Spiral Ganglion Neuron Explantation Culture et électrophysiologie sur multi-électrodes Arrays

Les soins et l'expérimentation a été réalisée en conformité avec les directives des autorités locales suisse (Amt für Landwirtschaft und Natur des Kantons Bern, Suisse). 1. Préparer des solutions pour l'expérimentation Préparer la solution de revêtement matrice extracellulaire (ECM) (voir Tableau des Matériaux, point 6): Thaw ECM mélange sur la glace. Diluer le mélange ECM 1:10 dans un milieu de culture de base (sans facteurs neurotrophiques ou de sérum bovin fœtal (FBS)) et de stocker sur la glace. Préparer le milieu de culture (voir Matériel de table, point 1): Préparer un stock de milieu Neurobasal ne contenant pas de FBS ou dérivé du cerveau facteur neurotrophique (BDNF). Supplémenter des milieux frais Neurobasal avec du FBS (10%) et le BDNF (5 ng / ml) juste avant l'addition à la culture cellulaire. Préparer la solution extracellulaire (voir Tableau des Matériaux, point 2). 2. Lavage et stérilisation des AME <p class = "jove_content"> NOTE: Les AME utilisés pour les expériences contiennent 68 électrodes disposées dans une grille rectangulaire (figure 1E). Chaque électrode a une taille de 40 x 40 um2 avec un espacement de 200 um de centre à centre. Les électrodes sont constituées de platine. Les électrodes sont connectées à des contacts correspondants d'un circuit constitué d'oxyde d'indium et d'étain. Ce circuit est isolée par une couche de 5 um de SU-8. Voir le tableau Matériel pour plus de détails sur le fournisseur. D'autres dispositions des AME peuvent convenir à ces expériences. Pour les nouveaux AME: Rincez-les en immergeant dans 70% d'éthanol pendant 30 secondes et se laver avec de l'eau distillée pendant 30 sec. Travailler dans une hotte à flux laminaire. Laissez le MEA sécher pendant 30 min dans une hotte à flux laminaire. Mettez chaque MEA dans une boîte de Petri stérile individuel (35 mm x 10 mm) et sceller avec du papier. Les AME peuvent être stockés jusqu'à utilisation. Pour AME occasion: Incuber les AME dans une boîte de Pétri (35 mm x 10 mm) contenant 1 ml de solut enzymatiqueion (voir tableau des matériaux, point 6) O / N sur un agitateur orbital à température ambiante pour éliminer la matière biologique. Puis continuer comme à l'étape 2.1. REMARQUE: Manipulez les AME avec précaution en utilisant une pince à bouts recouverts de caoutchouc. 3. Préparation des AME pour les expériences culturelles Retirer la feuille d'étanchéité et laisser la MEA dans la boîte de Pétri (35 mm x 10 mm) pour l'ensemble de l'expérience. Enduire les AME avec la solution préparée en 1.1: Utiliser un 200 pointe ul de pipette à froid (stocké à -20 ° C) à pipeter 50 pi de solution de revêtement à chaque MEA, couvrant toute la surface de l'électrode. Laisser meas manteau pendant 30 min à 1 heure à température ambiante. Retirer la solution de revêtement à l'aide d'une pipette. Appliquer 100 ul de milieu de culture supplémenté avec 10% de FBS et 5 ng / ml de BDNF et le laisser à la température ambiante jusqu'à ce que le placage du tissu. Placez 2 boîtes de Pétri contenant les AME enrobés dans une grande boîte de Pétri (94 mm x 16 mm) et ajouter une troisième petite boîte de Pétri contenant 1,5ml de tampon phosphate salin (PBS) pour l'humidification. REMARQUE: Ajout d'une petite boîte de Pétri (étape 3.5) contenant du PBS est essentiel pour minimiser considérablement l'évaporation du milieu de culture. 4. Spiral Ganglion Dissection NOTE: la dissection brute peut se faire en dehors de la hotte à flux laminaire (étape 4.1 à 4.4). Pour des conditions stériles fin de dissection (débit de la hotte laminaire) sont obligatoires (de l'étape 4.5). Euthanasier animaux (vieille souris 5-7 jours) par décapitation sans anesthésie préalable. Stériliser la tête par pulvérisation avec 70% d'éthanol. En tenant la tête, couper la connexion entre la peau et le crâne avec un ciseau pointu / pointu le long de la ligne sagittale. Couper le crâne sagittale et enlever le cerveau en utilisant des ciseaux pointus / contondants. Couper les os temporaux du crâne et de placer ceux dans une boîte de Pétri contenant une solution saline équilibrée de la glace froide stérile Hanks (HBSS). En utilisant une dissectiontion microscope, disséquer la bulle tympanique à l'aide de pinces fines et d'isoler l'oreille interne. Retirer l'os de la cochlée, en utilisant une pince fine. Retirez le ligament spiral et strie vasculaire (SV), ainsi que par la tenue avec une pince la partie basale de la ganglion spiral (SG) et la SV et dérouler lentement le SV de la base -à-apex Isoler l'organe de Corti (OC), le SG et la columelle (Figure 1A – C) Séparer l'OC du SG et modiolus en maintenant avec une pince la partie basale de la SG et le CO et le déroulement lentement le CO de la base à l'apex. Explants latérales Cut (200 à 500 um de diamètre) du ganglion spiral encore attachés à la columelle (figure 1D) à l' aide d' une pince et d' un micro scalpel. 5. Spiral Ganglion Explantation Culture sur les AME Placer deux explants ganglionnaires à côté des électrodes sur la MEA préparée précédemment avec 100 ul de milieu de culture. Placer l'organe de Corti d'environ 5 mm de la surface de l'électrode. Utiliser une pince pour épingler les explants et l'organe de Corti sur la MEA, tout en évitant d'endommager le tissu. Placez les AME avec précaution dans l'incubateur et la culture à 37 ° C et 5% de CO 2. Le lendemain, une inspection visuelle que les explants ont attaché à l'AEM. NOTE: Si explants n'a pas joint O / N, ils vont rarement faire au cours des prochains jours. Le CO est placé à côté de la culture pour le soutien trophique / neurotrophique. Ajouter 100 ul de milieu de culture contenant 10% de FBS et du BDNF par jour pendant 5 jours consécutifs. Au jour 6, ajouter 2 ml de milieu de culture contenant 10% de FBS et 5 ng / ml de BDNF et de la culture du tissu pendant une période supplémentaire de 13 jours. 6. électrophysiologiques Recordings à enquêter sur les activités à charge spontanée et l'électrode de stimulation Laver la culture de MEA avec extracellulaire afinrésolu- préparé à l'étape 1.3, à la température ambiante. Sécher les contacts avec un tissu et monter la MEA sur la configuration de la MEA. NOTE: Pour garder la culture humide pendant le montage, ajouter une petite goutte de solution extracellulaire à la culture. Ajouter 300 pi de solution extracellulaire et attendre 10 minutes avant l'enregistrement, pour permettre au système de se stabiliser. Enregistrer l'activité spontanée pendant 2 min de toutes les électrodes en appuyant sur la touche d'enregistrement du logiciel / acquérir et identifier des électrodes d'enregistrement. La stimulation de l' électrode MEA: Sélectionnez l'amplitude / durée / forme du stimulus sur le logiciel approprié et appliquer à plusieurs électrodes consécutivement comme décrit 13. Sélectionnez les électrodes à base de ceux présentant une activité spontanée (comme dans l'étape 6.4). Enregistrement à partir de toutes les électrodes restantes. Pour exclure artefact de stimulation, de stimuler de la même électrode 10 fois. Si la culture répond au moins 8 fois sur 10, on peut considérer commeréponse positive lors de la stimulation de l'électrode induite. Pour identifier le bruit de fond, appliquer tétrodotoxine (TTX) à la cultureat une concentration de 1 uM, pour bloquer les canaux et enregistrement sodiques voltage-dépendants pendant 2 min. Utilisez cette option pour effectuer une détection pic (7.1 et 7.2). Analyse 7. Données NOTE: L' analyse des données a été précédemment décrit en détail dans 6 et 5. Pour des détails sur les logiciels utilisés dans cette étude voir tableau des matériaux, point 7. En utilisant le logiciel approprié de détecter l'activité spontanée pour chaque électrode utilisant un détecteur basé sur les écarts-types et un discriminateur ultérieure. Cette procédure est décrite dans 6. Activité apparaît comme rapides transitoires de tension (<5 ms). Choisissez un seuil qui se traduit par aucune activité lors de l'analyse de la TTX traitée samples.Adapt la valeur seuil pour chaque expérience de discriminer entre les faux positive et détection de faux négatifs. Utilisation d'un logiciel approprié d' observer l'activité neuronale détectée de chaque électrode comme un complot tramé selon des procédures standard (voir Figure 2A – C). Déterminer et afficher l'activité totale du réseau en additionnant tous les événements détectés dans une fenêtre glissante de 10 msec, décalées par pas de 1 ms. Détecter l'activité induite par la stimulation par l'affichage des données brutes en utilisant un logiciel d'analyse approprié. Identifier les pointes simples déconnecté manuellement. Pics simples apparaissent transitoires de tension aussi rapide, survenant après l'artefact de stimulation (tête de flèche sur la figure 2F). Un exemple est représenté sur la figure 2E. En fonction de l'expérience, l' analyse du nombre d'électrodes ayant répondu, le seuil nécessaire pour obtenir une réponse, le nombre de potentiels d'action par des électrodes et d' autres paramètres d'intérêt 5. 8. Tissue Fixation et Immunohistochemistry NOTE: Le processus de coloration va détruire la MEA. Voir le tableau Matériel (point 4) pour les réactifs. Directement après l'enregistrement laver les cultures avec 37 ° C chaud PBS trois fois. Jeter le PBS et on applique paraformaldehyde à 4% (PFA) (dans du PBS), préchauffé à 37 ° C pendant 10 min. ATTENTION: PFA est toxique. Travailler dans une hotte chimique avec une protection appropriée et une solution de défausse selon les directives. Laver les cultures trois fois avec du PBS et on bloque avec 2% de sérum-albumine bovine (BSA) dans du PBS (0,01% de Triton-X100) pendant 2 heures. Ajouter le premier anticorps (anti-BIII tubuline, anticorps TUJ) dilué dans du PBS (2% de BSA et 0,01% de Triton-X100) et laisser O / N à 4 ° C. Laver la culture à trois reprises avec du PBS. NOTE: A partir de maintenant garder l'échantillon dans l'obscurité aussi souvent que possible pour réduire au minimum le blanchiment de l'anticorps marqué par fluorescence secondaire. Ajouter l'anticorps secondaire dilué dans du PBS (BSA 2% d'uned 0,01% de Triton-X100) et incuber pendant 2 heures à 1 à la température ambiante. Pour colorer les noyaux ajouter 1: 10,000 DAPI (1 mg / ml de bouillon) pendant 10 min. Laver trois fois avec PBS et monter les échantillons en arrière pour fines lamelles (24 x 50 mm 2) en utilisant un milieu de montage (voir tableau des matériaux, point 4). L'image en utilisant un microscope à fluorescence avec 5X et 20X grossissement.