Ganglio espiral neurona explante cultura y Electrofisiología de multi electrodos matrices

cuidado de los animales y la experimentación se llevó a cabo de acuerdo con las directrices de las autoridades locales suizos (Amt für Landwirtschaft und Natur del Cantón de Berna, Suiza). 1. Preparar las soluciones para los Experimentos Preparar la solución de revestimiento de matriz extracelular (ECM) (véase la Tabla de Materiales, punto 6): Mezcla de deshielo ECM en hielo. Se diluye la mezcla ECM 1:10 en medio de cultivo básico (sin factores neurotróficos o de suero bovino fetal (FBS)) y almacenar en hielo. Preparar el medio de cultivo (véase la Tabla de Materiales, punto 1): Preparar una reserva de medio Neurobasal no contiene FBS o factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF). Suplemento medios neurobasal con FBS fresco (10%) y BDNF (5 ng / ml) justo antes de la adición al cultivo celular. Preparar la solución extracelular (véase la Tabla de Materiales, punto 2). 2. Lavado y esterilización de los AMA <p class = "jove_content"> NOTA: Los MEA utilizados para los experimentos contienen 68 electrodos dispuestos en una cuadrícula rectangular (Figura 1E). Cada electrodo tiene un tamaño de 40 x 40 m 2 con una separación de 200 micras de centro a centro. Los electrodos están hechos de platino. Los electrodos están conectados a los contactos correspondientes por un circuito de óxido de indio y estaño. Este circuito está aislada por una capa de 5 micras de SU-8. Ver tabla de materiales para obtener información sobre el proveedor. Otros diseños de MEA pueden ser adecuados para estos experimentos. Para los nuevos AMMA: Enjuague por inmersión en etanol al 70% durante 30 segundos y se lava con agua destilada durante 30 segundos. Trabajar en una campana de flujo laminar. Dejar que el MEA seca durante 30 min en una campana de flujo laminar. Ponga cada MEA en una placa de Petri estériles individuales (35 mm x 10 mm) y selle con papel de aluminio. Los MEA se pueden almacenar hasta su uso. Para los AMA usadas: Incubar los AMA en una placa de Petri (35 mm x 10 mm) que contiene 1 ml de solut enzimáticaión (ver Tabla de Materiales, punto 6) O / N en un agitador orbital a temperatura ambiente para eliminar el material biológico. Después continúe como en el paso 2.1. NOTA: Manejar los AMUMA con cuidado con unas pinzas con puntas de goma cubierta. 3. Preparación de los AMA para los experimentos de cultivo Retire la hoja de cierre hermético y dejar el MEA en la placa de Petri (35 mm x 10 mm) para todo el experimento. Escudo de los AMUMA con la solución preparada en 1.1: Utilice una punta de pipeta de l fría 200 (almacenado a -20 ° C) para pipetear 50 l de solución de revestimiento a cada MEA, que cubre toda el área del electrodo. Permitir a los AMA capa de 30 minutos a 1 hora a temperatura ambiente. Eliminar la solución de recubrimiento con una pipeta. Aplicar 100 l de medio de cultivo suplementado con 10% de FBS y 5 ng / ml de BDNF y se deja a temperatura ambiente hasta que el tejido del chapado. Coloque 2 placas de Petri que contienen los AMA recubiertas en una gran placa de Petri (94 mm x 16 mm) y añadir una tercera pequeña placa de Petri que contiene 1,5ml de Tampón fosfato salino (PBS) para la humidificación. NOTA: La adición de una pequeña placa de Petri (paso 3.5) que contenía PBS es crucial para minimizar significativamente la evaporación del medio de cultivo. 4. La disección del ganglio espiral NOTA: la disección bruto se puede hacer fuera de la campana de flujo laminar (Paso 4.1 a 4.4). Para condiciones estériles fina disección (campana de flujo laminar) son obligatorios (del paso 4.5). La eutanasia de los animales (ratones de 5-7 días) por decapitación sin anestesia previa. Esterilizar la cabeza por pulverización con 70% de etanol. Con la celebración de la cabeza, cortar la conexión entre la piel y el cráneo con una tijera afilada / afilado a lo largo de la línea sagital. Corte sagital del cráneo y retire el cerebro usando unas tijeras afiladas / romos. Cortar los huesos temporales del cráneo y colocar los de una placa de Petri que contiene solución salina equilibrada de hielo estéril frío de Hanks (HBSS). Usando una disecciónmicroscopio ción, diseccionar la bulla timpánica usando unas pinzas finas y aislar el oído interno. Retirar el hueso de la cóclea, utilizando unas pinzas finas. Retire el ligamento espiral y la estría vascular (SV) junto sujetando con pinzas la porción basal del ganglio espiral (SG) y el SV y desenrollar lentamente el SV de la base -to-ápice Aislar el órgano de Corti (OC), la SG y el modiolus (Figura 1A – C) Separar el CO de la SG y modiolo sujetando con pinzas la parte basal de la SG y el CO y desenrollar lentamente el OC desde la base-a-ápice. Explantes laterales cortados (200 a 500 micras de diámetro) del ganglio espiral todavía unido a la modiolo (Figura 1D) utilizando unas pinzas y un bisturí micro. 5. Espiral Cultura Ganglio explante en los AMA Coloque dos explantes del ganglio espiral próximos a los electrodos en el MEA preparada previamente con 100 l de medio de cultivo. Coloque el órgano de Corti de aproximadamente 5 mm de distancia de la zona de electrodo. El uso de fórceps para fijar los explantes y el órgano de Corti en el MEA y evitar dañar el tejido. Coloque los AMUMA con cuidado en la incubadora y la cultura a 37 ° C y 5% de CO2. Al día siguiente, inspeccionan visualmente que los explantes han unido a la MEA. NOTA: Si no se adjunta explantes S / N, ellos rara vez lo hacen en los próximos días. El CO se coloca adyacente a la cultura de soporte trófico / neurotrófico. Añadir 100 l de medio de cultivo que contiene 10% de FBS y BDNF al día durante 5 días consecutivos. En el día 6 añadir 2 ml de medio de cultivo que contiene 10% de SFB y 5 ng / ml de BDNF y la cultura del tejido durante otros 13 días. 6. Registros electrofisiológicos para investigar la actividad espontánea y dependiente electrodo de estimulación Lavar la cultura MEA con extracelular por lolución preparado en la etapa 1.3, a temperatura ambiente. Seque los contactos con un pañuelo de papel y montar la MEA en la configuración de MEA. NOTA: Para mantener la cultura húmedo durante el montaje, añadir una pequeña gota de la solución extracelular a la cultura. Añadir 300 l de solución extracelular y esperar 10 min antes de la grabación, para permitir que el sistema se estabilice. Registro de actividad espontánea durante 2 min de todos los electrodos pulsando sobre el botón de grabación del software / adquirir e identificar electrodos de registro. Estimulación del electrodo MEA: Seleccione la amplitud / duración / forma del estímulo en el software adecuado y se aplican a varios electrodos de forma consecutiva como se ha descrito 13. Seleccionar los electrodos en base a los que muestran actividad espontánea (como en el paso 6.4). Registro de todos los electrodos restantes. Para excluir artefacto de estimulación, estimular desde el mismo electrodo 10 veces. Si el cultivo responde al menos 8 de cada 10 veces, se puede asumir como unarespuesta positiva a la estimulación inducida por el electrodo. Para identificar el ruido de fondo, aplicar tetrodotoxina (TTX) a la cultureat una concentración de 1 mM, para bloquear los canales de sodio dependientes de voltaje y grabar durante 2 min. Utilice esta opción para realizar la detección de pico (7.1 y 7.2). 7. Los datos de análisis NOTA: El análisis de datos se ha descrito anteriormente en detalle en 6 y 5. Para obtener información específica sobre el software utilizado en este estudio ver Tabla de Materiales, punto 7. Usando el software apropiado detectar actividad espontánea para cada electrodo empleando un detector basado en las desviaciones estándar y un posterior discriminador. Este procedimiento se describe en 6. Actividad aparece transitorios de tensión tan rápido (<5 ms). Elija un umbral que da lugar a ninguna actividad en el análisis de la TTX tratada samples.Adapt el valor umbral para cada experimento para discriminar entre la falsa positivelectrónico y las detecciones de falsos negativos. El uso de software apropiado observar la actividad neuronal detectado de cada electrodo como una trama de la trama de acuerdo con procedimientos estándar (véase la Figura 2A – C). Determinar y mostrar la actividad total de la red mediante la suma de todos los eventos detectados dentro de una ventana deslizante de 10 mseg, desplazado por pasos de 1 mseg. Detectar la actividad de la estimulación inducida por la visualización de los datos en bruto utilizando el software de análisis apropiados. Identificar los puntos solo sin conexión manualmente. Puntos solo aparecen transitorios de tensión tan rápido, que se produce después de que el artefacto de estimulación (cabeza de flecha en la Figura 2E). Un ejemplo se muestra en la Figura 2E. Dependiendo del experimento, analizar el número de electrodos que responden, el umbral necesario para lograr una respuesta, el número de potencial de acción por electrodos y otros parámetros de interés 5. 8. Tejido La fijación y Immunohistochemistry NOTA: El proceso de tinción destruirá el MEA. Véase la Tabla de Materiales (punto 4) para los reactivos. Directamente después de la grabación de lavar los cultivos con 37 ° C cálidos PBS tres veces. Desechar el PBS y aplicar 4% de paraformaldehído (PFA) (en PBS), precalentado a 37 ° C durante 10 min. PRECAUCIÓN: PFA es tóxico. Trabajo en una campana química con la protección adecuada y desechar la solución, de acuerdo con las directrices. Lavar los cultivos tres veces con PBS y bloquear con 2% albúmina de suero bovino (BSA) en PBS (0,01% de Triton-X100) durante 2 horas. Añadir el primer anticuerpo (Anti-βIII tubulina, anticuerpo TUJ) diluido en PBS (2% de BSA y 0,01% Triton-X100) y dejar O / N a 4 ° C. Se lava el cultivo tres veces con PBS. NOTA: A partir de ahora a mantener la muestra en la oscuridad tan a menudo como sea posible para minimizar la decoloración del anticuerpo secundario marcado con fluorescencia. Añadir el anticuerpo secundario, se diluyó en PBS (2% BSA unad 0.01% Triton-X100) e incubar durante 1 a 2 horas a RT. Para la tinción de los núcleos añaden 1: 10.000 DAPI (1 mg / ml de stock) para 10 min. Lavar tres veces con PBS y montar las muestras hacia atrás para cubrir las caídas delgadas (24 x 50 mm 2) utilizando medio de montaje (véase la Tabla de Materiales, punto 4). Imagen utilizando un microscopio de fluorescencia con 5X y 20X.