Spiraal Ganglion Neuron Explantatie Cultuur en elektrofysiologie op Multi Electrode Arrays
Summary
We present a protocol to culture primary murine spiral ganglion neuron explants on multi electrode arrays to study neuronal response profiles and optimize stimulation parameters. Such studies aim to improve the neuron-electrode interface of cochlear implants to benefit hearing in patients as well as the energy consumption of the device.
Abstract
Spiral ganglion neurons (SGNs) participate in the physiological process of hearing by relaying signals from sensory hair cells to the cochlear nucleus in the brain stem. Loss of hair cells is a major cause of sensory hearing loss. Prosthetic devices such as cochlear implants function by bypassing lost hair cells and directly stimulating SGNs electrically, allowing for restoration of hearing in deaf patients. The performance of these devices depends on the functionality of SGNs, the implantation procedure and on the distance between the electrodes and the auditory neurons.
We hypothesized, that reducing the distance between the SGNs and the electrode array of the implant would allow for improved stimulation and frequency resolution, with the best results in a gapless position. Currently we lack in vitro culture systems to study, modify and optimize the interaction between auditory neurons and electrode arrays and characterize their electrophysiological response. To address these issues, we developed an in vitro bioassay using SGN cultures on a planar multi electrode array (MEA). With this method we were able to perform extracellular recording of the basal and electrically induced activity of a population of spiral ganglion neurons. We were also able to optimize stimulation protocols and analyze the response to electrical stimuli as a function of the electrode distance. This platform could also be used to optimize electrode features such as surface coatings.
Introduction
In accordance with the World Health Organization, 360 million people worldwide suffer from hearing loss with profound consequences on professional and private life. Hearing aids can restore sensory function in moderate forms of hearing loss; however, for the most severe cases, the most effective treatment option is a prosthetic device called a cochlear implant (CI). CIs contain a linear electrode array of up to 24 electrodes, which is surgically inserted into the scala tympani of the cochlea. The electrodes directly stimulate the spiral ganglion neurons, forming the auditory nerve 1.
With more than 300,000 devices implanted worldwide, CIs are very successful medical implants and rank among the most cost-effective procedure ever reported. Despite its success the cochlear implant still has limitations such as reduced frequency resolution compared to physiological hearing. This can lead to deficits in effective communication in groups or noisy environments, and the ability to decipher very complex sounds such as music. This reduced frequency resolution is likely due to the gap between the CI electrodes and the spiral ganglion neurons, leading to stimulation of large groups of neurons. This gap is in the range of hundreds of micrometers 2,3. Elimination of this gap would facilitate the stimulation of smaller groups of neurons per electrode, thereby increasing frequency resolution and overall performance of the device 4.
To study the influence of the gap between the electrode and the neuron and the effect of various optimized stimulation protocols, we have developed an in vitro bioassay based on a non-invasive electrophysiological characterization of SGNs on multi electrode arrays (MEAs) 5. Additionally, MEAs can be easily modified to vary electrode shape, size, material and surface roughness, to optimize the neuron-electrode interface. The following is a step-by-step protocol to reproducibly obtain recordings from murine spiral ganglion neuron cultures and assess the dependency on the above-mentioned parameters.
Protocol
Representative Results
Discussion
De hier beschreven protocol laat zien hoe de cultuur SGN explantaten op MEA en SGN activiteit beoordelen door het extracellulaire niet-invasieve opnames. Dit platform en het protocol wij onlangs hebben ontwikkeld 5 zorgen voor identificatie van nieuwe stimulatie protocollen en elektrodematerialen wat resulteert in een verminderde energie-eisen te SGN te activeren, met potentieel belang voor de verdere uitvoering van cochleaire implantaten en andere neuro-protheses. Verschillende voorzorgsmaatregelen in de gepresenteerde procedure zijn van fundamenteel belang voor de verwezenlijking van nauwkeurige en reproduceerbare experimenten.
Zorgvuldige dissectie van de spiraal ganglion en de verdere behandeling van de primaire weefsel vereist bijzondere voorzichtigheid. Deze experimenten werden uitgevoerd middels C57 / Bl6 muizen tussen 5 en 7 dagen. Vergelijkbare resultaten werden verkregen met Wistar ratten in dezelfde leeftijdsgroep, (gegevens niet getoond). Wij geloven dat dit de beste leeftijd voor fijne dissectie als het cochleair bot is nog zacht endoorgedreven voor gemakkelijke verwijdering van forceps en de ganglion spirale en orgaan van Corti kan gemakkelijk worden afgescheiden zonder scheuren dendriet processen of SGN SOMA. Bij vroegere tijden het weefsel te zacht en de kans op het scheuren SGN SOMA samen met het orgaan van Corti hoger, terwijl in latere stadia, het verharden van de benige capsule van de cochlea risico van weefselbeschadiging terwijl ontleden toeneemt. Goede isolatie van de SG en zorgvuldige snijden van de explantaten kritisch. Deze dienen in het traject van 200-500 urn in grootte bijlage maximaliseren de MEA oppervlak en voldoende SG SOMA in de explantaten, waaruit neurieten zal teruggroeien hebben. Neurotrofe steun te verlenen in de eerste dagen kweken is vers BDNF dd toegevoegd en het orgaan van Corti wordt in co-cultuur.
De snelheid van ontleding is ook belangrijk. Alle stappen moeten snel en met behulp van ijskoude oplossingen worden uitgevoerd om weefsel verslechtering te minimaliseren. Detussen euthanasie en plaatsen van het explantaat op MEA moet tussen 10-15 min en is essentieel voor een succesvolle kweken. Zijn alle hulpmiddelen klaar om vertragingen in de cultuur plating te vermijden.
Alle stappen, met inbegrip van fijne dissectie, het onderhoud van de cultuur en de voorbereiding van de middelgrote en apparatuur worden uitgevoerd onder steriele omstandigheden. Bij het bekleden van de MEA de ECM oplossing is het belangrijk om te ontdooien op ijs en ijskoud pipetpunten en ijskoud medium als ECM mix gels bij hogere temperaturen. Bij het plaatsen van de explantaten op MMO's, eerst het medium toe te voegen aan de elektroden, vervolgens plaatst u de explantaten. Als het medium wordt toegevoegd in een tweede stap, explantaten neiging om los te maken van de MEA door afschuifspanning. Omdat kleine hoeveelheden drager wordt toegepast op de cultuur in eerste 5 dagen, afdampen van het kweekmedium moet worden geminimaliseerd. Daarom is het sterk aan te raden om een vochtige kamer met behulp van kleine platen met PBS in nauwe Proxim creërenteit van de MEA.
De hier beschreven experimenten werden uitgevoerd met behulp van in de handel verkrijgbare MEA elektroden met specifieke elektrode afmetingen, bekledingsmaterialen en intra-elektrode afstand (zoals beschreven in punt 2, Note). De kweekomstandigheden zijn hier geoptimaliseerd om neuronale dekking van de specifieke elektroderooster ontwerp maximaliseren. Het is mogelijk dat andere configuraties van elektrodenafstand, geometrieën en oppervlakken verschillende coatings of celdichtheden nodig. Deze stappen kunnen initiële oplossen verlangen bij hoge dichtheid kweken bereiken.
Wat de elektrofysiologische opnames, voordat de opnames wordt de kweek overgebracht uit kweekmedium bij 37 ° C op extracellulaire oplossing bij kamertemperatuur. Om instabiele opnamen voorkomen, wacht ongeveer 10 minuten om de kweek te stabiliseren. Bij het stimuleren van de cultuur, moet bijzondere voorzichtigheid worden betracht bij het selecteren van de stimuluszoals grote amplitudes (> 3 V) en perioden kan schade veroorzaken aan de kweek. Voor een verwijzing met betrekking tot stimulatie puls vormen en de duur zie referentie 5.
Voor data-acquisitie en verwerking van zelfgemaakte hardware (opname kamer, verbindingen met de versterkers en versterkers) werden gebruikt en specifieke analyse programma's werden geselecteerd (zie tabel Materiaal, punt 7). Echter, andere commerciële MEA setups en andere software pakketten ook geschikt voor deze operaties. We hebben eerder onderzocht de reacties van onze culturen op 3 verschillende tijdstippen en toonde een verhoogde activiteit met een verlengde cultuur tijd 5. Hier stellen we voor 18 dagen in vitro voor opnames. MEA-systemen voor continue opnames steriele bevochtigde kamers, kan de identificatie van de optimale tijdstippen voor elk kweek vergemakkelijken.
Een belangrijk nadeel van deze bioassay is de hoge variatie in tHij aantal elektroden per cultuur die reacties op stimulatie te laten zien. Deze mate waarin reacties op stimulatie hangt voornamelijk af van vier factoren: de dichtheid van de neurieten in de cultuur, de contacten tussen neurieten en de elektroden, de diameter van de neurieten of neurieten bundels en de impedantie van de elektroden. Wat de neurieten dichtheid, alleen neurieten die groeien via ten minste twee elektroden gebruikt worden voor stimulatie experimenten. Het contact tussen neurieten en de elektroden afhankelijk van het omringende weefsel dat enerzijds isoleren de neurieten van de elektrode, en daarmee verslechtert het contact, of, anderzijds, isoleren de neurieten en de elektrode uit de omringende bad en aldus het contact. Weefseldichtheid, alsook neuriet grootte, gedefinieerd door de gebruikte explantaat en kweekomstandigheden. Gedissocieerde neuronale culturen zijn ook met succes getest, maar neuronale dichtheid in deze culturen veel lager, wat resulteert in een verminderd aantal recording elektroden. Dus de celkweek worden aangepast aan de specifieke wetenschappelijke vraag die moet worden aangepakt.
Tenslotte wordt de impedantie van de elektroden hoofdzakelijk gegeven door de grootte en het oppervlak van de elektroden. Materialen, waardoor een groot oppervlak zoals platina zwart, zoals getoond in figuur 3, het verminderen van de impedantie van de elektroden mag de koppeling tussen elektroden en neurieten 7-9 verbeteren.
Strategieën om het succes van de stimulatie verbeteren daarom ook het optimaliseren van de kweekomstandigheden, de toename van het totale aantal elektroden of elektroden dichtheid en de modulatie van het elektrodeoppervlak 10.
Tot nu toe was elektrofysiologische karakterisering van SG neuronen werd uitgevoerd dmv patch clamp technieken. Dit zorgt voor intracellulaire opnames van actiepotentialen en gedetailleerde analyse van de intracellulaire ionische stromen uitenkele neuronen. Hier presenteren we een in vitro bioassay die kunnen worden gebruikt om de activiteit profielen van ganglion spirale neuronen te bestuderen door het analyseren spontane activiteit of responsen op extracellulaire stimulatie van vele neuronen tegelijk. Bovendien kan de wisselwerking tussen de elektrode en ganglion spirale neuronen bestudeerd en geoptimaliseerd door toepassing van gemodificeerde of nieuwe materialen. En zelfs als hier niet getoond, dit platform kan worden gebruikt in combinatie met een uitwendige elektrode, gemonteerd op een micromanipulator zoals onlangs aangetoond door onze groep 5, teneinde de verhouding tussen de afstand van de stimulerende elektrode en cultuur -activiteit. Al deze nieuwe aspecten oog op het nabootsen van de belangrijkste functies van cochleair implantaat elektroden kan leiden tot het ontwerp van nieuwe prothesen.
Ons model is een zeer nuttig gereedschap in vitro strategieën onderzocht om de effectiviteit van stimulatie van auditieve neuronen en verder op verbeterentimize CI technologie. Zodra de techniek beheerst, kan men screenen voor ogen om wijziging van een aantal variabelen: a) de verschillende neuronale populaties, b) andere elektrodematerialen / grootte / impedanties c) voert chronische experimenten materiaal toxiciteit of elektrode-stimulatie geïnduceerde toxiciteit te testen, die kan licht werpen op veiligere en effectievere stimulatie protocollen in vivo elektrode arrays.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs danken Ruth Rubli aan de fysiologie van de Universiteit van Bern, Zwitserland voor waardevolle technische hulp bij de experimenten. Dit werk werd ondersteund in het kader van de EU-FP7-NMP-programma (subsidieovereenkomst geen 281.056; project NANOCI – www.nanoci.org.).
Materials
| culture medium | |||
| Neurobasal medium | Invitrogen | 21103-049 | 24 ml (for 25 ml) |
| HEPES | Invitrogen | 15630-080 | 250 μl (for 25 ml) |
| Glutamax | Invitrogen | 35050-061 | 250 μl (for 25 ml) |
| B27 | Invitrogen | 17504-044 | 500 μl (for 25 ml) |
| FBS | GIBCO | 10099-141 | 10% (for 25 ml) |
| BDNF | R&D Systems | 248-BD-025/CF | final 5 ng/ml (for 25 ml) |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| extracellular solution (pH 7.4) | |||
| NaCl | 145mM | ||
| KCl | 4mM | ||
| MgCl2 | 1mM | ||
| CaCl2 | 2mM | ||
| HEPES | 5mM | ||
| Na-pyruvate | 2mM | ||
| Glucose | 5mM | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| blocking solution | |||
| PBS | Invitrogen | 10010023 | |
| BSA | Sigma | A4503-50G | 2% |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | 0.01% |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Immunostaining solutions | |||
| TuJ | R&D Systems | MAB1195 | dil 1:200 |
| DAPI | Sigma | D9542 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | 4% |
| Fluoreshild | Sigma | F6057 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| plastic/tools | |||
| petri dish 35 mm | Huberlab | 7.627 102 | |
| petri dish 94 mm | Huberlab | 7.633 180 | |
| Dumont #5 tweezer | WPI | 14098 | |
| Dumont #55 tweezer | WPI | 14099 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| Enzymatic solution: Terg-a-Zyme | Sigma | Z273287-11KG | |
| Extracellular Matrix (ECM) mix: Matrigel TM | Corning | 356230 | |
| MEA electrodes | Qwane Biosciences | (Lausanne, Switzerland) | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Labview | National Instruments | Switzerland | |
| IgorPro | WaveMetrics | Lake Oswega, USA |
References
- O’Donoghue, G. Cochlear implants–science, serendipity, and success. N Engl J Med. 369 (13), 1190-1193 (2013).
- Shepherd, R. K., Hatsushika, S., Clark, G. M. Electrical stimulation of the auditory nerve: the effect of electrode position on neural excitation. Hear Res. 66 (1), 108-120 (1993).
- Tykocinski, M., et al. Comparison of electrode position in the human cochlea using various perimodiolar electrode arrays. Am J Otol. 21 (2), 205-211 (2000).
- Wilson, B. S., Dorman, M. F. Cochlear implants: current designs and future possibilities. J Rehabil Res Dev. 45 (5), 695-730 (2008).
- Hahnewald, S., et al. Response profiles of murine spiral ganglion neurons on multi-electrode arrays. J. Neural Eng. 13, (2015).
- Tscherter, A., Heuschkel, M. O., Renaud, P., Streit, J. Spatiotemporal characterization of rhythmic activity in rat spinal cord slice cultures. Eur J Neurosci. 14 (2), 179-190 (2001).
- Heim, M., Yvert, B., Kuhn, A. Nanostructuration strategies to enhance microelectrode array (MEA) performance for neuronal recording and stimulation. J Physiol Paris. 106 (3-4), 137-145 (2012).
- Kim, R., Nam, Y. Novel platinum black electroplating technique improving mechanical stability. Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc. , 184-187 (2013).
- Cellot, G., et al. Carbon nanotubes might improve neuronal performance by favouring electrical shortcuts. Nat Nanotechnol. 4 (2), 126-133 (2009).
- Spira, M. E., Hai, A. Multi-electrode array technologies for neuroscience and cardiology. Nat Nano. 8 (2), 83-94 (2013).
