Meting van de productie van koolstofdioxide uit Radioactief gemerkt Substrates in<em> Drosophila melanogaster</em
Summary
This paper describes a method for the measurement of fuel oxidation in Drosophila melanogaster in which trace amounts of specific radiolabeled metabolic substrates are fed to flies. The exhaled radiolabeled CO2 that is a produced from fuel oxidation is collected and measured.
Abstract
De kracht van Drosophila genetica wordt steeds vaker toegepast bevat hormoon signalering en metabolisme en de ontwikkeling van modellen van menselijke ziekte in dit organisme. Gevoelige methoden voor metingen van parameters zoals stofwisseling nodig zijn begrip van de fysiologie en ziekte bij kleine dieren drijven zoals de fruitvlieg. De hier beschreven methode beoordeelt brandstof oxidatie in kleine aantallen volwassen vliegen gevoed levensmiddelen die sporen van 14 C-gelabelde substraten zoals glucose en vetzuren. Na de voertijd en eventuele aanvullende experimentele manipulaties zijn vliegen overgebracht in korte buizen afgedekt met gaas, dat vervolgens in glazen flesjes die KOH-verzadigde filterpapier die vallen uitgeademd worden geplaatst, radiolabeled CO 2 gegenereerd door oxidatie van radioactief gemerkte substraten kaliumbicarbonaat, KHCO3. Dit radiolabeled bicarbonaat wordt gemeten door scintillatietelling. Dit is aqKWANTITATIEVE, reproduceerbare en eenvoudige benadering voor de studie van de brandstof oxidatie. Het gebruik van radioactief gelabeld glucose, vetzuren of aminozuren maakt bepaling van de bijdrage van deze verschillende brandstoffen naar energiemetabolisme onder verschillende omstandigheden, zoals voeding en vasten en in verschillende genetische achtergronden. Dit vormt een aanvulling op andere benaderingen gebruikt om te meten in vivo energiemetabolisme en moet het begrijpen van metabole regulatie bevorderen.
Introduction
Werkzaamheden in het modelorganisme Drosophila melanogaster heeft sterk bijgedragen tot het begrijpen van de genetische principes, ontwikkelingsprocessen, groei, veroudering, gedrag, immuniteit en menselijke ziekte 1,2. Een groot aantal genetische en celbiologische benaderingen in Drosophila heeft vooruitgang gereden op deze gebieden. Echter, heeft het onderzoek van het metabolisme in de fruitvlieg langzamer ontwikkeld, grotendeels het gevolg van moeilijkheden bij het meten van metabole parameters in zo'n klein dier. De belangstelling voor het gebruik Drosophila als model voor het bestuderen van humane ziekten zoals diabetes en voor het begrijpen van de bijdrage van metabolisme tot groei en diverse pathologieën heeft het veld te ontwikkelen en metabole technieken aan te passen voor dit organisme 3,4 geduwd.
Betrouwbare methoden zijn beschikbaar voor het meten van een aantal metabole parameters in de fruitvlieg. Zo is het eenvoudig om voedselinname te beoordelen <sup> 5, niveaus van opgeslagen triglyceriden en glycogeen, en hemolymfe circulerende niveaus van glucose en de belangrijkste circulerende suiker in de vlieg, trehalose, een disaccharide bestaande uit twee moleculen glucose 4. Gebruik van metabole tracers heeft de studie van voedingsopname van de voeding en de omzetting van geabsorbeerde voedingsstoffen nodig zoals glucose de opslagvormen glycogeen en triglyceriden 6. Stofwisseling kan in de fruitvlieg door het meten van het zuurstofverbruik 7,8 en kooldioxide (CO 2) de productie worden beoordeeld. De citroenzuurcyclus oxideert twee-koolstof eenheden die de cyclus acetyl coenzyme A (CoA), die is afgeleid van het metabolisme van dieet en opgeslagen koolhydraten en vetzuren kunnen invoeren. Elke omwenteling van de cyclus maakt een molecuul elk van GTP (ATP) en de elektronendonor FADH 2, drie moleculen NADH en twee moleculen van het afvalproduct CO 2. CO 2 productie kanworden gebruikt voor het basaal metabolisme te schatten. Totale CO 2 productie kan worden gekwantificeerd in Drosophila door gebruik van commercieel verkrijgbare of handgemaakte respirometers 9-10,11.
Het meten van de totale CO 2 productie, vooral in combinatie met meting van O2 consumptie, verschaft waardevolle inzichten in het gehele lichaam energiemetabolisme. Echter, deze maatregel niet de nutriënt identificeren wordt geoxideerd voor adenosine trifosfaat (ATP) productie. koolhydraten, vetzuren en eiwitten: drie belangrijkste categorieën van voedingsstoffen kan de citroenzuurcyclus na conversie naar acetyl CoA te voeren. Glucose-6-fosfaat, afgeleid van de voeding glucose of glycogeen opgeslagen, kan worden omgezet in pyruvaat, dat wordt gedecarboxyleerd door pyruvaat dehydrogenase acetyl CoA. Afbraak van vetzuren afkomstig uit de voeding of uit opgeslagen triglyceriden door ß-oxidatie levert acetyl CoA die vervolgens komt in de citroenzuurcyclus. EindelijkEen meerderheid van de aminozuren kan de citroenzuurcyclus volgende omzetting in pyruvaat, acetyl CoA of citroenzuur cyclus tussenproducten zoals alfa-ketoglutaraat.
Nutrient-specifieke bijdrage aan energiemetabolisme tijdens basale en gestimuleerde omstandigheden kan worden gemonitord met behulp van radioactieve tracers. De hier gepresenteerde protocol is aangepast voor gebruik in Drosophila van een protocol voor oxidatie in cellen in kweek 12,13 beoordelen. In deze benadering, fruitvliegen gevoed 14 C-radiolabeled metabole substraten (koolhydraten, vetzuren of aminozuren) in het dieet voor een korte (uren) of lange (dagen) puls, achtervolgd op ongelabelde voedsel, en vervolgens blootgesteld aan een kamer die kalium hydroxide (KOH) -verzadigde papieren filter voor het vangen van uitgeademde CO 2 als bicarbonaat. Radiolabeled bicarbonaat kan worden gekwantificeerd door scintillatietelling. Verschillen in radioactief gemerkt-CO 2-productie tussen experimental groepen ongedierte gebruik van verschillende brandstoffen ATP productie in de loop van een langdurige snelle of intrinsieke verschillen in brandstof metabolisme tussen genotypen, bijvoorbeeld weerspiegelen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit protocol beschrijft een werkwijze voor het meten van de oxidatie van specifieke radioactief gemerkte substraten in volwassen Drosophila melanogaster. Deze techniek is eenvoudig kwantitatieve, reproduceerbare en gevoelige en vult het bestaande methoden de totale CO 2 productie en O 2 verbruik te meten omdat het kan worden gebruikt om de nutriënt (en) wordt geoxideerd ATP productie te identificeren.
Meting van CO2 vrijgemaakt uit de oxidatie van specifieke radioactief gemerkte substraten als hier beschreven is complementair aan technieken totale CO 2 productie te meten. Totale CO 2 productie (V CO2) maakt schatting van metabolisme en bij totale O2 verbruik (V O2) bekend is, kan de stofwisseling berekend en wordt de brandstof voor oxidatie kan worden geschat op basis van de respiratoire ruilverhouding (V CO2 / V O2 = RER). Wanneerkoolhydraten zijn de exclusieve substraat RER = 1, maar wanneer vetzuren zijn de enige bron, RER = 0,7, vanwege de stoechiometrie van de reactie van glucose en lipiden oxidatie. Aangezien apparatuur zuurstofverbruik in Drosophila 14 te meten, kan de oxidatieve brandstof niet worden geïdentificeerd. Echter, door labeling vliegt met sporen van een radioactief substraat of andere en meten van snelheden van radiolabeled CO 2 productie, kan men conclusies trekken over de mogelijkheid van vliegen naar een bepaald substraat op verschillende tijdstippen oxideren tijdens een stimulus of de effecten van een gegeven mutatie op brandstof oxidatie.
Er zijn een aantal kritische stappen in dit protocol. In de eerste plaats moet erop worden gelet bij het gebruik van radioactieve stoffen te morsen en verontreiniging van onderzoeksgebieden te voorkomen. Ten tweede, als verlamming vliegen tijdens de stappen 2.1 en 3.4, de experimentator moet snel werken om effecten van langdurige CO 2 te voorkomenexposure op de stofwisseling en het gedrag. Een groep van 20 vliegen worden verdoofd en overgebracht naar een nieuw flesje of in een vlieg pad in 20 seconden of minder. Wanneer overgebracht van een narcose apparaat aan een levensmiddel flacon, moet de flacon worden rustte op zijn kant om te voorkomen dat verdoofde vliegen vast komen te zitten op het voedsel oppervlak. Bij vliegen worden gevoed radioactief gemerkt voedsel in de loop van enkele dagen als in stap 2.2, moet de onderzoeker te verzekeren dat het voedsel niet uitdroogt hemelsbreed zijn gevoelig voor uitdroging.
De gevoede of nuchtere toestand voorafgaand aan de etikettering, de keuze van het label, de lengte van de etikettering van de tijd, de tijd in de vlieg pod, en de wijze van verdoving zijn parameters die kunnen worden onderworpen aan het oplossen van problemen en aanpassen bij het gebruik van deze techniek. Eerst, vliegen onderworpen aan korte perioden labeling (2-3 uur) geen wezenlijke hoeveelheden radioactief gemerkte voedsel consumeren tenzij onderworpen aan een vastenperiode vooraf. Ten tweede, de keuze van het label ceen invloed hebben op de conclusies is men in staat te stellen over metabole fenotypes. Bijvoorbeeld radiolabeled CO 2 productie van D- [1- 14C] glucose oxidatie kan via de citroenzuurcyclus of de pentosefosfaat shunt reflecteren, terwijl radiolabeled CO 2 productie van D- [6- 14C] glucose oxidatie weerspiegelt via de citroenzuurcyclus alleen 12,15,16. Toevoeren vliegen met een radioactief gemerkte tracer voor een essentieel aminozuur 17,18 zou een goede strategie voor het beoordelen oxidatie van aminozuren afgeleid van eiwitten. Tenslotte langdurig labelen met radioactief gemerkt glucose ook de mogelijkheid van opneming van deze precursor verhogen in andere klassen van moleculen zoals triglyceriden 19 en aminozuren zoals alanine, die gemakkelijk interconverts met pyruvaat. Dit kan worden bepaald door het meten van radioactiviteit ingebouwd in de verschillende klassen van moleculen 6. Inderdaad kunnen aparte cohorten vliegen worden gevoed radiolabeled substraten op dezelfde wijze en vervolgens gebruikt voor vlieg pod experimenten of meting van radiolabel die is opgeslagen en blijft in glycogeen en triglyceriden bij voeden als bij vasten 6, bijvoorbeeld. Een andere strategie is om korte periodes labeling die waarschijnlijk oxidatie van het radioactief gemerkte voedingsstoffen zelf en niet opslagvormen van deze voedingsstoffen bekend zijn gebruikt. Ten derde is het ook mogelijk dat twee groepen vliegen identieke snelheden van 14 CO 2 productie gedurende een bepaalde tijd, maar zeer uiteenlopende snelheid initieel kan hebben. Derhalve variëren van de hoeveelheid tijd die vliegt door in de vlieg pod kan een belangrijke parameter te wijzigen bij de beoordeling van fenotypische variatie. Ten slotte is dit protocol vraagt om het gebruik van een korte periode van CO 2 anesthesie bij het aantrekken vliegen in de vlieg pod apparaat. Het is mogelijk dat de CO 2 anesthesie metabolische functie kan beïnvloeden in de loop van de vlieg pod experiment. Een alternatieve eenAANPAK is om stikstof narcose die geen invloed heeft op de stofwisseling 20 gebruiken.
Zoals met elke techniek die een dergelijk complex systeem als brandstof oxidatie en stofwisseling meet de hier beschreven werkwijze heeft beperkingen. Ten eerste is het mogelijk dat vliegt in verschillende groepen kunnen verschillende hoeveelheden radioactief gemerkt voedsel consumeren en zou dus de CO 2 verzamelfase van de assay te gaan met verschillende uitgangsposities hoeveelheden substraat. Dit kan voor het tot op zekere hoogte worden gecontroleerd door het uitvoeren van het experiment met grote steekproeven en door het voeren van vliegen en masse. Voor korte periodes labeling, vliegt met vergelijkbare blauw gekleurde lef het radiolabel zal verbruikt hebben en kunnen zich aan de jacht deel van het experiment worden uitgevoerd. De resterende hoeveelheid in een groep vliegen radiolabel kan worden gemeten aan het eind van het experiment en in afzonderlijke cohorten vliegen na afloop van de voeding en de eerste uitwasperiode. Ten tweede, de activiteit tussengroepen van vliegen in de vlieg peulen kunnen verschillen. Dit moet proefondervindelijk worden bepaald en in aanmerking worden genomen bij het interpreteren van data. Ten derde, is deze techniek niet gemeten totale CO 2 productie, maar de productie van een bepaalde voedingsstof of de opslag vorm (s) van deze voedingsstof. Dit protocol is geen vervanging van maar een aanvulling op de metingen van VCO 2 omdat het verschillende en aanvullende informatie.
De hier beschreven methode meet uitgeademd, radiolabeled CO 2 die een product van de oxidatie van sporenhoeveelheden specifieke metabolische substraten. Door het variëren van het etiket – glucose, vetzuren of aminozuren – men steeds geavanceerdere experimenten de bijdragen van verschillende substraten metabolisme onder verschillende fysiologische omstandigheden, zoals honger en verschillende genetische achtergronden beoordelen ontwerpen. Toekomstige toepassingen van deze techniek omvatten meting van metabolism in het larvale en popstadium ontwikkelingsfasen twee fasen van de levenscyclus Drosophila die worden gekenmerkt door extreme nutriënt opslag en analyse, respectievelijk.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The author thanks Drs. Mingjian Lu and Morris Birnbaum for helpful advice and funding support from NIDDK (R21DK089391).
Materials
| PALMITIC ACID, [1-14C]-, 50 µCi | PerkinElmer | NEC075H050UC | |
| GLUCOSE, D-[6-14C]-, 50µCi | PerkinElmer | NEC045X050UC | |
| Glucose, D-[1-14C]-, 50µCi | PerkinElmer | NEC043X050UC | |
| Drosophila Vials, Narrow, Polystyrene | Genesee Scientific | 32-116 | |
| Round-Bottom Polypropylene Tubes, 12X75 mm | Fisher Scientific | 14-959AA | |
| Mesh, nitex nylon, 120 µm | Genesee Scientific | 57-102 | |
| 20ml borosilicate glass scintillation vials | Fisher Scientific | 03-337-15 | |
| Flask top stopper with off-center hole | Fisher Scientific | K882310-0000 | |
| Polypropylene center well | Fisher Scientific | K882320-0000 | |
| Whatman GF/B glass microfiber filter paper, circle, 2.1cm diameter | 09-874-20 | ||
| Ecoscint A | National Diagnostics | LS-273 | |
| 6ml Scintillation Vials with Push-On/Twist-Off Caps | National Diagnostics | SVC-06 |
References
- Wangler, M. F., Yamamoto, S., Bellen, H. J. Fruit flies in biomedical research. Genetics. 199 (3), 639-653 (2015).
- Bier, E. Drosophila, the golden bug, emerges as a tool for human genetics. Nat Rev Genet. 6 (1), 9-23 (2005).
- Owusu-Ansah, E., Perrimon, N. Modeling metabolic homeostasis and nutrient sensing in Drosophila: implications for aging and metabolic diseases. Dis Model Mech. 7 (3), 343-350 (2014).
- Tennessen, J. M., Barry, W. E., Cox, J., Thummel, C. S. Methods for studying metabolism in Drosophila. Methods. 68 (1), 105-115 (2014).
- Deshpande, S. A., Carvalho, G. B., et al. Quantifying Drosophila food intake: comparative analysis of current methodology. Nat methods. 11 (5), 535-540 (2014).
- Bland, M. L., Lee, R. J., Magallanes, J. M., Foskett, J. K., Birnbaum, M. J. AMPK supports growth in Drosophila by regulating muscle activity and nutrient uptake in the gut. Dev biol. 344 (1), 293-303 (2010).
- Hulbert, A. J., Clancy, D. J., Mair, W., Braeckman, B. P., Gems, D., Partridge, L. Metabolic rate is not reduced by dietary-restriction or by lowered insulin/IGF-1 signalling and is not correlated with individual lifespan in Drosophila melanogaster. Exp Geront. 39 (8), 1137-1143 (2004).
- Van Voorhies, W. A. Metabolic function in Drosophila melanogaster in response to hypoxia and pure oxygen. J. Exp. Biol. 212 (19), 3132-3141 (2009).
- Montooth, K. L., Marden, J. H., Clark, A. G. Mapping determinants of variation in energy metabolism, respiration and flight in Drosophila. Genetics. 165 (2), 623-635 (2003).
- Yatsenko, A. S., Marrone, A. K., Kucherenko, M. M., Shcherbata, H. R. Measurement of metabolic rate in Drosophila using respirometry. JoVE. (88), e51681 (2014).
- Icreverzi, A., de la Cruz, A. F., Van Voorhies, W. A., Edgar, B. A. Drosophila cyclin D/Cdk4 regulates mitochondrial biogenesis and aging and sensitizes animals to hypoxic stress. Cell cycle. 11 (3), 554-568 (2012).
- Tuttle, S., Muschel, R., Bernhard, E., McKenna, W. G., Biaglow, J. Decreased ability of cells overexpressing MYC proteins to reduce peroxide and hydroperoxides. Br J Cancer. 27, 140-144 (1996).
- Ontko, J. A., Jackson, D. Factors affecting the rate of oxidation of fatty acids in animal tissues. Effect of substrate concentration, pH, and coenzyme a in rat liver preparations. J Biol Chem. 239, 3674-3682 (1964).
- Vincent, A., Briggs, L., et al. parkin-induced defects in neurophysiology and locomotion are generated by metabolic dysfunction and not oxidative stress. Hum Mol Gen. 21 (8), 1760-1769 (2012).
- Katz, J., Abraham, S., Hill, R., Chaikoff, I. L. The occurrence and mechanism of the hexose monophosphate shunt in rat liver slices. J Biol Chem. 214 (2), 853-868 (1955).
- Katz, J., Wood, H. G. The use of glucose-C14 for the evaluation of the pathways of glucose metabolism. J Biol Chem. 235 (8), 2165-2177 (1960).
- Piper, M. D. W., Blanc, E., et al. A holidic medium for Drosophila melanogaster. Nat methods. 11 (1), 100-105 (2014).
- Sang, J. H., King, R. C. Nutritional Requirements of Axenically Cultured Drosophila Melanogaster Adults. J Exp Biol. , (1961).
- Chernick, S. S., Chaikoff, I. L. Insulin and hepatic utilization of glucose for lipogenesis. J Biol Chem. 186 (2), 535-542 (1950).
- Van Voorhies, W. A., Khazaeli, A. A., Curtsinger, J. W. Testing the “rate of living” model: further evidence that longevity and metabolic rate are not inversely correlated in Drosophila melanogaster. J Appl Phys. 97 (5), 1915-1922 (2004).
