Medição da produção de dióxido de carbono da Radiolabeled Substratos em<em> Drosophila melanogaster</em
Summary
This paper describes a method for the measurement of fuel oxidation in Drosophila melanogaster in which trace amounts of specific radiolabeled metabolic substrates are fed to flies. The exhaled radiolabeled CO2 that is a produced from fuel oxidation is collected and measured.
Abstract
O poder da genética de Drosophila está cada vez mais a ser aplicada a questões de sinalização hormonal e metabolismo e para o desenvolvimento de modelos de doenças humanas neste organismo. métodos sensíveis para medições de parâmetros, tais como taxas metabólicas são necessários para impulsionar o entendimento da fisiologia e doenças em animais de pequeno porte, como a mosca da fruta. O método descrito aqui avalia oxidação do combustível, em pequenas quantidades de moscas adultas alimentadas com alimentos contendo quantidades vestigiais de 14 substratos marcados com C, tais como glucose ou ácido gordo. Após o período de alimentação e quaisquer manipulações experimentais adicionais, moscas são transferidos para tubos curtos tapados com malha, que são então colocados em frascos de vidro contendo papel de filtro de KOH-saturado que as armadilhas exalados, CO radiomarcado 2 gerado a partir da oxidação de substratos marcados radioactivamente como bicarbonato de potássio, KHCO3. Este bicarbonato radiomarcado é medida por contagem de cintilação. Este é aqabordagem quantitativa, reprodutível e simples para o estudo da oxidação do combustível. O uso de radiomarcado glicose, ácidos graxos ou aminoácidos permite a determinação da contribuição destas diferentes fontes de combustível para o metabolismo energético em condições diferentes, tais como alimentação e jejum e em diferentes origens genéticas. Isso complementa outras abordagens utilizadas para medir no metabolismo energético vivo e deve favorecer a compreensão da regulação metabólica.
Introduction
Trabalho no organismo modelo Drosophila melanogaster tem contribuído grandemente para a compreensão dos princípios genéticos, processos de desenvolvimento, crescimento, envelhecimento, comportamento, imunidade e doença humana 1,2. Uma miríade de abordagens biológicas genéticas e celulares em Drosophila tem impulsionado o progresso nestas áreas. No entanto, o estudo do metabolismo na mosca da fruta desenvolveu mais lentamente, devido em grande parte à dificuldade de medição de parâmetros metabólicos em um animal tão pequeno. O interesse em usar Drosophila como modelo para o estudo de doenças humanas, tais como diabetes e para a compreensão das contribuições do metabolismo ao crescimento e várias patologias tem empurrado o campo para desenvolver e adaptar técnicas metabólicas para este organismo 3,4.
métodos fiáveis estão agora disponíveis para a medição de um número de parâmetros metabólicos na mosca da fruta. Por exemplo, é muito simples para avaliar a ingestão de alimentos <s-se> 5, os níveis de triglicéridos armazenados e glicogénio, bem como os níveis circulantes de hemolinfa de glicose e o principal açúcar que circula na mosca, trealose, que é um dissacárido constituído por duas moléculas de glicose 4. O uso de marcadores metabólicos permitiu o estudo da absorção de nutrientes a partir da dieta e a conversão de nutrientes absorvidos tal como a glucose para o glicogénio e os triglicéridos 6 formas de armazenamento. Taxas metabólicas podem ser avaliados na mosca da fruta através da medição do consumo de oxigênio 7,8 e dióxido de carbono (CO 2) produção. O ciclo do ácido cítrico oxida unidades de dois carbonos que pode entrar no ciclo de acetil-coenzima A (CoA), que é derivado do metabolismo de hidratos de carbono dietéticos e armazenados e ácidos gordos. Cada volta do ciclo gera uma molécula de cada um de GTP (ou ATP) e o doador de electrões FADH 2, três moléculas de NADH, e duas moléculas de produto CO 2 resíduos. Produção de CO 2 podeser utilizado para estimar a taxa metabólica basal. A produção total de CO 2 pode ser quantificada em Drosophila através da utilização de respirômetros comercialmente disponíveis ou artesanais 9-10,11.
A medição do total de produção de CO 2, especialmente quando combinada com medição do consumo de O 2, fornece informações valiosas sobre o metabolismo energético de todo o corpo. No entanto, esta medida não identifica o nutriente sendo oxidado para adenosina trifosfato de produção (ATP). Três classes principais de nutrientes pode entrar no ciclo do ácido cítrico após a conversão para acetil-CoA: hidratos de carbono, ácidos gordos e proteínas. Glicose-6-fosfato, derivado de glucose da dieta ou de glicogénio armazenado, pode ser convertida em piruvato que é descarboxilado pela desidrogenase piruvato para formar acetil-CoA. Composição de ácidos graxos derivados da dieta ou de triglicérides armazenados pelo rendimentos ß-oxidação acetil-CoA, que então entra no ciclo do ácido cítrico. Finalmente, A maioria dos aminoácidos pode entrar no ciclo do ácido cítrico após a conversão de piruvato, acetil-CoA ou ácido cítrico intermediários do ciclo, tais como alfa-cetoglutarato.
contribuição específica em nutrientes para o metabolismo de energia durante condições basais e estimuladas pode ser monitorizada através da utilização de marcadores radioactivos. O protocolo aqui apresentado é adaptado para uso em Drosophila a partir de um protocolo utilizado para avaliar a oxidação em células cultivadas em cultura 12,13. Nesta abordagem, as moscas da fruta são alimentados 14 substratos C-radiomarcado metabólicas (hidratos de carbono, ácidos gordos ou aminoácidos) na dieta de uma curta (horas) ou longos (dias) de pulso, perseguida em alimentos não marcada, e, em seguida, expostas a uma câmara contendo hidróxido de potássio (KOH) de papel de filtro saturados para capturar CO 2 exalado como bicarbonato. bicarbonato radiomarcado pode ser quantificada por contagem de cintilação. Diferenças na radiomarcado-produção de CO 2 entre experimentogrupos ao de moscas pode refletir uso de combustíveis diferentes para a produção de ATP ao longo de uma prolongada diferenças rápidos ou intrínsecas no metabolismo de combustível entre os genótipos, por exemplo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo descreve um método para medir a oxidação de substratos radiomarcados específicos em adulto de Drosophila melanogaster. Esta técnica é simples, quantitativo e reprodutível e sensível, e complementa os métodos existentes que medem de produção total de CO 2 e consumo de O 2, porque pode ser utilizado para identificar o nutriente (s) a ser oxidado para a produção de ATP.
Medição de CO 2 libertado a partir da oxidação de substratos radiomarcados específicos usando o método aqui descrito é complementar a técnicas que medem de produção total de CO 2. Total de produção de CO 2 (V CO2) permite estimar a taxa metabólica e, quando o consumo total de O2 (VO2) é conhecido, a taxa metabólica pode ser calculada e a fonte de combustível para a oxidação pode ser estimado com base na taxa de troca respiratória (V CO2 / O2 = V RER). Quandohidratos de carbono são o substrato exclusiva, RER = 1, mas quando os ácidos gordos são a fonte exclusiva, RER = 0,7, devido à estequiometria das reacções de glucose e oxidação de lípidos. Na ausência de equipamento para medir o consumo de oxigénio em Drosophila 14, a fonte de combustível não oxidativo pode ser identificado. No entanto, por meio de etiquetagem voa com quantidades vestigiais de um substracto radioactivo ou outro, e as taxas de medição de radiomarcado produção de CO 2, pode-se tirar conclusões sobre a capacidade de moscas para oxidar um determinado substrato em pontos de tempo diferentes durante um estímulo ou sobre os efeitos de uma dada mutação na oxidação do combustível.
Há uma série de passos críticos neste protocolo. Em primeiro lugar, deve ser tomado cuidado ao usar materiais radioativos para evitar vazamentos e contaminação de áreas de investigação. Segundo, quando anestesiar moscas durante os passos 2.1 e 3.4, o experimentador deve trabalhar rapidamente para evitar os efeitos de CO 2 prolongadoexposição sobre o metabolismo e o comportamento. Um grupo de 20 moscas podem ser anestesiados e transferidos para um novo frasco ou numa cápsula mosca em 20 segundos ou menos. Quando transferidos de um aparelho de anestesia para um tubo de alimentação, o frasco deve ficar em repouso no seu lado para evitar moscas anestesiadas de ficar presa sobre a superfície do alimento. Quando as moscas são alimentados com alimento radiomarcado ao longo de vários dias, como no passo 2.2, o experimentador que deve segurar a comida não seque como moscas são sensíveis à desidratação.
O alimentados ou em jejum antes da marcação, a escolha da etiqueta, o período de tempo de marcação, o comprimento de tempo no pod de mosca, e o método de anestesia são parâmetros que podem ser sujeitos a resolução de problemas e modificação quando se utiliza esta técnica. Em primeiro lugar, moscas submetido a períodos curtos de rotulagem (2-3 hr) é improvável que consomem quantidades significativas de alimento radiomarcado, a menos que submetidas a um período de jejum de antemão. Em segundo lugar, a escolha do marcador Cum efeito as conclusões um é capaz de desenhar sobre fenótipos metabólicos. Por exemplo, a produção de CO2 radiomarcado de D- [1- 14 C] -glucose pode reflectir a oxidação através do ciclo do ácido cítrico ou o shunt das pentoses fosfato, ao passo que a produção de CO2 radiomarcado de D- [6- 14 C] -glucose reflecte oxidação através do ciclo do ácido cítrico única 12,15,16. Alimentando moscas com um marcador marcado radioactivamente para um aminoácido essencial, 17,18 seria uma boa estratégia para avaliar a oxidação de aminoácidos derivados de proteínas. Finalmente, períodos longos de rotulagem com glucose radiomarcada também aumentar a possibilidade de incorporação deste precursor para outras classes de moléculas, tais como triglicéridos e 19 aminoácidos tais como alanina, que prontamente interconverts com piruvato. Isto pode ser avaliado por medição da radioactividade incorporada nestes diferentes classes de moléculas 6. Rad Com efeito, grupos separados de moscas pode ser alimentadoiolabeled substratos da mesma maneira e, em seguida, utilizados em experiências mosca vagem ou medição do marcador radioactivo que é armazenada e permanece em glicogénio e os triglicéridos em jejum e alimentados condições de 6, por exemplo. Outra estratégia é a utilização de períodos de curta de rotulagem que são susceptíveis de oxidação de revelar os nutrientes dietéticos radiomarcados si e não as formas de armazenamento desses nutrientes. Em terceiro lugar, é também possível que dois grupos de moscas pode ter as taxas idênticas de 14 CO 2 de produção ao longo de um determinado período de tempo, mas as taxas muito diferentes inicialmente. Por conseguinte, variando a quantidade de tempo que opera passar no pod de mosca pode ser um importante parâmetro a alterar quando se avalia variação fenotípica. Finalmente, este protocolo exige o uso de um curto período de CO 2 a anestesia ao colocar as moscas para o aparelho de mosca vagem. É possível que o CO 2 anestesia pode afectar a função metabólica sobre o decurso da experiência mosca vagem. Uma alternativa astratégia é usar anestesia azoto que não afeta a taxa metabólica 20.
Tal como acontece com qualquer técnica que mede um sistema tão complexo como a oxidação do combustível e a taxa metabólica, o método aqui descrito tem limitações. Em primeiro lugar, é possível que opera em diferentes grupos diferentes poderiam consomem quantidades de alimento radiomarcado e assim iria entrar na fase de recolha de CO 2 do ensaio com diferentes valores de partida de substrato. Isto pode ser controlado para, em certa medida, realizando a experiência com grandes tamanhos de amostra e pela alimentação de moscas em massa. Para períodos curtos de rotulagem, voa com tripas de cor azul semelhantes vão ter consumido o marcador radioactivo e pode ser transportado para a parte perseguição do experimento. A quantidade de marcador radioactivo remanescente em um grupo de moscas também pode ser medido no final da experiência e em coortes separadas de moscas, após o fim da alimentação e período de corrida inicial. Em segundo lugar, os níveis de atividade entregrupos de moscas nas vagens da mosca podem ser diferentes. Isso terá de ser determinada experimentalmente e tidas em conta na interpretação dos dados. Em terceiro lugar, esta técnica não mede total de produção de CO 2, apenas a produção de um nutriente na dieta específica ou a forma (s) de armazenamento desse nutriente. Este protocolo não é um substituto para, mas em vez disso é complementar à medição da VCO 2, pois fornece informações diferentes e adicionais.
O método descrito aqui mede exalado, CO 2 marcado radioactivamente que é um produto da oxidação de quantidades vestigiais de substratos metabólicos específicos. Variando o rótulo usado – glicose, ácidos graxos ou aminoácidos – pode-se projetar experimentos cada vez mais sofisticados para avaliar as contribuições de diferentes substratos para o metabolismo sob diferentes condições fisiológicas, tais como fome e em diferentes origens genéticas. futuras aplicações desta técnica incluem a medição da metabolism nas fases de larva e pupa de desenvolvimento, duas etapas do ciclo de vida Drosophila que são caracterizadas por extremos de armazenamento de nutrientes e discriminação, respectivamente.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The author thanks Drs. Mingjian Lu and Morris Birnbaum for helpful advice and funding support from NIDDK (R21DK089391).
Materials
| PALMITIC ACID, [1-14C]-, 50 µCi | PerkinElmer | NEC075H050UC | |
| GLUCOSE, D-[6-14C]-, 50µCi | PerkinElmer | NEC045X050UC | |
| Glucose, D-[1-14C]-, 50µCi | PerkinElmer | NEC043X050UC | |
| Drosophila Vials, Narrow, Polystyrene | Genesee Scientific | 32-116 | |
| Round-Bottom Polypropylene Tubes, 12X75 mm | Fisher Scientific | 14-959AA | |
| Mesh, nitex nylon, 120 µm | Genesee Scientific | 57-102 | |
| 20ml borosilicate glass scintillation vials | Fisher Scientific | 03-337-15 | |
| Flask top stopper with off-center hole | Fisher Scientific | K882310-0000 | |
| Polypropylene center well | Fisher Scientific | K882320-0000 | |
| Whatman GF/B glass microfiber filter paper, circle, 2.1cm diameter | 09-874-20 | ||
| Ecoscint A | National Diagnostics | LS-273 | |
| 6ml Scintillation Vials with Push-On/Twist-Off Caps | National Diagnostics | SVC-06 |
References
- Wangler, M. F., Yamamoto, S., Bellen, H. J. Fruit flies in biomedical research. Genetics. 199 (3), 639-653 (2015).
- Bier, E. Drosophila, the golden bug, emerges as a tool for human genetics. Nat Rev Genet. 6 (1), 9-23 (2005).
- Owusu-Ansah, E., Perrimon, N. Modeling metabolic homeostasis and nutrient sensing in Drosophila: implications for aging and metabolic diseases. Dis Model Mech. 7 (3), 343-350 (2014).
- Tennessen, J. M., Barry, W. E., Cox, J., Thummel, C. S. Methods for studying metabolism in Drosophila. Methods. 68 (1), 105-115 (2014).
- Deshpande, S. A., Carvalho, G. B., et al. Quantifying Drosophila food intake: comparative analysis of current methodology. Nat methods. 11 (5), 535-540 (2014).
- Bland, M. L., Lee, R. J., Magallanes, J. M., Foskett, J. K., Birnbaum, M. J. AMPK supports growth in Drosophila by regulating muscle activity and nutrient uptake in the gut. Dev biol. 344 (1), 293-303 (2010).
- Hulbert, A. J., Clancy, D. J., Mair, W., Braeckman, B. P., Gems, D., Partridge, L. Metabolic rate is not reduced by dietary-restriction or by lowered insulin/IGF-1 signalling and is not correlated with individual lifespan in Drosophila melanogaster. Exp Geront. 39 (8), 1137-1143 (2004).
- Van Voorhies, W. A. Metabolic function in Drosophila melanogaster in response to hypoxia and pure oxygen. J. Exp. Biol. 212 (19), 3132-3141 (2009).
- Montooth, K. L., Marden, J. H., Clark, A. G. Mapping determinants of variation in energy metabolism, respiration and flight in Drosophila. Genetics. 165 (2), 623-635 (2003).
- Yatsenko, A. S., Marrone, A. K., Kucherenko, M. M., Shcherbata, H. R. Measurement of metabolic rate in Drosophila using respirometry. JoVE. (88), e51681 (2014).
- Icreverzi, A., de la Cruz, A. F., Van Voorhies, W. A., Edgar, B. A. Drosophila cyclin D/Cdk4 regulates mitochondrial biogenesis and aging and sensitizes animals to hypoxic stress. Cell cycle. 11 (3), 554-568 (2012).
- Tuttle, S., Muschel, R., Bernhard, E., McKenna, W. G., Biaglow, J. Decreased ability of cells overexpressing MYC proteins to reduce peroxide and hydroperoxides. Br J Cancer. 27, 140-144 (1996).
- Ontko, J. A., Jackson, D. Factors affecting the rate of oxidation of fatty acids in animal tissues. Effect of substrate concentration, pH, and coenzyme a in rat liver preparations. J Biol Chem. 239, 3674-3682 (1964).
- Vincent, A., Briggs, L., et al. parkin-induced defects in neurophysiology and locomotion are generated by metabolic dysfunction and not oxidative stress. Hum Mol Gen. 21 (8), 1760-1769 (2012).
- Katz, J., Abraham, S., Hill, R., Chaikoff, I. L. The occurrence and mechanism of the hexose monophosphate shunt in rat liver slices. J Biol Chem. 214 (2), 853-868 (1955).
- Katz, J., Wood, H. G. The use of glucose-C14 for the evaluation of the pathways of glucose metabolism. J Biol Chem. 235 (8), 2165-2177 (1960).
- Piper, M. D. W., Blanc, E., et al. A holidic medium for Drosophila melanogaster. Nat methods. 11 (1), 100-105 (2014).
- Sang, J. H., King, R. C. Nutritional Requirements of Axenically Cultured Drosophila Melanogaster Adults. J Exp Biol. , (1961).
- Chernick, S. S., Chaikoff, I. L. Insulin and hepatic utilization of glucose for lipogenesis. J Biol Chem. 186 (2), 535-542 (1950).
- Van Voorhies, W. A., Khazaeli, A. A., Curtsinger, J. W. Testing the “rate of living” model: further evidence that longevity and metabolic rate are not inversely correlated in Drosophila melanogaster. J Appl Phys. 97 (5), 1915-1922 (2004).
