Измерение диоксида углерода производства от радиоактивной подложках<em> Дрозофилы</em
Summary
This paper describes a method for the measurement of fuel oxidation in Drosophila melanogaster in which trace amounts of specific radiolabeled metabolic substrates are fed to flies. The exhaled radiolabeled CO2 that is a produced from fuel oxidation is collected and measured.
Abstract
Сила дрозофилы генетики все чаще применяется к вопросам сигнализации гормонов и обмена веществ , а также разработки моделей заболеваний человека в этом организме. Чувствительные методы измерения параметров, таких как метаболические ставки необходимы, чтобы вести понимание физиологии и болезней у мелких животных, таких как дрозофилы. Описанный здесь метод оценивает окисления топлива в небольшом количестве взрослых мух кормили пищей , содержащей следовые количества 14 C-меченых субстратов , таких как глюкоза или жирной кислоты. После периода кормления и каких – либо дополнительных экспериментальных манипуляций, мухи переносят на коротких трубок блокированы сетки, которые затем помещали в стеклянные флаконы , содержащие KOH-насыщенный фильтровальную бумагу, удерживающий выдыхаемом, меченный радиоактивным изотопом СО 2 , полученные от окисления радиоактивно меченных субстратов , как бикарбонат калия, КНСО 3. Этот метили бикарбонат измеряется с помощью сцинтилляционного счетчика. Это водный растворuantitative, воспроизводимые, и простой подход к изучению окисления топлива. Использование радиоактивной глюкозы, жирных кислот, или аминокислот позволяет определить вклад этих различных источников топлива для энергетического обмена в различных условиях, таких как кормление и постом и в разных генетических фонов. Это дополняет другие подходы , используемые для измерения в естественных условиях энергетического обмена и должно способствовать пониманию регуляции метаболизма.
Introduction
Работа в модельном организме дрозофилы внес значительный вклад в понимание генетических принципов, процессов развития, роста, старения, поведения, иммунитета и болезни человека 1,2. Несметное генетических и клеточных биологических подходов у дрозофилы наехал прогресса в этих областях. Тем не менее, исследование обмена веществ в плодовой мушки разработал более медленно, в значительной степени с трудностями в измерении метаболических параметров в таком маленьком животном. Интерес к использованию дрозофилы в качестве модели для изучения человеческих заболеваний , таких как диабет и для понимания вклада метаболизма и роста различных патологий подтолкнуло поле развивать и приспосабливать метаболические методы для этого организма 3,4.
Надежные методы теперь доступны для измерения ряда метаболических параметров в дрозофилы. Например, можно непосредственно оценить потребление пищи <sдо> 5, уровни триглицеридов и хранимых гликогена, а также циркулирующих уровней гемолимфы глюкозы и основной циркулирующий сахара в летучей, трегалоза, которая представляет собой дисахарид , состоящий из двух молекул глюкозы 4. Использование метаболических индикаторов позволило изучение поглощения питательных веществ из пищи и превращение поглощаемых питательных веществ , таких как глюкоза в гликоген форм хранения и триглицеридов 6. Метаболические показатели могут быть оценены в плодовой мухой посредством измерения потребления 7,8 кислорода и углекислого газа (CO 2) производства. Цикл лимонной кислоты окисляет двух углеродных единиц, которые могут войти в цикл как ацетил коэнзима А (СоА), который является производным от метаболизма пищевых углеводов и хранимых и жирных кислот. Каждый поворот цикла генерирует одну молекулу каждый из ГТФ (или АТФ) и донора электронов FADH 2, три молекулы НАДН и две молекулы продукта отходов CO 2. CO 2 производства можетможно использовать для оценки базальную скорость метаболизма. Общий объем производства CO 2 может быть определена количественно в дрозофилы посредством использования коммерчески доступных или ручной респирометров 9-10,11.
Измерение общего объема производства СО 2, особенно в сочетании с измерением потребления O 2, дает ценную информацию энергетического метаболизма всего тела. Тем не менее, эта мера не идентифицирует питательное вещество окисляется для аденозинтрифосфата (АТФ) производства. Три основных класса питательных веществ могут ввести лимонную цикл кислоты следующую превращение в ацетил-СоА: углеводы, жирные кислоты и белки. Глюкоза-6-фосфат, полученный из глюкозы или диетического сохраненной гликогена, могут быть преобразованы в пируват, который декарбоксилируют пируват-дегидрогеназы с образованием ацетил-КоА. Распределение жирных кислот, полученных из рациона или из хранимых триглицеридов выходом бета-окисления ацетил-КоА, который затем поступает в цикл лимонной кислоты. в заключение, Большинство аминокислот может войти в цикл лимонной кислоты в результате конверсии в пируват, ацетил-СоА-интермедиатов цикла или лимонной кислоты, такие как альфа-кетоглутаратом.
Питательный-конкретный вклад в энергетический метаболизм во время базальных и стимулированных условиях можно контролировать за счет использования радиоактивных индикаторов. Протокол , представленные здесь , адаптирован для использования в дрозофилы из протокола , используемого для оценки окисления в клетках , выращенных в культуре 12,13. При таком подходе, плодовые мушки питаются 14 C-радиоактивно метаболические субстраты (углеводы, жирные кислоты, или аминокислоты) в рационе в течение короткого промежутка (часов) или длинные (дни) пульс, чеканка на немаркированной пищу, а затем подвергается воздействию камеру , содержащую гидроксид калия (КОН) -насыщенным фильтровальную бумагу для улавливания выдыхаемого CO 2 как бикарбонат. Радиоактивной бикарбонат может быть определена количественно с помощью сцинтилляционного счетчика. Различия в радиоактивно-CO 2 производства между экспериментомтельные группы мух могут отражать использование различных видов топлива для производства АТФ по ходу длительного быстрых или внутренних различий в топливном обмене между генотипами, например.
Protocol
Representative Results
Discussion
Этот протокол описан способ измерения окисления специфических радиоактивно меченных субстратов во взрослой дрозофилы. Этот метод прост, количественное, воспроизводимым и чувствительным, и она дополняет существующие методы , которые измеряют общий СО 2 производства и потребления O 2 , так как он может быть использован для идентификации питательных веществ (а) окисляться для производства АТФ.
Измерение CO 2 освобождены от окисления специфических радиоактивно меченных субстратов с использованием метода , описанного здесь является дополнением к методам , которые измеряют общий объем производства СО 2. Общее СО 2 производства (V СО2) позволяет оценить скорость метаболизма и, когда общее потребление O 2 (V O 2 ) , как известно, скорость обмена веществ может быть рассчитана и источник топлива для окисления может быть оценена на основе соотношения дыхания обмена (V CO2 / V O2 = RER). когдауглеводы являются исключительной субстрат, RER = 1, но когда жирные кислоты являются единственным источником, RER = 0,7, вследствие стехиометрии реакции глюкозы и липидного окисления. При отсутствии оборудования для измерения потребления кислорода в Drosophila 14, окислительный источник топлива не может быть идентифицирован. Тем не менее, по маркировке мух с следовых количеств одного радиоактивного субстрата или другого и измерения уровня радиоактивной производства СО 2, можно сделать вывод о способности мух окислять данного субстрата в различные моменты времени в течение стимула или о эффектах учитывая мутацию на окисление топлива.
Есть целый ряд важных шагов в этом протоколе. Во-первых, следует соблюдать осторожность при использовании радиоактивных материалов, чтобы избежать утечек и загрязнения областей исследований. Во- вторых, когда обезболивающее мух на стадиях 2.1 и 3.4, экспериментатор должен работать быстро , чтобы избежать последствий длительного CO 2воздействие на метаболизм и поведение. Группа из 20 мух может быть под наркозом и переносили в новый флакон или в муху стручка в течение 20 сек или меньше. При переходе от анестезии аппарата во флакон пищи, флакон следует покоилась на его стороне, чтобы предотвратить анестезированных мух от застревания на поверхности пищи. Когда мухи кормят радиоактивно пищи в течение нескольких дней, как в шаге 2.2, экспериментатор должен убедиться, что пища не высыхает, как мухи чувствительны к обезвоживанию.
Подаваемый или голодали состояние до маркировки, выбор метки, период времени, обозначая, продолжительность времени, в летучей капсуле, и метод анестезии являются параметрами, которые могут быть подвергнуты устранению неисправностей и модификации при использовании этого метода. Во-первых, мух подвергали коротких периодов маркировки (2 – 3 ч) вряд ли будут потреблять значительные количества радиоактивной пищи, если не подвергается периода поста заранее. Во-вторых, выбор этикетки Cаффект выводы один способен привлечь около метаболических фенотипов. Например, меченный радиоактивным изотопом производства СО 2 из D- [1- 14 С] -глюкозы может отражать окисление через цикл лимонной кислоты , или пентозофосфатного шунта, в то время как меченного производства СО 2 из D- [6- 14 С] -глюкозы отражает окисление через цикл лимонной кислоты только 12,15,16. Кормление мух с радиоизотопный меченый атом для незаменимой аминокислоты 17,18 бы быть хорошей стратегией для оценки окисления аминокислот , полученных из белков. И, наконец, длительные периоды маркировки с радиоактивно меченным глюкозы также повышают возможность включения этого предшественника в другие классы молекул , таких как триглицериды 19 и аминокислоты , такие как аланин, который легко interconverts с пирувата. Это может быть оценена путем измерения радиоактивности входит в состав этих различных классов молекул 6. Действительно, отдельные когорты мух можно подавать радiolabeled субстратов тем же способом , а затем использовали для экспериментов муха стручка или измерение радиометки , которые хранятся и остается в гликоген и триглицеридов в накормлены и голодном условия 6, например. Другая стратегия состоит в том, чтобы использовать периоды короткого маркировки, которые могут выявить окисление меченых биологически активных питательных веществ себя, а не формы хранения этих питательных веществ. В- третьих, это также возможно , что две группы мух могут иметь одинаковые показатели 14 производства СО 2 в течение заданного промежутка времени, но очень разные ставки на начальном этапе. Таким образом, изменяя количество времени, который летит проводят в летучей капсуле может быть важным параметром для изменения при оценке фенотипической изменчивости. И, наконец, этот протокол предусматривает использование короткого периода CO 2 анестезии при тушении мух в стручок муха аппарата. Вполне возможно , что СО 2 анестезия может влиять на метаболические функции в течение эксперимента муха стручка. Чередоватьpproach является использование анестезии азота , который не влияет на скорость метаболизма 20.
Как и с любой техникой, которая измеряет такую сложную систему в качестве топлива окисления и скорости обмена веществ, описанный здесь метод имеет свои ограничения. Во- первых, вполне возможно , что пролетает в разных группах могут употреблять в пищу различные количества меченного пищи и , таким образом , будет входить в фазу сбора СО 2 из теста с различными исходными количествами субстрата. Это можно контролировать до некоторой степени, выполняя эксперимент с большими размерами выборки и кормления мух скопом. Для коротких периодов маркировки, мух с похожими голубой цвет кишки будет поглотил радиоактивную и могут быть перенесены в погоню части эксперимента. Количество радиоактивной оставшейся в группе мух также может быть измерена в конце эксперимента и в отдельных когорт мух после окончания кормления и начальный период чейза. Во-вторых, уровни активности междугруппы мух в летучей стручки могут отличаться. Это должны быть определены экспериментально и принимать во внимание при интерпретации данных. В- третьих, этот метод не измеряет общий объем производства СО 2, только производство из определенного диетического питательного вещества или формы хранения (ов) этого питательного вещества. Этот протокол не является заменой , но вместо этого является дополнением к измерениям VCO 2 , поскольку она обеспечивает различную и дополнительную информацию.
Описанный здесь метод измеряет выдыхаемый, радиоактивно CO 2 , который является продуктом окисления следовых количеств специфических метаболических субстратов. Изменяя используемой метки – глюкоза, жирные кислоты или аминокислоты – можно проектировать все более сложные эксперименты, чтобы оценить вклад различных субстратов метаболизма при различных физиологических условиях, таких как голодание и на разных генетических фонов. Будущие приложения этой методики включают измерение metabolisм в личиночной и куколки стадиях развития, две стадии жизненного цикла дрозофилы, которые характеризуются крайними хранения питательных веществ и распада, соответственно.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The author thanks Drs. Mingjian Lu and Morris Birnbaum for helpful advice and funding support from NIDDK (R21DK089391).
Materials
| PALMITIC ACID, [1-14C]-, 50 µCi | PerkinElmer | NEC075H050UC | |
| GLUCOSE, D-[6-14C]-, 50µCi | PerkinElmer | NEC045X050UC | |
| Glucose, D-[1-14C]-, 50µCi | PerkinElmer | NEC043X050UC | |
| Drosophila Vials, Narrow, Polystyrene | Genesee Scientific | 32-116 | |
| Round-Bottom Polypropylene Tubes, 12X75 mm | Fisher Scientific | 14-959AA | |
| Mesh, nitex nylon, 120 µm | Genesee Scientific | 57-102 | |
| 20ml borosilicate glass scintillation vials | Fisher Scientific | 03-337-15 | |
| Flask top stopper with off-center hole | Fisher Scientific | K882310-0000 | |
| Polypropylene center well | Fisher Scientific | K882320-0000 | |
| Whatman GF/B glass microfiber filter paper, circle, 2.1cm diameter | 09-874-20 | ||
| Ecoscint A | National Diagnostics | LS-273 | |
| 6ml Scintillation Vials with Push-On/Twist-Off Caps | National Diagnostics | SVC-06 |
References
- Wangler, M. F., Yamamoto, S., Bellen, H. J. Fruit flies in biomedical research. Genetics. 199 (3), 639-653 (2015).
- Bier, E. Drosophila, the golden bug, emerges as a tool for human genetics. Nat Rev Genet. 6 (1), 9-23 (2005).
- Owusu-Ansah, E., Perrimon, N. Modeling metabolic homeostasis and nutrient sensing in Drosophila: implications for aging and metabolic diseases. Dis Model Mech. 7 (3), 343-350 (2014).
- Tennessen, J. M., Barry, W. E., Cox, J., Thummel, C. S. Methods for studying metabolism in Drosophila. Methods. 68 (1), 105-115 (2014).
- Deshpande, S. A., Carvalho, G. B., et al. Quantifying Drosophila food intake: comparative analysis of current methodology. Nat methods. 11 (5), 535-540 (2014).
- Bland, M. L., Lee, R. J., Magallanes, J. M., Foskett, J. K., Birnbaum, M. J. AMPK supports growth in Drosophila by regulating muscle activity and nutrient uptake in the gut. Dev biol. 344 (1), 293-303 (2010).
- Hulbert, A. J., Clancy, D. J., Mair, W., Braeckman, B. P., Gems, D., Partridge, L. Metabolic rate is not reduced by dietary-restriction or by lowered insulin/IGF-1 signalling and is not correlated with individual lifespan in Drosophila melanogaster. Exp Geront. 39 (8), 1137-1143 (2004).
- Van Voorhies, W. A. Metabolic function in Drosophila melanogaster in response to hypoxia and pure oxygen. J. Exp. Biol. 212 (19), 3132-3141 (2009).
- Montooth, K. L., Marden, J. H., Clark, A. G. Mapping determinants of variation in energy metabolism, respiration and flight in Drosophila. Genetics. 165 (2), 623-635 (2003).
- Yatsenko, A. S., Marrone, A. K., Kucherenko, M. M., Shcherbata, H. R. Measurement of metabolic rate in Drosophila using respirometry. JoVE. (88), e51681 (2014).
- Icreverzi, A., de la Cruz, A. F., Van Voorhies, W. A., Edgar, B. A. Drosophila cyclin D/Cdk4 regulates mitochondrial biogenesis and aging and sensitizes animals to hypoxic stress. Cell cycle. 11 (3), 554-568 (2012).
- Tuttle, S., Muschel, R., Bernhard, E., McKenna, W. G., Biaglow, J. Decreased ability of cells overexpressing MYC proteins to reduce peroxide and hydroperoxides. Br J Cancer. 27, 140-144 (1996).
- Ontko, J. A., Jackson, D. Factors affecting the rate of oxidation of fatty acids in animal tissues. Effect of substrate concentration, pH, and coenzyme a in rat liver preparations. J Biol Chem. 239, 3674-3682 (1964).
- Vincent, A., Briggs, L., et al. parkin-induced defects in neurophysiology and locomotion are generated by metabolic dysfunction and not oxidative stress. Hum Mol Gen. 21 (8), 1760-1769 (2012).
- Katz, J., Abraham, S., Hill, R., Chaikoff, I. L. The occurrence and mechanism of the hexose monophosphate shunt in rat liver slices. J Biol Chem. 214 (2), 853-868 (1955).
- Katz, J., Wood, H. G. The use of glucose-C14 for the evaluation of the pathways of glucose metabolism. J Biol Chem. 235 (8), 2165-2177 (1960).
- Piper, M. D. W., Blanc, E., et al. A holidic medium for Drosophila melanogaster. Nat methods. 11 (1), 100-105 (2014).
- Sang, J. H., King, R. C. Nutritional Requirements of Axenically Cultured Drosophila Melanogaster Adults. J Exp Biol. , (1961).
- Chernick, S. S., Chaikoff, I. L. Insulin and hepatic utilization of glucose for lipogenesis. J Biol Chem. 186 (2), 535-542 (1950).
- Van Voorhies, W. A., Khazaeli, A. A., Curtsinger, J. W. Testing the “rate of living” model: further evidence that longevity and metabolic rate are not inversely correlated in Drosophila melanogaster. J Appl Phys. 97 (5), 1915-1922 (2004).
