة مع التجارب. وأيد هذا العمل في جزء من برنامج الاتحاد الأوروبي FP7-NMP (اتفاقية منحة لا 281056، NANOCI المشروع – www.nanoci.org).
Materials
| culture medium | |||
| Neurobasal medium | Invitrogen | 21103-049 | 24 ml (for 25 ml) |
| HEPES | Invitrogen | 15630-080 | 250 μl (for 25 ml) |
| Glutamax | Invitrogen | 35050-061 | 250 μl (for 25 ml) |
| B27 | Invitrogen | 17504-044 | 500 μl (for 25 ml) |
| FBS | GIBCO | 10099-141 | 10% (for 25 ml) |
| BDNF | R&D Systems | 248-BD-025/CF | final 5 ng/ml (for 25 ml) |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| extracellular solution (pH 7.4) | |||
| NaCl | 145mM | ||
| KCl | 4mM | ||
| MgCl2 | 1mM | ||
| CaCl2 | 2mM | ||
| HEPES | 5mM | ||
| Na-pyruvate | 2mM | ||
| Glucose | 5mM | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| blocking solution | |||
| PBS | Invitrogen | 10010023 | |
| BSA | Sigma | A4503-50G | 2% |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | 0.01% |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Immunostaining solutions | |||
| TuJ | R&D Systems | MAB1195 | dil 1:200 |
| DAPI | Sigma | D9542 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | 4% |
| Fluoreshild | Sigma | F6057 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| plastic/tools | |||
| petri dish 35 mm | Huberlab | 7.627 102 | |
| petri dish 94 mm | Huberlab | 7.633 180 | |
| Dumont #5 tweezer | WPI | 14098 | |
| Dumont #55 tweezer | WPI | 14099 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| Enzymatic solution: Terg-a-Zyme | Sigma | Z273287-11KG | |
| Extracellular Matrix (ECM) mix: Matrigel TM | Corning | 356230 | |
| MEA electrodes | Qwane Biosciences | (Lausanne, Switzerland) | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Labview | National Instruments | Switzerland | |
| IgorPro | WaveMetrics | Lake Oswega, USA |
References
- O’Donoghue, G. Cochlear implants–science, serendipity, and success. N Engl J Med. 369 (13), 1190-1193 (2013).
- Shepherd, R. K., Hatsushika, S., Clark, G. M. Electrical stimulation of the auditory nerve: the effect of electrode position on neural excitation. Hear Res. 66 (1), 108-120 (1993).
- Tykocinski, M., et al. Comparison of electrode position in the human cochlea using various perimodiolar electrode arrays. Am J Otol. 21 (2), 205-211 (2000).
- Wilson, B. S., Dorman, M. F. Cochlear implants: current designs and future possibilities. J Rehabil Res Dev. 45 (5), 695-730 (2008).
- Hahnewald, S., et al. Response profiles of murine spiral ganglion neurons on multi-electrode arrays. J. Neural Eng. 13, (2015).
- Tscherter, A., Heuschkel, M. O., Renaud, P., Streit, J. Spatiotemporal characterization of rhythmic activity in rat spinal cord slice cultures. Eur J Neurosci. 14 (2), 179-190 (2001).
- Heim, M., Yvert, B., Kuhn, A. Nanostructuration strategies to enhance microelectrode array (MEA) performance for neuronal recording and stimulation. J Physiol Paris. 106 (3-4), 137-145 (2012).
- Kim, R., Nam, Y. Novel platinum black electroplating technique improving mechanical stability. Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc. , 184-187 (2013).
- Cellot, G., et al. Carbon nanotubes might improve neuronal performance by favouring electrical shortcuts. Nat Nanotechnol. 4 (2), 126-133 (2009).
- Spira, M. E., Hai, A. Multi-electrode array technologies for neuroscience and cardiology. Nat Nano. 8 (2), 83-94 (2013).
