Spiralganglion Neuron Explantation Kultur und Elektrophysiologie auf Multi-Elektroden-Arrays
Summary
We present a protocol to culture primary murine spiral ganglion neuron explants on multi electrode arrays to study neuronal response profiles and optimize stimulation parameters. Such studies aim to improve the neuron-electrode interface of cochlear implants to benefit hearing in patients as well as the energy consumption of the device.
Abstract
Spiral ganglion neurons (SGNs) participate in the physiological process of hearing by relaying signals from sensory hair cells to the cochlear nucleus in the brain stem. Loss of hair cells is a major cause of sensory hearing loss. Prosthetic devices such as cochlear implants function by bypassing lost hair cells and directly stimulating SGNs electrically, allowing for restoration of hearing in deaf patients. The performance of these devices depends on the functionality of SGNs, the implantation procedure and on the distance between the electrodes and the auditory neurons.
We hypothesized, that reducing the distance between the SGNs and the electrode array of the implant would allow for improved stimulation and frequency resolution, with the best results in a gapless position. Currently we lack in vitro culture systems to study, modify and optimize the interaction between auditory neurons and electrode arrays and characterize their electrophysiological response. To address these issues, we developed an in vitro bioassay using SGN cultures on a planar multi electrode array (MEA). With this method we were able to perform extracellular recording of the basal and electrically induced activity of a population of spiral ganglion neurons. We were also able to optimize stimulation protocols and analyze the response to electrical stimuli as a function of the electrode distance. This platform could also be used to optimize electrode features such as surface coatings.
Introduction
In accordance with the World Health Organization, 360 million people worldwide suffer from hearing loss with profound consequences on professional and private life. Hearing aids can restore sensory function in moderate forms of hearing loss; however, for the most severe cases, the most effective treatment option is a prosthetic device called a cochlear implant (CI). CIs contain a linear electrode array of up to 24 electrodes, which is surgically inserted into the scala tympani of the cochlea. The electrodes directly stimulate the spiral ganglion neurons, forming the auditory nerve 1.
With more than 300,000 devices implanted worldwide, CIs are very successful medical implants and rank among the most cost-effective procedure ever reported. Despite its success the cochlear implant still has limitations such as reduced frequency resolution compared to physiological hearing. This can lead to deficits in effective communication in groups or noisy environments, and the ability to decipher very complex sounds such as music. This reduced frequency resolution is likely due to the gap between the CI electrodes and the spiral ganglion neurons, leading to stimulation of large groups of neurons. This gap is in the range of hundreds of micrometers 2,3. Elimination of this gap would facilitate the stimulation of smaller groups of neurons per electrode, thereby increasing frequency resolution and overall performance of the device 4.
To study the influence of the gap between the electrode and the neuron and the effect of various optimized stimulation protocols, we have developed an in vitro bioassay based on a non-invasive electrophysiological characterization of SGNs on multi electrode arrays (MEAs) 5. Additionally, MEAs can be easily modified to vary electrode shape, size, material and surface roughness, to optimize the neuron-electrode interface. The following is a step-by-step protocol to reproducibly obtain recordings from murine spiral ganglion neuron cultures and assess the dependency on the above-mentioned parameters.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das hier beschriebene Protokoll zeigt, wie Explantate auf MEA Kultur SGN und SGN Aktivität beurteilen durch extrazelluläre nicht-invasive Aufnahmen. Diese Plattform und das Protokoll , das wir vor kurzem 5 erlauben Materialien zur Identifizierung neuer Stimulationsprotokolle und Elektrode in reduzierter Energiebedarf entwickelt haben resultierende SGN zu aktivieren, mit potentiellem Interesse für die weitere Umsetzung von Cochlea – Implantaten und anderen neuro-Prothetik. Mehrere Vorsichtsmaßnahmen im vorliegenden Verfahren sind von grundlegender Bedeutung für die Durchführung von genauen und reproduzierbaren Experimenten.
Eine sorgfältige Präparation des Spiralganglion und zur weiteren Behandlung des primären Gewebe erfordert besondere Vorsicht. Diese Experimente wurden zwischen 5 und 7 Tagen alt Verwendung C57 / BL6-Mäusen durchgeführt. Ähnliche Ergebnisse wurden in der gleichen Altersgruppe unter Verwendung von Wistar-Ratten erhalten (Daten nicht gezeigt). Wir glauben, dass dies das beste Alter für eine Fein Präparation ist als das Cochlea-Knochen noch weich en istough für die einfache Entfernung mit einer Zange, und die Spiralganglion und Corti-Organ kann leicht ohne aufzureißen Dendriten Prozesse oder SGN somas getrennt werden. Bei früheren Zeiten ist das Gewebe zu weich und die Chancen, die SGN somas zusammen mit dem Corti-Organ zu zerreißen ist höher, während in späteren Phasen, die Verhärtung der knöchernen Kapsel der Cochlea die Gefahr einer Beschädigung des Gewebes erhöht, während sezieren. Die richtige Isolierung des SG sowie sorgfältige Schneiden der Explantate ist kritisch. Diese sollten im Bereich von 200-500 um Grße Befestigung an der MEA Oberfläche zu maximieren und eine ausreichende Anzahl von SG somas in den Explantaten zu haben, aus denen Neuriten nachwachsen wird. Um neurotrophic Unterstützung in den ersten Tagen der Kultur zu erhöhen, wird frisch BDNF täglich hinzugefügt und das Corti-Organ wird in Co-Kultur gelegt.
Die Geschwindigkeit der Dissektion ist ebenfalls wichtig. Alle Schritte sollten rasch und mit eiskalter Lösungen ausgeführt werden, um Gewebe Verschlechterung zu minimieren. DasZeit zwischen Euthanasie und Platzierung der Explantation auf der MEA sollte zwischen 10-15 Minuten und ist von entscheidender Bedeutung für eine erfolgreiche Kulturen. Lassen Sie alle Werkzeuge bereit, um Verzögerungen zu vermeiden in der Kultur-Beschichtung.
Alle Schritte, einschließlich feinen Sezierung, Wartung der Kultur und der Herstellung von mittleren und Geräte werden unter sterilen Bedingungen durchgeführt. Bei der Beschichtung der MEA mit der ECM-Lösung ist es wichtig, sie auf Eis auftauen und bei höheren Temperaturen eiskalten Pipettenspitzen und eiskaltes Medium wie die ECM-Mix Gele zu verwenden. Wenn die Explantate auf MEAs platzieren, fügen Sie zuerst das Medium zu den Elektrodenflächen, anschließend die Explantate platzieren. Wenn das Medium in einem zweiten Schritt zugegeben wird, neigen Explantaten von der MEA zu lösen durch Stress Scherung. Da kleine Mengen von Medium zu der Kultur angewendet werden, in ersten 5 Tagen, Verdampfen des Kulturmediums minimiert werden muss. Daher ist es dringend einer befeuchteten Kammer mit kleinen Petrischalen mit PBS in der Nähe von Proxim zu erstellen empfohlenkeit zu den MEAs.
Die hier beschriebenen Experimente wurden unter Verwendung von kommerziell erhältlichen MEA-Elektroden mit spezifischen Elektrodenabmessungen, Beschichtungsmaterialien und intraElektrodenAbstand durchgeführt (wie in Punkt 2 beschrieben, Anmerkung). Die Kulturbedingungen wurden zu maximieren, um die neuronale Deckung des spezifischen Elektrodengitter Design hier optimiert. Es ist möglich, dass andere Konfigurationen von Elektrodenabstand, Geometrien und Oberflächen können unterschiedliche Beschichtungen oder Zelldichten erfordern. Diese Schritte können erfordern anfängliche Fehlersuche, um eine hohe Dichte Kulturen zu erreichen.
In Bezug auf die elektrophysiologische Aufnahmen, bevor die Aufnahmen ausgehend die Kultur aus dem Kulturmedium bei 37 ° C zu der extrazellulären Lösung bei RT übertragen wird. Um instabilen Aufnahmen zu vermeiden, für etwa 10 Minuten warten, damit der Kultur zu ermöglichen, zu stabilisieren. Wenn die Kultur stimulieren, sollte besondere Vorsicht angewendet werden, um den Reiz bei der Auswahlals große Amplituden (> 3 V) und Dauern können Schäden an der Kultur führen. Für eine Referenz in Bezug auf die Stimulation Pulsformen und Dauer siehe Referenz 5.
Für die Datenerfassung und Verarbeitung selbst gemachte Hardware (Aufnahmekammer, Verbindungen zu den Verstärkern und Verstärker) wurden verwendet , und spezifische Analyseprogramme wurden (siehe Materialtabelle, Punkt 7) ausgewählt. Jedoch können auch andere kommerzielle MEA-Setups und andere Software-Pakete sind auch für diese Operationen geeignet. Wir haben bereits die Antworten unserer Kulturen in drei verschiedenen Zeitpunkten bewertet und zeigten eine erhöhte Aktivität bei längerer Kulturzeit 5. Hier empfehlen wir 18 Tage in vitro für Aufnahmen. MEA Systemen, was eine kontinuierliche Aufnahmen in sterile, befeuchteten Kammern könnte die Identifizierung der optimalen Zeitpunkte für jede Kultur Typ erleichtern.
Ein Hauptnachteil dieser Bioassay ist die hohe Variation in ter Anzahl der Elektroden pro Kultur, die Antworten auf die Stimulation zeigen. Dieser Satz von Reaktionen auf Stimulation hängt im wesentlichen von vier Faktoren ab: die Dichte der Neuriten in der Kultur, die Kontakte zwischen den Neuriten und den Elektroden, der Durchmesser der Neuriten oder Neuriten Bündeln, und der Impedanz der Elektroden. In Bezug auf die Neuriten-Dichte, nur Neuriten, die für sein können mindestens zwei Elektroden wachsen über Stimulationsexperimente verwendet. Der Kontakt zwischen Neuriten und Elektroden ist abhängig von dem umgebenden Gewebe, das die Neuriten von der Elektrode zu isolieren, auf der einen Seite kann, und somit den Kontakt verschlechtern, oder, andererseits, isolieren die Neuriten und die Elektrode aus dem umgebenden Bad und damit verbessern der Kontakt. Gewebedichte sowie Neuriten Größe, werden von dem Explantat definiert verwendet und den Kulturbedingungen. Dissoziiert haben neuronalen Kulturen ebenfalls erfolgreich getestet worden, aber die neuronale Dichte in diesen Kulturen ist viel geringer, in einer reduzierten Anzahl von reco ergebrding Elektroden. Deshalb sollte die Zellkultur auf die spezifische wissenschaftliche Fragestellung angepasst werden angegangen werden.
Schließlich wird die Impedanz der Elektroden, die hauptsächlich durch die Größe und die Oberfläche der Elektroden gegeben. Materialien, eine große Oberfläche , wie beispielsweise schwarz Platin zu schaffen, wie in 3 gezeigt , um die Impedanz der Elektroden abnimmt kann die Kopplung zwischen Elektroden und Neuriten auch 7-9 verbessern.
Strategien , um die Erfolgsrate der Stimulations daher zur Verbesserung umfassen die Optimierung der Kulturbedingungen, die Erhöhung der Gesamtzahl der Elektroden oder Elektroden Dichte und die Modulation der Elektrodenoberfläche 10.
Bisher hatte elektro Charakterisierung von SG-Neuronen wurden unter Verwendung von Patch-Clamp-Techniken durchgeführt. Dies ermöglicht für die intrazelluläre Aufnahme von Aktionspotentialen und detaillierte Analyse der intrazellulären Ionenströme auseinzelne Neuronen. Hier stellen wir ein in vitro – Bioassay , die verwendet werden können , um Aktivitätsprofile von Spiralganglienneuronen durch Analysieren spontane Aktivität oder Reaktionen auf extrazelluläre Stimulation vieler Neuronen gleichzeitig untersuchen. Außerdem kann die Wechselwirkung zwischen der Elektrode und Corti'-Ganglionneuronen durch Anwendung modifiziert oder neue Materialien untersucht und optimiert werden. Schließlich, auch wenn hier nicht gezeigt, kann diese Plattform in Kombination mit einer externen Elektrode verwendet werden, auf einem Mikromanipulator montiert , wie kürzlich von unserer Gruppe 5, gezeigt , um die Beziehung zwischen dem Abstand von der Stimulationselektrode und der Kultur Aktivität zu studieren. All diese neuen Aspekte ermöglichen das Nachahmen der wichtigsten Merkmale der Cochlea-Implant-Elektroden kann mit dem Design von neuartigen Prothesen führen.
Unser Modell ist ein sehr nützliches Werkzeug in vitro Strategien zur Untersuchung der Wirksamkeit der Stimulation der akustischen Neuronen und weiter zu verbessern opmieren CI-Technologie. Sobald die Technik beherrscht wird, könnte ein Screening für die Modifikation von einer Reihe von Variablen vorstellen: a) unterschiedliche neuronale Populationen, b) verschiedene Elektrodenmaterialien / Größe / Impedanzen c) durchführen chronische Experimente Material Toxizität oder Elektrodenstimulation induzierte Toxizität zu testen, die Schuppen Licht könnte auf sicherere und effektivere Stimulationsprotokolle durch in – vivo – Elektroden – Arrays.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken Ruth Rubli an der Abteilung für Physiologie der Universität Bern, Schweiz, für wertvolle technische Hilfe bei den Experimenten. Diese Arbeit wurde teilweise durch die EU-FP7-NMP-Programms (Finanzhilfevereinbarung Nr 281056; Projekt NANOCI – www.nanoci.org.) Unterstützt.
Materials
| culture medium | |||
| Neurobasal medium | Invitrogen | 21103-049 | 24 ml (for 25 ml) |
| HEPES | Invitrogen | 15630-080 | 250 μl (for 25 ml) |
| Glutamax | Invitrogen | 35050-061 | 250 μl (for 25 ml) |
| B27 | Invitrogen | 17504-044 | 500 μl (for 25 ml) |
| FBS | GIBCO | 10099-141 | 10% (for 25 ml) |
| BDNF | R&D Systems | 248-BD-025/CF | final 5 ng/ml (for 25 ml) |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| extracellular solution (pH 7.4) | |||
| NaCl | 145mM | ||
| KCl | 4mM | ||
| MgCl2 | 1mM | ||
| CaCl2 | 2mM | ||
| HEPES | 5mM | ||
| Na-pyruvate | 2mM | ||
| Glucose | 5mM | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| blocking solution | |||
| PBS | Invitrogen | 10010023 | |
| BSA | Sigma | A4503-50G | 2% |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | 0.01% |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Immunostaining solutions | |||
| TuJ | R&D Systems | MAB1195 | dil 1:200 |
| DAPI | Sigma | D9542 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | 4% |
| Fluoreshild | Sigma | F6057 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| plastic/tools | |||
| petri dish 35 mm | Huberlab | 7.627 102 | |
| petri dish 94 mm | Huberlab | 7.633 180 | |
| Dumont #5 tweezer | WPI | 14098 | |
| Dumont #55 tweezer | WPI | 14099 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| Enzymatic solution: Terg-a-Zyme | Sigma | Z273287-11KG | |
| Extracellular Matrix (ECM) mix: Matrigel TM | Corning | 356230 | |
| MEA electrodes | Qwane Biosciences | (Lausanne, Switzerland) | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Labview | National Instruments | Switzerland | |
| IgorPro | WaveMetrics | Lake Oswega, USA |
References
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- Cellot, G., et al. Carbon nanotubes might improve neuronal performance by favouring electrical shortcuts. Nat Nanotechnol. 4 (2), 126-133 (2009).
- Spira, M. E., Hai, A. Multi-electrode array technologies for neuroscience and cardiology. Nat Nano. 8 (2), 83-94 (2013).
