Ganglio spirale Neuron Espianto cultura e Elettrofisiologia su Multi Electrode Array
Summary
We present a protocol to culture primary murine spiral ganglion neuron explants on multi electrode arrays to study neuronal response profiles and optimize stimulation parameters. Such studies aim to improve the neuron-electrode interface of cochlear implants to benefit hearing in patients as well as the energy consumption of the device.
Abstract
Spiral ganglion neurons (SGNs) participate in the physiological process of hearing by relaying signals from sensory hair cells to the cochlear nucleus in the brain stem. Loss of hair cells is a major cause of sensory hearing loss. Prosthetic devices such as cochlear implants function by bypassing lost hair cells and directly stimulating SGNs electrically, allowing for restoration of hearing in deaf patients. The performance of these devices depends on the functionality of SGNs, the implantation procedure and on the distance between the electrodes and the auditory neurons.
We hypothesized, that reducing the distance between the SGNs and the electrode array of the implant would allow for improved stimulation and frequency resolution, with the best results in a gapless position. Currently we lack in vitro culture systems to study, modify and optimize the interaction between auditory neurons and electrode arrays and characterize their electrophysiological response. To address these issues, we developed an in vitro bioassay using SGN cultures on a planar multi electrode array (MEA). With this method we were able to perform extracellular recording of the basal and electrically induced activity of a population of spiral ganglion neurons. We were also able to optimize stimulation protocols and analyze the response to electrical stimuli as a function of the electrode distance. This platform could also be used to optimize electrode features such as surface coatings.
Introduction
In accordance with the World Health Organization, 360 million people worldwide suffer from hearing loss with profound consequences on professional and private life. Hearing aids can restore sensory function in moderate forms of hearing loss; however, for the most severe cases, the most effective treatment option is a prosthetic device called a cochlear implant (CI). CIs contain a linear electrode array of up to 24 electrodes, which is surgically inserted into the scala tympani of the cochlea. The electrodes directly stimulate the spiral ganglion neurons, forming the auditory nerve 1.
With more than 300,000 devices implanted worldwide, CIs are very successful medical implants and rank among the most cost-effective procedure ever reported. Despite its success the cochlear implant still has limitations such as reduced frequency resolution compared to physiological hearing. This can lead to deficits in effective communication in groups or noisy environments, and the ability to decipher very complex sounds such as music. This reduced frequency resolution is likely due to the gap between the CI electrodes and the spiral ganglion neurons, leading to stimulation of large groups of neurons. This gap is in the range of hundreds of micrometers 2,3. Elimination of this gap would facilitate the stimulation of smaller groups of neurons per electrode, thereby increasing frequency resolution and overall performance of the device 4.
To study the influence of the gap between the electrode and the neuron and the effect of various optimized stimulation protocols, we have developed an in vitro bioassay based on a non-invasive electrophysiological characterization of SGNs on multi electrode arrays (MEAs) 5. Additionally, MEAs can be easily modified to vary electrode shape, size, material and surface roughness, to optimize the neuron-electrode interface. The following is a step-by-step protocol to reproducibly obtain recordings from murine spiral ganglion neuron cultures and assess the dependency on the above-mentioned parameters.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il protocollo qui descritto mostra come la cultura espianti SGN sulla MEA e valutare l'attività SGN da registrazioni non invasive extracellulari. Questa piattaforma e il protocollo che abbiamo recentemente sviluppato 5 consentire l'identificazione di nuovi protocolli di stimolazione e materiali per elettrodi con conseguente fabbisogno di energia ridotto per attivare SGN, con un potenziale interesse per l'ulteriore implementazione di impianti cocleari e altri neuro-protesi. Alcune precauzioni nella procedura presentati sono fondamentali per la realizzazione di esperimenti accurati e riproducibili.
dissezione attento del ganglio spirale e ulteriore manipolazione del tessuto primario richiede particolare cautela. Questi esperimenti sono stati condotti utilizzando topi C57 / BL6 tra 5 e 7 giorni di età. Risultati simili sono stati ottenuti utilizzando ratti Wistar nella stessa fascia di età, (dati non mostrati). Crediamo che questa sia l'età migliore per la messa dissezione come l'osso cocleare è ancora morbido itough per una facile rimozione dalla pinza, e il ganglio spirale e organo del Corti possono essere facilmente separati senza rompersi processi dendriti o SGN somas. Al epoche precedenti il tessuto è troppo morbido e le possibilità di strappare il SGN somas insieme con l'organo di Corti è maggiore, mentre nelle fasi successive, l'indurimento della capsula ossea della coclea aumenta il rischio di danneggiare il tessuto mentre dissezione. Corretto isolamento del SG e taglio attento degli espianti è critica. Questi dovrebbero essere nella gamma di 200-500 micron di dimensioni per massimizzare fissaggio su una superficie MEA e di avere sufficiente numero di SG somas negli espianti, da cui neuriti saranno ricrescere. Per aumentare il sostegno neurotrofico nei primi giorni della cultura, fresco BDNF si aggiunge ogni giorno e l'organo del Corti è collocato in co-coltura.
La velocità di dissezione è importante. Tutti i passaggi devono essere eseguiti rapidamente e con soluzioni fredde di ghiaccio per minimizzare il deterioramento del tessuto. Iltempo che intercorre tra l'eutanasia e l'immissione l'espianto sul MEA deve essere compresa tra 10-15 minuti ed è cruciale per le culture di successo. Avere tutti gli strumenti pronti, per evitare ritardi nella placcatura cultura.
Tutte le fasi, compresa la dissezione fine, la manutenzione della cultura e la preparazione del mezzo e le attrezzature vengono eseguite in condizioni sterili. Quando rivestimento del MEA con la soluzione ECM è importante scongelare in ghiaccio e di utilizzare punte delle pipette ghiacciate e medie ghiacciata come i gel miscela ECM a temperature più elevate. Quando si posizionano gli espianti su MEA, innanzitutto aggiungere il supporto per le zone degli elettrodi, poi posizionare gli espianti. Se si aggiunge il mezzo in una seconda fase, espianti tendono a staccarsi dalla MEA dovuta allo sforzo di taglio. Poiché piccoli volumi di mezzo sono applicati alla cultura nelle prime 5 giorni, evaporazione del terreno di coltura deve essere minimizzato. Pertanto si consiglia vivamente di creare una camera umidificata utilizzando piccole capsule di Petri, contenenti PBS in stretta Proximlità ai MEA.
Gli esperimenti qui descritti sono stati effettuati utilizzando disponibili in commercio elettrodi MEA con specifiche dimensioni degli elettrodi, materiali di rivestimento e la distanza degli elettrodi intra (come descritto al punto 2, nota). Le condizioni di coltura sono state ottimizzate qui per massimizzare la copertura neuronale del disegno specifico griglia dell'elettrodo. È possibile che altre configurazioni di elettrodi spaziatura, geometrie e superfici possono richiedere diversi rivestimenti o densità cellulari. Questi passaggi possono richiedere guasti iniziale per ottenere colture ad alta densità.
Per quanto riguarda le registrazioni elettrofisiologiche, prima di iniziare le registrazioni la coltura è trasferito da terreno di coltura a 37 ° C ad una soluzione extracellulare a RT. Per evitare registrazioni instabili, attendere circa 10 minuti per consentire la coltura di stabilizzarsi. Quando stimolando la cultura, particolare deve essere usata cautela nella scelta dello stimolocome grandi ampiezze (> 3 V) e durate possono causare danni alla cultura. Per un riferimento per quanto riguarda le forme di impulsi di stimolazione e la durata vedi riferimento 5.
Per l'acquisizione dei dati e l'elaborazione hardware fatto in casa (camera di registrazione, collegamenti con gli amplificatori e gli amplificatori) sono stati utilizzati e programmi di analisi specifici sono stati selezionati (vedi tabella Materiale, punto 7). Tuttavia, altre configurazioni MEA commerciali e altri pacchetti software sono adatti anche per queste operazioni. Abbiamo già valutato le risposte delle nostre culture a 3 punti di tempo diversi e ha mostrato un aumento di attività con il tempo prolungato cultura 5. Qui vi proponiamo 18 giorni in vitro per le registrazioni. sistemi MEA che consentono di registrazioni continue in sterili, camere umidificati, potrebbero facilitare l'identificazione dei punti di tempo ottimali per ogni tipo di cultura.
Un grave inconveniente di questo saggio biologico è l'elevata variazione di tegli numero di elettrodi per coltura che mostrano le risposte alla stimolazione. Questo tasso di risposte alla stimolazione dipende principalmente da quattro fattori: la densità dei neuriti nella cultura, i contatti tra le neuriti e gli elettrodi, il diametro dei neuriti o fasci neuriti, e l'impedenza degli elettrodi. Per quanto riguarda la densità neurite, solo neuriti che crescono su almeno due elettrodi possono essere usate per esperimenti di stimolazione. Il contatto tra neuriti ed elettrodi dipende dal tessuto circostante che può da un lato isolare i neuriti dall'elettrodo, e quindi peggiorare il contatto oppure, d'altra parte, isolare le neuriti e l'elettrodo dal bagno circostante e quindi migliorare il contatto. densità dei tessuti, nonché le dimensioni neurite, sono definite dalla espianto utilizzato e le condizioni di coltura. colture neuronali dissociate sono stati testati con successo ma densità neuronale in queste culture è molto più bassa, risultando in un numero ridotto di recoelettrodi rding. Pertanto, la coltura cellulare deve essere adattato alla specifica domanda scientifica da esaminare.
Infine, l'impedenza degli elettrodi è dato principalmente dalla dimensione e la superficie degli elettrodi. Materiali, creando una grande superficie, come nero di platino, come mostrato in figura 3, diminuendo l'impedenza degli elettrodi può anche migliorare l'accoppiamento tra elettrodi e neuriti 7-9.
Le strategie per migliorare il tasso di successo della stimolazione comprende quindi l'ottimizzazione delle condizioni di coltura, l'aumento del numero di elettrodi totale o densità elettrodi e la modulazione della superficie dell'elettrodo 10.
Fino ad ora, la caratterizzazione elettrofisiologica dei neuroni SG era stata eseguita utilizzando tecniche di patch clamp. Questo permette di registrazioni intracellulari di potenziali d'azione e l'analisi dettagliata delle correnti ioniche intracellulari daneuroni singoli. Presentiamo qui un saggio biologico in vitro che possono essere utilizzati per studiare i profili di attività dei neuroni gangliari spirale analizzando attività spontanea o risposte alla stimolazione extracellulare di molti neuroni contemporaneamente. Inoltre, l'interazione tra elettrodo e neuroni gangliari spirale può essere studiato ed ottimizzato per applicazione di materiali modificati o nuovi. Infine, anche se non illustrata, la piattaforma può essere utilizzato in combinazione con un elettrodo esterno, montato su un micromanipolatore come recentemente dimostrato dal nostro gruppo 5, al fine di studiare la relazione tra la distanza dell'attività dell'elettrodo e cultura stimolante. Tutti questi aspetti innovativi consentono di mimetismo delle caratteristiche chiave dei elettrodi impianto cocleare può portare alla progettazione di dispositivi protesici innovativi.
Il nostro modello è molto utile in strumento vitro per studiare le strategie per migliorare l'efficacia della stimolazione dei neuroni uditivi e ulteriori opLa tecnologia CI mizzare. Una volta che la tecnica è padroneggiata, si potrebbe immaginare screening per la modifica di un certo numero di variabili: a) diverse popolazioni neuronali, b) diversi materiali elettrodici / taglia / impedenze c) effettuare esperimenti cronici per testare Tossicità materiale o elettrodi di stimolazione indotta, che potrebbe far luce sui protocolli di stimolazione più sicuri e più efficaci di schiere di elettrodi in vivo.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori ringraziano Ruth Rubli presso il Dipartimento di Fisiologia dell'Università di Berna, in Svizzera per il prezioso aiuto tecnico con gli esperimenti. Questo lavoro è stato sostenuto in parte dal programma UE-FP7-NMP (convenzione di sovvenzione senza 281.056; progetto NANOCI – www.nanoci.org.).
Materials
| culture medium | |||
| Neurobasal medium | Invitrogen | 21103-049 | 24 ml (for 25 ml) |
| HEPES | Invitrogen | 15630-080 | 250 μl (for 25 ml) |
| Glutamax | Invitrogen | 35050-061 | 250 μl (for 25 ml) |
| B27 | Invitrogen | 17504-044 | 500 μl (for 25 ml) |
| FBS | GIBCO | 10099-141 | 10% (for 25 ml) |
| BDNF | R&D Systems | 248-BD-025/CF | final 5 ng/ml (for 25 ml) |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| extracellular solution (pH 7.4) | |||
| NaCl | 145mM | ||
| KCl | 4mM | ||
| MgCl2 | 1mM | ||
| CaCl2 | 2mM | ||
| HEPES | 5mM | ||
| Na-pyruvate | 2mM | ||
| Glucose | 5mM | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| blocking solution | |||
| PBS | Invitrogen | 10010023 | |
| BSA | Sigma | A4503-50G | 2% |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | 0.01% |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Immunostaining solutions | |||
| TuJ | R&D Systems | MAB1195 | dil 1:200 |
| DAPI | Sigma | D9542 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | 4% |
| Fluoreshild | Sigma | F6057 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| plastic/tools | |||
| petri dish 35 mm | Huberlab | 7.627 102 | |
| petri dish 94 mm | Huberlab | 7.633 180 | |
| Dumont #5 tweezer | WPI | 14098 | |
| Dumont #55 tweezer | WPI | 14099 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| Enzymatic solution: Terg-a-Zyme | Sigma | Z273287-11KG | |
| Extracellular Matrix (ECM) mix: Matrigel TM | Corning | 356230 | |
| MEA electrodes | Qwane Biosciences | (Lausanne, Switzerland) | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Labview | National Instruments | Switzerland | |
| IgorPro | WaveMetrics | Lake Oswega, USA |
References
- O’Donoghue, G. Cochlear implants–science, serendipity, and success. N Engl J Med. 369 (13), 1190-1193 (2013).
- Shepherd, R. K., Hatsushika, S., Clark, G. M. Electrical stimulation of the auditory nerve: the effect of electrode position on neural excitation. Hear Res. 66 (1), 108-120 (1993).
- Tykocinski, M., et al. Comparison of electrode position in the human cochlea using various perimodiolar electrode arrays. Am J Otol. 21 (2), 205-211 (2000).
- Wilson, B. S., Dorman, M. F. Cochlear implants: current designs and future possibilities. J Rehabil Res Dev. 45 (5), 695-730 (2008).
- Hahnewald, S., et al. Response profiles of murine spiral ganglion neurons on multi-electrode arrays. J. Neural Eng. 13, (2015).
- Tscherter, A., Heuschkel, M. O., Renaud, P., Streit, J. Spatiotemporal characterization of rhythmic activity in rat spinal cord slice cultures. Eur J Neurosci. 14 (2), 179-190 (2001).
- Heim, M., Yvert, B., Kuhn, A. Nanostructuration strategies to enhance microelectrode array (MEA) performance for neuronal recording and stimulation. J Physiol Paris. 106 (3-4), 137-145 (2012).
- Kim, R., Nam, Y. Novel platinum black electroplating technique improving mechanical stability. Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc. , 184-187 (2013).
- Cellot, G., et al. Carbon nanotubes might improve neuronal performance by favouring electrical shortcuts. Nat Nanotechnol. 4 (2), 126-133 (2009).
- Spira, M. E., Hai, A. Multi-electrode array technologies for neuroscience and cardiology. Nat Nano. 8 (2), 83-94 (2013).
