Die Messung der Kohlendioxidproduktion von Radiolabeled Substrate in<em> Drosophila melanogaster</em
Summary
This paper describes a method for the measurement of fuel oxidation in Drosophila melanogaster in which trace amounts of specific radiolabeled metabolic substrates are fed to flies. The exhaled radiolabeled CO2 that is a produced from fuel oxidation is collected and measured.
Abstract
Die Kraft der Drosophila Genetik wird zunehmend auf die Fragen der Hormon Signalisierungs- und Metabolismus und der Entwicklung von Modellen der menschlichen Krankheit in diesem Organismus angewendet. Empfindliche Verfahren für die Messung von Parametern, wie Stoffwechselraten sind erforderlich, um das Verständnis der Physiologie und Krankheiten bei Kleintieren wie der Fruchtfliege zu fahren. Das hier beschriebene Verfahren bewertet Brennstoffoxidation in einer kleinen Anzahl von erwachsenen Fliegen gefüttert Lebensmittel , die Spurenmengen von 14 C-markierten Substraten , wie beispielsweise Glucose oder Fettsäure. Nach der Fütterungszeit und zusätzliche experimentelle Manipulationen sind Fliegen kurze Rohre mit Mesh – capped übertragen, die in Glasfläschchen dann platziert werden , enthaltend KOH-gesättigtem Filterpapier , das Fallen abgeatmet, 2 radioaktiv markiertem CO aus der Oxidation von radiomarkierten Substraten wie Kaliumbicarbonat erzeugt, 3 KHCO. Diese radiomarkierten Bicarbonat wird durch Szintillationszählung gemessen. Dies ist aqengen, reproduzierbaren und einfachen Ansatz für die Untersuchung der Brennstoffoxidation. Die Verwendung von radiomarkierten Glucose, Fettsäuren oder Aminosäuren erlaubt die Bestimmung des Beitrags dieser verschiedenen Energiequellen zu den Energiestoffwechsel unter verschiedenen Bedingungen wie Fütterung und Fasten und in verschiedenen genetischen Hintergründen. Dies ergänzt andere Ansätze in vivo Energiestoffwechsel zu messen und sollte das Verständnis der Stoffwechselregulation fördern.
Introduction
Die Arbeit im Modellorganismus Drosophila melanogaster hat wesentlich zum Verständnis der genetischen Prinzipien beigetragen, Entwicklungsprozesse, Wachstum, Alterung, Verhalten, Immunität und Krankheit beim Menschen 1,2. Eine Vielzahl von genetischen und zellbiologische Ansätze in Drosophila hat Fortschritte in diesen Bereichen angetrieben. Jedoch hat die Untersuchung des Stoffwechsels in der Fruchtfliege in Messstoffwechselparameter in einer so kleinen Tier langsamer, was zum großen Teil zu Schwierigkeiten entwickelt. Das Interesse an der Verwendung von Drosophila als Modell zur Untersuchung von menschlichen Krankheiten wie Diabetes und für das Verständnis der Beiträge des Stoffwechsels zu Wachstum und verschiedenen Pathologien hat das Feld geschoben zu entwickeln und metabolische Techniken für diesen Organismus 3,4 anzupassen.
Zuverlässige Methoden sind nun für die Messung einer Reihe von Stoffwechselparametern in der Fruchtfliege erhältlich. Zum Beispiel ist es einfach, die Nahrungsaufnahme zu beurteilen <sbis> 5, Ebenen gespeichert Triglyceriden und Glykogen, sowie zirkulierende Hämolymphe Glukosespiegel und dem Hauptzirkulations Zucker in der Fliege, Trehalose, die ein Disaccharid aus zwei Molekülen Glucose 4 zusammengesetzt ist. Verwendung von Stoffwechsel Tracer hat das Studium der Nährstoffaufnahme aus der Nahrung und der Umwandlung der absorbierten Nährstoffen, wie Glucose , um die Speicherformen Glykogen und Triglyceriden 6 aktiviert. Metabolic Raten können in der Taufliege durch die Messung des Sauerstoffverbrauchs 7,8 und Kohlendioxid (CO 2) Produktion beurteilt werden. Der Zitronensäurezyklus oxydiert zwei Kohlenstoffeinheiten, die den Zyklus als Acetyl-Coenzym A (CoA) eingeben können, die aus dem Stoffwechsel der diätetischen und gespeicherten Kohlenhydraten und Fettsäuren abgeleitet ist. Jede Runde des Zyklus erzeugt ein Molekül jedes von GTP (oder ATP) und den Elektronendonor FADH 2, drei Moleküle von NADH, und zwei Moleküle des Abfallproduktes CO 2. CO 2 -Produktion könnenabzuschätzen Grundumsatz verwendet werden. Gesamt – CO 2 -Produktion kann in Drosophila durch die Verwendung von im Handel erhältlichen oder handgemachten Respirometer 9-10,11 quantifiziert werden.
Die Messung der gesamten CO 2 -Produktion, vor allem wenn sie mit Messung von O 2 -Verbrauch liefert wertvolle Einblicke in die Ganzkörper – Energie – Stoffwechsel. Allerdings ist diese Maßnahme nicht den Nährstoff identifizieren wird für Adenosintriphosphat (ATP) Produktion oxidiert. Drei Hauptklassen von Nährstoffen können die Zitronensäure-Zyklus nach der Umstellung geben zu Acetyl-CoA: Kohlenhydrate, Fettsäuren und Proteinen. Glucose-6-Phosphat, abgeleitet von Nahrungs Glucose oder Glycogen gespeichert, kann zu Pyruvat umgewandelt werden, die durch Pyruvat-Dehydrogenase decarboxyliert Acetyl-CoA zu bilden. Aufteilung der Fettsäuren aus der Nahrung stammen oder aus gespeicherten Triglyzeride durch ß-Oxidation Ausbeuten Acetyl-CoA, die dann den Zitronensäure-Zyklus eintritt. Endlicheine Mehrheit von Aminosäuren, die Zitronensäure-Zyklus nach der Umstellung zu Pyruvat, Acetyl-CoA oder Zitronensäurezyklus Zwischenprodukte wie Alphaketoglutarat eingeben.
Nährstoff spezifischen Beitrag zur Energiestoffwechsel während der basalen und stimulierten Bedingungen kann durch die Verwendung von radioaktiven Tracern überwacht werden. Das Protokoll hier präsentiert wird zur Verwendung in Drosophila von einem Protokoll zur Beurteilung Oxidation in Zellen in Kultur gezüchtet 12,13 verwendet angepasst. Bei diesem Ansatz Fruchtfliegen gefüttert werden 14 C-radiomarkierten metabolischen Substrate (Kohlenhydrate, Fettsäuren oder Aminosäuren) in der Ernährung für eine kurze (Stunden) oder lang (Tage) Puls, auf unmarkierten Lebensmittel gejagt, und dann zu einem exponierten Kammer zum Einfangen der ausgeatmeten CO 2 als Bicarbonat Kaliumhydroxid (KOH) -gesättigtes Filterpapier enthält. Radioaktiv markiertes Bicarbonat kann durch Scintillationszählung quantifiziert werden. Unterschiede in der radiomarkierten-CO 2 -Produktion zwischen Experimental Gruppen von Fliegen können die Verwendung von verschiedenen Brennstoffen für die ATP-Produktion im Laufe eines längeren schnell oder intrinsische Unterschiede in der Kraftstoffmetabolismus zwischen Genotypen, zum Beispiel reflektieren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Oxidation von spezifischen radiomarkierten Substraten in erwachsenen Drosophila melanogaster zu messen. Diese Technik ist einfach, quantitative, reproduzierbare und empfindlich, und es ergänzt die bestehenden Methoden , die Gesamt – CO 2 -Produktion und O 2 Verbrauch messen , weil sie verwendet werden , können die Nährstoff (s) zur ATP – Produktion oxidiert zu identifizieren.
Die Messung von CO 2 aus der Oxidation von spezifischen radiomarkierten Substrate befreiten das hier beschriebene Verfahren unter Verwendung von komplementär zu Techniken , die Gesamt – CO 2 -Produktion messen. Gesamt – CO 2 -Produktion (V CO2) ermöglicht Abschätzung der Stoffwechselrate und, wenn die Gesamt O 2 -Verbrauch (V O2) bekannt ist, kann die Stoffwechselrate zu berechnen und die Kraftstoffquelle für die Oxidation geschätzt auf das Atmungsaustauschverhältnis basieren kann (V CO2 / V O2 = RER). WannKohlenhydrate sind ausschließliches Substrat, RER = 1, aber wenn Fettsäuren sind die ausschließliche Quelle, RER = 0,7, auf die Stöchiometrie der Reaktionen von Glucose und Lipidoxidation aufgrund. In Abwesenheit von Geräten Sauerstoffverbrauch in Drosophila 14 die oxidative Brennstoffquelle identifiziert werden können , nicht zu messen. Jedoch durch Kennzeichnung mit Spuren von einem radioaktiven Substrat oder einem anderen und Messraten von radiomarkiertem CO 2 -Produktion fliegt, kann man Rückschlüsse auf die Fähigkeit von Fliegen zeichnen einem gegebenen Substrat zu verschiedenen Zeitpunkten während eines Reizes oder über die Auswirkungen einer zu oxidieren Mutation auf Brennstoffoxidation gegeben.
Es gibt eine Reihe von kritischen Schritte in diesem Protokoll. Zunächst sollte darauf geachtet werden, wenn radioaktive Stoffe unter Verwendung von Leckagen und Verschmutzung von Forschungsbereichen zu vermeiden. Zweitens, wenn Fliegen während der Schritte 2.1 und 3.4 anesthetizing, sollte der Experimentator arbeiten schnell 2 Auswirkungen einer lang anhalt CO zu vermeidenBelichtung auf den Stoffwechsel und das Verhalten. Eine Gruppe von 20 Fliegen können anästhesiert und in ein neues Fläschchen oder in eine Fliege pod in 20 s oder weniger übertragen werden. Wenn Sie von einem Narkosegerät auf ein Lebensmittel Fläschchen übertragen, sollte das Fläschchen auf seiner Seite ausgeruht zu betäubten Fliegen verhindern, dass auf der Lebensmitteloberfläche stecken zu bleiben. Wenn Fliegen gefüttert radiomarkierten Nahrung im Laufe von mehreren Tagen, wie in Schritt 2.2 sind, sollte der Experimentator zu versichern, dass das Essen nicht austrocknet wie Fliegen empfindlich gegen Austrocknung sind.
Das zugeführte oder nüchternen Zustand vor der Markierung, die Wahl des Etiketts, die Länge der Markierungszeit, die Zeitdauer, in der Flug pod, und die Methode der Anästhesie sind Parameter, die zur Fehlerbehebung und Modifikation unterzogen werden kann, wenn mit dieser Technik. Zunächst fliegt kurze Beschriftungszeiten unterworfen (2 – 3 h) sind keine wesentlichen Mengen an radiomarkiertem Lebensmittel zu konsumieren, es sei denn, vorher einer Fastenperiode ausgesetzt. Zweitens, die Wahl der Markierung ceinen Einfluss auf die Schlussfolgerungen einer ist in der Lage über metabolische Phänotypen zu ziehen. Zum Beispiel reflektiert radiomarkierten CO 2 -Produktion von D- [1- 14 C] -Glucose Oxidation durch den Zitronensäurezyklus oder der Pentosephosphat- Shunt, während radioaktiv markiertem CO 2 -Produktion von D- reflektieren kann [6- 14 C] -Glucose Oxidation durch den Zitronensäure – Zyklus nur 12,15,16. Feeding Fliegen mit einer radioaktiv markierten Tracer für eine essentielle Aminosäure 17,18 wäre eine gute Strategie sein , aus Proteinen abgeleitet Oxidation von Aminosäuren zu bewerten. Schließlich langen Markierungsperioden mit radioaktiv markierter Glukose auch die Möglichkeit des Einbaus dieses Vorläufers in andere Klassen von Molekülen wie Triglyceride 19 und Aminosäuren zu erhöhen , wie beispielsweise Alanin, die leicht mit Pyruvat Knotens ineinander. Dies kann durch die Radioaktivität in diesen verschiedenen Klassen von Molekülen 6 eingebaut Messung bewertet werden. Tatsächlich getrennten Kohorten von Fliegen können gefüttert rad werdeniolabeled Substrate in der gleichen Weise , und dann für das Fliegen pod Experimente oder die Messung von radioaktiven Marker verwendet , die gespeichert ist , und bleibt in Glykogen und Triglyceriden im fed und fasteten Bedingungen 6, zum Beispiel. Eine andere Strategie ist kurz Kennzeichnung Perioden zu verwenden, die wahrscheinlich die Oxidation der radiomarkierten Nahrung Nährstoffe zu offenbaren sich und nicht die Speicherformen dieser Nährstoffe. Drittens ist es auch möglich , dass zwei Gruppen von Fliegen identischen Raten von 14 CO 2 -Produktion über eine bestimmte Zeit haben könnte, aber sehr unterschiedlichen Raten zunächst. Daher die Variation der Menge an Zeit vergeht in der Flug pod ausgeben kann ein wichtiger Parameter zu ändern, wenn phänotypische Variation der Beurteilung. Schließlich ruft dieses Protokoll für die Verwendung eines kurzen Zeitraums von CO 2 Anästhesie bei Fliegen in die Fliegen pod Vorrichtung setzen. Es ist möglich , dass die CO 2 Anästhesie Stoffwechselfunktion im Verlauf der Flug pod Experiment beeinflussen können. Eine alternative einNSATZ Stickstoff Anästhesie verwendet werden, die nicht mehr als 20 metabolische Rate nicht beeinträchtigt.
Wie bei jeder Technik, die ein solch komplexes System als Brennstoff Oxidation und metabolische Rate hat hier beschrieben, wobei das Verfahren Einschränkungen misst. Erstens ist es möglich , die in verschiedenen Gruppen fliegt unterschiedliche Mengen an radiomarkiertem Nahrungsmittel verbrauchen könnte und damit die CO 2 Sammelphase des Assays mit unterschiedlichen Ausgangsmengen Substrat würde ein. Dies kann zu einem gewissen Grad gesteuert werden, indem das Experiment mit großen Probengrößen durchführen und von Fliegen en masse füttern. Für kurze Beschriftungszeiten, fliegt mit ähnlichen blaugefärbte Mumm die radioaktive Markierung verbraucht haben und können sich auf die Jagd Teil des Experiments durchgeführt werden. Die Menge an radioaktiver Markierung in einer Gruppe von Fliegen übrigen kann auch am Ende des Versuchs und in getrennten Kohorten von Fliegen nach dem Ende der Zuführ- und Anfangs chase Periode gemessen werden. Zweitens sind die Aktivitätswerte zwischenGruppen von Fliegen in den Fliegenhülsen unterscheiden. Dies wird experimentell und berücksichtigt bestimmt werden, wenn die Daten zu interpretieren. Drittens ist diese Technik nicht die gesamte CO 2 -Produktion zu messen, nur die Produktion von einem bestimmten Nahrungs Nährstoff oder die Speicherform (en) dieser Nährstoff. Dieses Protokoll ist kein Ersatz für sondern komplementär zu Messungen des VCO 2 , weil es unterschiedliche und zusätzliche Informationen zur Verfügung stellt.
Das hier beschriebene Verfahren misst ausgeatmeten, radiomarkierten CO 2 , die ein Produkt der Oxidation von Spurenmengen von spezifischen metabolischen Substraten ist. Durch Variieren der verwendeten Markierung – Glucose, Fettsäure oder Aminosäure – kann man immer raffiniertere Experimente entwerfen, um die Beiträge verschiedener Substrate Metabolismus unter verschiedenen physiologischen Bedingungen, wie Hunger und auf verschiedenen genetischen Hintergründen zu beurteilen. Zukünftige Anwendungen dieser Technik sind die Messung von metabolism in die Larven- und Puppenstadien der Entwicklung, zwei Stufen des Drosophila – Lebenszyklus , die durch extreme Nährstoffspeicherung und Abbau auszeichnen, respectively.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The author thanks Drs. Mingjian Lu and Morris Birnbaum for helpful advice and funding support from NIDDK (R21DK089391).
Materials
| PALMITIC ACID, [1-14C]-, 50 µCi | PerkinElmer | NEC075H050UC | |
| GLUCOSE, D-[6-14C]-, 50µCi | PerkinElmer | NEC045X050UC | |
| Glucose, D-[1-14C]-, 50µCi | PerkinElmer | NEC043X050UC | |
| Drosophila Vials, Narrow, Polystyrene | Genesee Scientific | 32-116 | |
| Round-Bottom Polypropylene Tubes, 12X75 mm | Fisher Scientific | 14-959AA | |
| Mesh, nitex nylon, 120 µm | Genesee Scientific | 57-102 | |
| 20ml borosilicate glass scintillation vials | Fisher Scientific | 03-337-15 | |
| Flask top stopper with off-center hole | Fisher Scientific | K882310-0000 | |
| Polypropylene center well | Fisher Scientific | K882320-0000 | |
| Whatman GF/B glass microfiber filter paper, circle, 2.1cm diameter | 09-874-20 | ||
| Ecoscint A | National Diagnostics | LS-273 | |
| 6ml Scintillation Vials with Push-On/Twist-Off Caps | National Diagnostics | SVC-06 |
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