放射性標識基質からの二酸化炭素生成での測定<em>キイロショウジョウバエ</em

放射性標識代謝基質を含有するフライ食品の調製 2μCiの放射性標識された基質（D- -グルコース[6- 14 C] -グルコース、D- [1- 14 C]または[1- 14 C] -パルミチン酸、40 – – 60 mCiの/マイクロチューブでは、1を混ぜます総容量25μlと等しくなるように15μlのFD＆C第1の青色食用色素及びH 2 Oとのミリモル）。 注意：カーボン-14は、低エネルギーβ放射体であり、空気中の短距離を持っています。しかし、実験者によって、放射性標識分子または誤飲のこぼれを防止するために注意してください。食品のバイアルが簡単にひっくり返るフライ。放射性標識は、液体の形態（ステップ1.2）で、または未固化の食品（ステップ1.4）である場合は特に、転倒からそれらを防ぐことができますコンテナでそれらを収容するようにしてください。供給されているか、放射性標識された基質を供給してきたハエが、放射性標識CO 2の少量を吐き出すために開始されます。これらのハエは、ヒュームフードにアクリルボックスに保管し、KOH CAの小皿する必要がありますnはCO 2スクラバーとして使用するためのボックスで設定すること。 ピペットで空のフライ食品のバイアルの底に放射性標識された基板と青色色素ミックスのすべて（高さ9.4センチ、幅2.2センチ）。 （ – 食品10 mlを含む1つのバイアルのための高電力レベルで20秒15）食品が単に液化するまで加熱標準は、電子レンジで食品を飛びます。 青色の均一性を監視することは、完全な混合を確実にするために、旋回迅速に放射性標識された基板/青色色素ミックスに975μlの溶融食品を追加します。 30分 – 食品を冷却し、20室温で完全に固化することができます。 大人のショウジョウバエに放射性標識代謝基質を餌2 大人が多孔性ポリエチレンアクリルベースに融合し、圧力調整器とCO 2タンクに接続からなるCO 2麻酔装置を使用して飛ぶ麻酔。 5L /分で麻酔装置に流入CO 2。 転送麻酔（ – 1バイアルあたり30ハエのn = 15）dは、放射性標識、青染め食品を含むバイアルに飛びます。キャップフォームストッパー付きバイアル、およびハエが目を覚ますまで水平に置きます。蓋付きのアクリル容器に移すバイアル（180センチメートルのx 180センチメートル×240センチの高さ）。 2のための放射性標識された食品にハエを転送する前に24時間- -短期給餌のために、18のためのハエを飢えさせる。3時間の供給工程T彼飢餓ステップが重要です給餌ハエは確実に彼らに提示食品の新しいソースを食べていますので、 。 5にわたって長期的な給餌のために – 7日、ハエが飢餓状態にする必要はないが、実験者はハエが内に収納されているバイアル中の放射性標識された食品の水分含有量を監視し、バイアルに水を追加するために、針と注射器を使用する必要があります乾燥食品と。 転送は、新しいバイアルにそれらを「タップ」することによって標識されていない食品に飛びます。 2の最初の追跡期間 – 4時間はハエが彼らのキューティクルから放射性標識された食物粒子をきれいにすることを可能にし、放射性標識の消化を可能にします腸内に残っ編食品。青色の腹部を探すためにハエの目視検査により、腸を通る食物の進行状況を監視します。 18 Cまたは遺伝30℃で96時間 – または周囲温度 – （呼吸に摂食状態対絶食状態の効果を測定するための標準的な食品または1％寒天上で24時間12）（12続いて、転送が異なる食品の種類に飛びます操作のために、例えば 、温度感受性GAL80（GAL80 TS）を使用して）。 注：このチェイス期間の長さは、実行される実験に応じて変化します。 例えばのために、30℃で96時間の追跡が順にGAL80 TSを用いた実験で必要になる場合があり、完全にGAL4依存導入遺伝子の発現を活性化します。 CO 2 -コレクション装置の調製 14 C-グルコースまたは14 C-パルミチン酸および股関節で標識されたハエが含まれています"飛ぶポッド」、メッシュキャップチューブを構築するために材料を組み立てますトンは大気に開いたままになります。 25ミリメートル長、丸底チューブを残し、12ミリメートル×75ミリメートルのポリプロピレンチューブのトップ50ミリメートルをカット。 130μmのナイロンメッシュ35ミリメートル×35ミリメートルの正方形を準備します。また、テープディスペンサーに透明テープを得ます。 CO 2 -collection装置のための材料を組み立てます。各ポッドを飛ぶために、20mlガラスシンチレーションバイアル、オフセンターホールを有するゴムトップストッパー、よくトップ栓に穴を通って挿入される中心、グレードGF / Bガラスマイクロファイバー濾紙（2.1センチメートル直径を組み立てます円、1μmの孔）。 GF / Bフィルター紙は、その高い湿潤強度、高負荷容量が使用されています。 使用日に5％のKOHの新鮮を準備します。ただ、ステップ3.4前に、中央に円形のGF / Bフィルター紙を折ると置くだけでなく、それはゴム製のトップ栓の穴に通され、5％KOHの100μlで、それを飽和します。 図1を参照してください。 標識されていない培地上でのインキュベーション（複数可）以下、Anesthetizeは、CO 2を飛びます。ブラシは、カットオフポリプロピレンチューブに飛ぶナイロンメッシュ付きキャップ、およびチューブにメッシュを接着する透明テープを使用しています。ハエが目を覚ますと、メッシュがしっかりチューブに貼付されている前にエスケープ回避するために、迅速に作業。ハエの等しい数は、特定の実験のためのポッドフライそれぞれに使用すべきです。 10 -フライポッドあたり20ハエはシンチレーション計数（下記ステップ4.1）による測定のために十分な放射性標識し-CO 2を生成します 。 20mlのガラスシンチレーションバイアルにフライポッドを転送します。キャップよくKOH飽和GF / B濾紙を含む中心保持ラバートップストッパー付きガラスバイアル。ガラスシンチレーションバイアルの唇の上にゴム製の上部ストッパーの広い上部を折ります。 図1を参照してください。 セットガラス蓋付き、アクリル容器にハエを含有するバイアル、および時間（2〜12時間がうまく動作します）の様々な期間インキュベートします。 結果の4.分析に4 mlのシンチレーションカクテルを含む6 mLのプラスチックシンチレーションバイアルにインキュベーション、キャップを取るガラスバイアル、および転送KOH飽和GF / B濾紙の終わり。 必要な場合は、凍結保存された基板の後の決意のために-80℃のドライアイスや店舗のフライポッドで飛びます。これらのサンプルは放射性であり、従って、記憶されなければならないことに注意してください。 追加のシンチレーションバイアルを準備します。背景と0.1を含む2人に1として機能するように、未使用のGF / B濾紙を含む1 – CPM /μCiのを決定するために、0.5μCiの放射性標識された基質を。 製造業者のプロトコルに従ってシンチレーションカウンターを用いて各サンプルのCPMを測定します。 時間当たりフライ当たりピコモル14 CO 2 / CPMとピコモル14 CO 2を計算します。各サンプルのCPM値からバックグラウンドのcpmを引きます。きちんとした放射性標識された基板のデータから、バックグラウンド補正されたcpm /サンプルのμCiのがカウント計算します。 使用メーカー提供の比活性および放射性標識された基質の放射化学濃度（例えば、50μCiの/マイクロモルおよび0.1μCiの/μlで、それぞれ）ピコモル/ CPMを計算します。ピコモル14 CO 2 /サンプルに14 CO 2 /サンプルのcpmからバックグラウンド補正されたフライポッドデータを変換するために、この係数を使用します。その後、ハエの数とフライポッド内の時間の数で割ます。