Misura della produzione di anidride carbonica da marcata radioattivamente Substrati in<em> Drosophila melanogaster</em
Summary
This paper describes a method for the measurement of fuel oxidation in Drosophila melanogaster in which trace amounts of specific radiolabeled metabolic substrates are fed to flies. The exhaled radiolabeled CO2 that is a produced from fuel oxidation is collected and measured.
Abstract
Il potere della genetica Drosophila viene sempre applicato a problemi di segnalazione ormonale e il metabolismo e allo sviluppo di modelli di malattie umane in questo organismo. metodi sensibili per la misurazione di parametri quali i tassi metabolici sono necessari per guidare la comprensione della fisiologia e malattie in piccoli animali come la mosca della frutta. Il metodo descritto qui valuta l'ossidazione del combustibile in un piccolo numero di mosche adulte alimentati alimenti contenenti tracce di 14 substrati C-etichettato come il glucosio o acidi grassi. Dopo il periodo di alimentazione ed eventuali manipolazioni sperimentali aggiuntivi, mosche vengono trasferiti tubi corti ricoperte con rete, che vengono poi inseriti in flaconcini di vetro contenenti carta da filtro KOH-saturo che trappole esalato, radiomarcato CO 2 generato dalla ossidazione di substrati radiomarcati come bicarbonato di potassio, KHCO 3. Questo bicarbonato radiomarcato è misurato mediante conteggio a scintillazione. Questo è aqapproccio quantitative, riproducibile e semplice per lo studio dell'ossidazione del carburante. L'utilizzo del glucosio radioattivo, acidi grassi, o aminoacidi permette di determinare il contributo di queste diverse fonti di combustibile per il metabolismo energetico, in condizioni diverse, come l'alimentazione e il digiuno e in diversi background genetico. Ciò integra altri approcci utilizzati per misurare in vivo il metabolismo energetico e dovrebbe favorire la comprensione della regolazione metabolica.
Introduction
Il lavoro nella organismo modello Drosophila melanogaster ha contribuito notevolmente alla comprensione dei principi genetici, processi di sviluppo, la crescita, l'invecchiamento, il comportamento, l'immunità e malattia umana 1,2. Una miriade di approcci biologici genetici e cellulari in Drosophila ha guidato i progressi in questi settori. Tuttavia, lo studio del metabolismo in drosofila ha sviluppato più lentamente, dovuto in gran parte alla difficoltà nel misurare parametri metabolici in un piccolo animale simile. L'interesse ad utilizzare Drosophila come modello per lo studio di malattie umane come il diabete e per la comprensione dei contributi del metabolismo alla crescita e varie patologie ha spinto il settore a sviluppare e adattare le tecniche metabolici per questo organismo 3,4.
metodi affidabili sono ora disponibili per la misurazione di una serie di parametri metabolici nel mosca della frutta. Ad esempio, è semplice valutare l'assunzione di cibo <sup> 5, i livelli di trigliceridi immagazzinati e glicogeno, così come i livelli circolanti emolinfa di glucosio e il principale zucchero circolante nel fly, trealosio, che è un disaccaride composto da due molecole di glucosio 4. Uso di traccianti metabolici ha consentito lo studio di assorbimento dei nutrienti dalla dieta e la conversione dei nutrienti assorbiti come il glucosio alle forme accumulo di glicogeno e trigliceridi 6. Tassi metabolici possono essere valutati nel frutto volare attraverso la misurazione del consumo di ossigeno 7,8 e anidride carbonica (CO 2) di produzione. Il ciclo dell'acido citrico ossida unità a due atomi di carbonio che possono entrare nel ciclo come coenzima A (CoA), che è derivato dal metabolismo dei carboidrati alimentari e immagazzinati ed acidi grassi. Ogni giro del ciclo genera una molecola ciascuno di GTP (o ATP) e il donatore di elettroni FADH2, tre molecole di NADH e due molecole del prodotto di scarto CO 2. Produzione di CO 2 puòessere utilizzato per stimare il metabolismo basale. Produzione totale di CO 2 può essere quantificato in Drosophila attraverso l'uso di respirometri disponibili in commercio o artigianali 9-10,11.
La misurazione della produzione totale di CO 2, soprattutto quando accoppiato con la misurazione del consumo di O 2, fornisce informazioni preziose metabolismo energetico di tutto il corpo. Tuttavia, questa misura non identificare la sostanza nutritiva viene ossidato per l'adenosina trifosfato (ATP) di produzione. Tre classi principali di nutrienti possono entrare nel ciclo dell'acido citrico a seguito della conversione di acetil-CoA: carboidrati, acidi grassi e proteine. Glucosio-6-fosfato, derivato dal glucosio dietetico o glicogeno immagazzinato, può essere convertito in piruvato che è decarbossilata dal piruvato deidrogenasi per formare acetil CoA. Ripartizione degli acidi grassi derivati dalla dieta o da trigliceridi memorizzati da rendimenti ß-ossidazione acetil-CoA che poi entra nel ciclo dell'acido citrico. Finalmente, Una maggioranza di aminoacidi può entrare nel ciclo dell'acido citrico seguente conversione piruvato, acetil CoA o acido citrico intermedi del ciclo come alfa-chetoglutarato.
contributo specifico-Nutrient al metabolismo energetico durante condizioni basali e stimolate può essere monitorato mediante l'uso di traccianti radioattivi. Il protocollo presentato qui è adattato per l'uso in Drosophila da un protocollo utilizzato per valutare l'ossidazione nelle cellule in coltura 12,13. In questo approccio, i moscerini della frutta sono alimentati 14 substrati C-radioattivo metaboliche (carboidrati, acidi grassi, o aminoacidi) nella dieta per un breve (ore) o lunghe (giorni) di impulso, inseguiti sul cibo senza etichetta, e quindi esposti a un camera contenente idrossido di potassio (KOH) carta da filtro saturi per intrappolare CO espirata 2 come bicarbonato. bicarbonato radioattivo può essere quantificato dal conteggio a scintillazione. Le differenze di radiomarcato-produzione di CO 2 tra esperimentoAl gruppi di linea possono riflettere uso di combustibili diversi per la produzione di ATP nel corso di un prolungato differenze veloci o intrinseche nel metabolismo di carburante tra genotipi, per esempio.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo protocollo descrive un metodo per misurare l'ossidazione di substrati specifici radiomarcati in adulti Drosophila melanogaster. Questa tecnica è semplice, quantitativa, riproducibile e sensibile, e integra metodi esistenti che misurano produzione totale di CO 2 e il consumo di O 2 in quanto può essere utilizzato per identificare la sostanza nutriente (s) essendo ossidato per la produzione di ATP.
Misurazione della CO 2 liberata dalla ossidazione di substrati specifici radiomarcati utilizzando il metodo qui descritto è complementare a tecniche che misurano produzione totale di CO 2. Totale produzione di CO 2 (V CO2) permette di stimare il tasso metabolico e, quando è noto consumo totale O 2 (V O2), il tasso metabolico può essere calcolato e la fonte di combustibile per l'ossidazione può essere stimato sulla base del rapporto di scambio respiratorio (V CO2 / V O2 = RER). quandoi carboidrati sono il substrato esclusiva, RER = 1, ma quando gli acidi grassi sono la fonte esclusiva, RER = 0.7, a causa della stechiometria delle reazioni di glucosio e ossidazione dei lipidi. In assenza di apparecchiature per misurare il consumo di ossigeno in Drosophila 14, il combustibile ossidativo non può essere identificato. Tuttavia, mediante l'etichettatura vola con tracce di un substrato radioattivo o l'altro e tassi di misura di radioattivo produzione di CO 2, si possono trarre conclusioni circa la capacità delle mosche di ossidare un determinato substrato in diversi momenti durante uno stimolo o sugli effetti di un data mutazione sul ossidazione del combustibile.
Ci sono un certo numero di passaggi critici in questo protocollo. In primo luogo, si deve prestare attenzione quando si usano materiali radioattivi per evitare fuoriuscite e la contaminazione delle aree di ricerca. In secondo luogo, quando anestetizzare le mosche durante le fasi 2.1 e 3.4, lo sperimentatore dovrebbe lavorare velocemente per evitare gli effetti di una prolungata CO 2l'esposizione sul metabolismo e sul comportamento. Un gruppo di 20 mosche può essere anestetizzato e trasferito in un nuovo flacone o in un baccello mosca in 20 secondi o meno. Quando trasferito da un apparecchio di anestesia in una fiala di cibo, il flaconcino deve essere riposato su un lato per evitare che le mosche anestetizzati di rimanere bloccati sulla superficie alimentare. Quando mosche sono cibo radioattivo nutriti nel corso di diversi giorni come al punto 2.2, lo sperimentatore deve assicurare che il cibo non si secchi in linea sono sensibili alla disidratazione.
La FED o digiuno prima dell'etichettatura, la scelta dell'etichetta, la lunghezza del tempo di etichettatura, il periodo di tempo nel contenitore mosca, e il metodo di anestesia sono parametri che possono essere sottoposti a guasti e modifica quando si utilizza questa tecnica. In primo luogo, vola sottoposti a periodi di etichettatura brevi (2-3 hr) è improbabile che consumano quantità significative di cibo radioattivo a meno sottoposto ad un periodo di digiuno in anticipo. In secondo luogo, la scelta dell'etichetta cun effetto le conclusioni si è in grado di disegnare su fenotipi metabolici. Ad esempio, la produzione di CO 2 radioattivo da D- [1- 14 C]-glucosio può riflettere ossidazione attraverso il ciclo dell'acido citrico o lo shunt del fosfato pentoso, mentre radioattivo produzione di CO 2 da D- [6- 14 C]-glucosio riflette l'ossidazione attraverso il ciclo dell'acido citrico solo 12,15,16. Alimentazione mosche con un tracciante radiomarcato per un amminoacido essenziale 17,18 sarebbe una buona strategia per valutare ossidazione degli aminoacidi derivati dalle proteine. Infine, i periodi di etichettatura lunghi con glucosio radioattivo anche aumentare la possibilità di costituzione di questo precursore in altre classi di molecole, come i trigliceridi 19 e aminoacidi come alanina, che interconverts facilmente con piruvato. Questo può essere valutata misurando la radioattività incorporata in queste diverse classi di molecole 6. rad Infatti, coorti separate di mosche possono essere alimentatisubstrati iolabeled nello stesso modo e poi utilizzato per esperimenti di volo POD o misurazione del radiomarcato che viene memorizzato e rimane in glicogeno e trigliceridi nel nutriti e digiunato condizioni 6, per esempio. Un'altra strategia è quella di utilizzare i periodi di breve etichettatura che potrebbero rivelare l'ossidazione delle sostanze nutrienti nella dieta radiomarcati se stessi e non le forme di questi nutrienti di stoccaggio. In terzo luogo, è anche possibile che due gruppi di mosche potrebbero avere tassi identici di 14 CO 2 produzione di un determinato periodo di tempo, ma velocità molto diverse inizialmente. Pertanto, variando la quantità di tempo che vola passare nel contenitore volo può essere un parametro importante per alterare nel valutare variazione fenotipica. Infine, questo protocollo prevede l'utilizzo di un breve periodo di CO 2 anestesia quando mettendo linea nell'apparato fly pod. È possibile che le anestesia CO 2 possono influenzare la funzione metabolica nel corso dell'esperimento fly pod. Un supplente unAPPROCCIO è quello di utilizzare l'anestesia azoto che non influenza il tasso metabolico 20.
Come con qualsiasi tecnica che misura un sistema complesso come l'ossidazione del combustibile e il ritmo metabolico, il metodo qui descritto ha limitazioni. Innanzitutto, è possibile che vola in diversi gruppi potrebbero consumare diverse quantità di cibo radiomarcato e quindi sarebbe entrare nella fase di raccolta CO 2 del test con diverse quantità di partenza di substrato. Questo può essere controllato per qualche misura eseguendo l'esperimento con campioni di grandi dimensioni e alimentando mosche in massa. Per periodi brevi di etichettatura, mosche con simili coraggio di colore blu avranno consumato radiomarcato e può essere portato avanti alla porzione caccia dell'esperimento. La quantità di prodotto radiomarcato rimanente in un gruppo di mosche può essere misurato al termine dell'esperimento e in coorti separate di mosche dopo la fine del periodo di alimentazione e chase iniziale. In secondo luogo, i livelli di attività tragruppi di mosche in baccelli mosca possono essere diverse. Questo dovrà essere determinato sperimentalmente e presi in considerazione quando si interpretano i dati. Terzo, questa tecnica non misura CO 2 produzione totale, solo la produzione di uno specifico elemento nutritivo o il modulo di memorizzazione (s) di tale nutriente. Questo protocollo non è un sostituto per ma invece è complementare alle misure di VCO 2 perché fornisce informazioni diverse e supplementari.
Il metodo qui descritto misure espirata, CO 2 radioattivo che è un prodotto di ossidazione di tracce di specifici substrati metabolici. Variando l'etichetta utilizzata – glucosio, acidi grassi, o aminoacidi – si può progettare esperimenti sempre più sofisticati per valutare i contributi di diversi substrati per il metabolismo in diverse condizioni fisiologiche, come la fame e su diversi background genetico. Le future applicazioni di questa tecnica includono la misurazione di metabolism negli stadi larvali e pupe di sviluppo, due fasi del ciclo di vita Drosophila che sono caratterizzate da estremi rispettivamente stoccaggio nutrienti e ripartizione,.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The author thanks Drs. Mingjian Lu and Morris Birnbaum for helpful advice and funding support from NIDDK (R21DK089391).
Materials
| PALMITIC ACID, [1-14C]-, 50 µCi | PerkinElmer | NEC075H050UC | |
| GLUCOSE, D-[6-14C]-, 50µCi | PerkinElmer | NEC045X050UC | |
| Glucose, D-[1-14C]-, 50µCi | PerkinElmer | NEC043X050UC | |
| Drosophila Vials, Narrow, Polystyrene | Genesee Scientific | 32-116 | |
| Round-Bottom Polypropylene Tubes, 12X75 mm | Fisher Scientific | 14-959AA | |
| Mesh, nitex nylon, 120 µm | Genesee Scientific | 57-102 | |
| 20ml borosilicate glass scintillation vials | Fisher Scientific | 03-337-15 | |
| Flask top stopper with off-center hole | Fisher Scientific | K882310-0000 | |
| Polypropylene center well | Fisher Scientific | K882320-0000 | |
| Whatman GF/B glass microfiber filter paper, circle, 2.1cm diameter | 09-874-20 | ||
| Ecoscint A | National Diagnostics | LS-273 | |
| 6ml Scintillation Vials with Push-On/Twist-Off Caps | National Diagnostics | SVC-06 |
References
- Wangler, M. F., Yamamoto, S., Bellen, H. J. Fruit flies in biomedical research. Genetics. 199 (3), 639-653 (2015).
- Bier, E. Drosophila, the golden bug, emerges as a tool for human genetics. Nat Rev Genet. 6 (1), 9-23 (2005).
- Owusu-Ansah, E., Perrimon, N. Modeling metabolic homeostasis and nutrient sensing in Drosophila: implications for aging and metabolic diseases. Dis Model Mech. 7 (3), 343-350 (2014).
- Tennessen, J. M., Barry, W. E., Cox, J., Thummel, C. S. Methods for studying metabolism in Drosophila. Methods. 68 (1), 105-115 (2014).
- Deshpande, S. A., Carvalho, G. B., et al. Quantifying Drosophila food intake: comparative analysis of current methodology. Nat methods. 11 (5), 535-540 (2014).
- Bland, M. L., Lee, R. J., Magallanes, J. M., Foskett, J. K., Birnbaum, M. J. AMPK supports growth in Drosophila by regulating muscle activity and nutrient uptake in the gut. Dev biol. 344 (1), 293-303 (2010).
- Hulbert, A. J., Clancy, D. J., Mair, W., Braeckman, B. P., Gems, D., Partridge, L. Metabolic rate is not reduced by dietary-restriction or by lowered insulin/IGF-1 signalling and is not correlated with individual lifespan in Drosophila melanogaster. Exp Geront. 39 (8), 1137-1143 (2004).
- Van Voorhies, W. A. Metabolic function in Drosophila melanogaster in response to hypoxia and pure oxygen. J. Exp. Biol. 212 (19), 3132-3141 (2009).
- Montooth, K. L., Marden, J. H., Clark, A. G. Mapping determinants of variation in energy metabolism, respiration and flight in Drosophila. Genetics. 165 (2), 623-635 (2003).
- Yatsenko, A. S., Marrone, A. K., Kucherenko, M. M., Shcherbata, H. R. Measurement of metabolic rate in Drosophila using respirometry. JoVE. (88), e51681 (2014).
- Icreverzi, A., de la Cruz, A. F., Van Voorhies, W. A., Edgar, B. A. Drosophila cyclin D/Cdk4 regulates mitochondrial biogenesis and aging and sensitizes animals to hypoxic stress. Cell cycle. 11 (3), 554-568 (2012).
- Tuttle, S., Muschel, R., Bernhard, E., McKenna, W. G., Biaglow, J. Decreased ability of cells overexpressing MYC proteins to reduce peroxide and hydroperoxides. Br J Cancer. 27, 140-144 (1996).
- Ontko, J. A., Jackson, D. Factors affecting the rate of oxidation of fatty acids in animal tissues. Effect of substrate concentration, pH, and coenzyme a in rat liver preparations. J Biol Chem. 239, 3674-3682 (1964).
- Vincent, A., Briggs, L., et al. parkin-induced defects in neurophysiology and locomotion are generated by metabolic dysfunction and not oxidative stress. Hum Mol Gen. 21 (8), 1760-1769 (2012).
- Katz, J., Abraham, S., Hill, R., Chaikoff, I. L. The occurrence and mechanism of the hexose monophosphate shunt in rat liver slices. J Biol Chem. 214 (2), 853-868 (1955).
- Katz, J., Wood, H. G. The use of glucose-C14 for the evaluation of the pathways of glucose metabolism. J Biol Chem. 235 (8), 2165-2177 (1960).
- Piper, M. D. W., Blanc, E., et al. A holidic medium for Drosophila melanogaster. Nat methods. 11 (1), 100-105 (2014).
- Sang, J. H., King, R. C. Nutritional Requirements of Axenically Cultured Drosophila Melanogaster Adults. J Exp Biol. , (1961).
- Chernick, S. S., Chaikoff, I. L. Insulin and hepatic utilization of glucose for lipogenesis. J Biol Chem. 186 (2), 535-542 (1950).
- Van Voorhies, W. A., Khazaeli, A. A., Curtsinger, J. W. Testing the “rate of living” model: further evidence that longevity and metabolic rate are not inversely correlated in Drosophila melanogaster. J Appl Phys. 97 (5), 1915-1922 (2004).
