قياس إنتاج ثاني أكسيد الكربون من رديولبلد ركائز في<em> ذبابة الفاكهة</em
Summary
This paper describes a method for the measurement of fuel oxidation in Drosophila melanogaster in which trace amounts of specific radiolabeled metabolic substrates are fed to flies. The exhaled radiolabeled CO2 that is a produced from fuel oxidation is collected and measured.
Abstract
ويتزايد تطبيق قوة الوراثة ذبابة الفاكهة على أسئلة من الإشارات الهرمونية والتمثيل الغذائي، وتطوير نماذج من الأمراض التي تصيب البشر في هذا الحي. وهناك حاجة إلى طرق حساسة لقياس المعلمات مثل معدلات التمثيل الغذائي لدفع فهم علم وظائف الأعضاء والمرض في الحيوانات الصغيرة مثل ذبابة الفاكهة. الطريقة الموصوفة هنا يقيم أكسدة الوقود في أعداد صغيرة من الذباب الكبار تغذية الأغذية التي تحتوي على كميات ضئيلة من 14 ركائز المسمى C مثل الجلوكوز أو الأحماض الدهنية. بعد فترة التغذية وأي التلاعب التجريبية إضافية، يتم نقل الذباب لأنابيب قصيرة توج مع شبكة، والتي يتم وضعها في قوارير زجاجية تحتوي على ورق الترشيح المشبعة كوه التي الفخاخ الزفير، CO رديولبلد 2 لدت من أكسدة ركائز رديولبلد كما بيكربونات البوتاسيوم، KHCO 3. ويقاس هذا بيكربونات رديولبلد من التلألؤ العد. هذا هو عبد القديرنهج uantitative، قابلة للتكرار، وبسيطة لدراسة أكسدة الوقود. استخدام الجلوكوز رديولبلد والأحماض الدهنية والأحماض الأمينية أو يسمح بتحديد مساهمة هذه المصادر الوقود المختلفة لاستقلاب الطاقة في ظل ظروف مختلفة مثل التغذية والصيام وخلفيات وراثية مختلفة. ويكمل هذا النهج الأخرى المستخدمة لقياس في استقلاب الطاقة في الجسم الحي، وينبغي تعزيز فهم تنظيم الأيض.
Introduction
وقد ساهم العمل في الكائن الحي نموذج ذبابة الفاكهة إلى حد كبير في فهم الأسس الوراثية، والعمليات التنموية، والنمو، والشيخوخة، والسلوك، والحصانة والأمراض التي تصيب البشر 1،2. وأدى عدد لا يحصى من النهج البيولوجية الوراثية والخلايا في ذبابة الفاكهة تقدم في هذه المجالات. ومع ذلك، وضعت دراسة التمثيل الغذائي في ذبابة الفاكهة ببطء أكثر، ويرجع ذلك في جزء كبير منه إلى الصعوبات في قياس المعلمات الأيض في مثل هذه الحيوانات الصغيرة. دفعت اهتماما باستخدام ذبابة الفاكهة كنموذج لدراسة الأمراض التي تصيب الإنسان مثل السكري ولفهم المساهمات التمثيل الغذائي للنمو ومختلف الأمراض الميدان لتطوير وتكييف تقنيات التمثيل الغذائي لهذا الكائن الحي 3،4.
وسائل موثوق بها تتوفر لقياس عدد من المعلمات الأيض في ذبابة الفاكهة الآن. على سبيل المثال، فإنه واضح ومباشر لتقييم الاستهلاك الغذائي <sتصل> 5، ومستويات الدهون الثلاثية المخزنة والجليكوجين، وكذلك تعميم مستويات الدملمف الجلوكوز والسكر تعميم كبير في الطيران، طرهالوز، وهو ديساكهارايد تتألف من اثنين من جزيئات الجلوكوز 4. وقد مكن استخدام استشفاف الأيض دراسة امتصاص العناصر الغذائية من النظام الغذائي وتحويل العناصر الغذائية الممتصة مثل الجلوكوز إلى جليكوجين أشكال التخزين والدهون الثلاثية 6. ويمكن تقييم معدلات التمثيل الغذائي في ذبابة الفاكهة من خلال قياس استهلاك الأوكسجين 7،8 وثاني أكسيد الكربون (CO 2) الإنتاج. دورة حمض الستريك يتأكسد الوحدتين الكربون التي يمكن أن تدخل دورة كما أسيتيل التميم A (لجنة الزراعة)، وهي مشتقة من استقلاب الكربوهيدرات الغذائية وتخزينها والأحماض الدهنية. كل منعطف دورة يولد جزيء واحد كل من GTP (أو ATP) والجهة المانحة الإلكترون القوات المسلحة الهايتية 2، ثلاثة جزيئات NADH، وجزيئين من ثاني أكسيد الكربون الناتج من النفايات 2. CO 2 إنتاج يمكنأن تستخدم لتقدير معدل الأيض القاعدي. إجمالي إنتاج CO 2 يمكن قياسها كميا في ذبابة الفاكهة من خلال استخدام قياس التنفس المتاحة تجاريا أو المصنوعة يدويا 9-10،11.
قياس إجمالي إنتاج CO 2، وخصوصا عندما يقترن قياس استهلاك O 2، ويوفر معلومات قيمة حول كامل الجسم استقلاب الطاقة. ومع ذلك، فإن هذا الإجراء لا تحديد المواد الغذائية التي تتأكسد لإنتاج أدينوسين ثلاثي الفوسفات (ATP). يمكن ثلاث فئات رئيسية من المواد المغذية يدخل الليمون الحامض دورة التحويل التالية إلى الاسيتيل جنة الزراعة: الكربوهيدرات والأحماض الدهنية، والبروتينات. الجلوكوز 6 فوسفات، والمستمدة من الجلوكوز الغذائية أو تخزين الجليكوجين، يمكن تحويلها إلى البيروفات التي decarboxylated بواسطة نازعة البيروفات لتشكيل الاسيتيل جنة الزراعة. انهيار الأحماض الدهنية المستمدة من الغذاء أو من الدهون الثلاثية المخزنة بواسطة عائدات ß للأكسدة أسيتيل التميم أن ثم يدخل دورة حمض الستريك. أخيراوالغالبية العظمى من الأحماض الأمينية يمكن أن تدخل دورة حمض الستريك بعد أن تحول إلى البيروفات، أسيتيل التميم أو حمض الستريك وسيطة دورة مثل ألفا كيتوغلوتارات.
يمكن رصد مساهمة بالمغذيات محددة لاستقلاب الطاقة خلال القاعدية والشروط حفز من خلال استخدام استشفاف المشعة. ويتم تكييف بروتوكول المعروضة هنا للاستخدام في ذبابة الفاكهة من بروتوكول يستخدم لتقييم الأكسدة في الخلايا المزروعة في الثقافة 12،13. في هذا النهج، ذباب الفاكهة ويتم تغذية 14 ركائز C-رديولبلد الأيض (الكربوهيدرات والأحماض الدهنية، أو الأحماض الأمينية) في النظام الغذائي لفترة قصيرة (ساعة) أو طويلة (أيام) نبض، طاردت على الطعام الخالي من الملصقات، وبعد ذلك تعرضت ل غرفة تحتوي على هيدروكسيد البوتاسيوم (KOH) ورقة مرشح -saturated لمحاصرة الزفير CO 2، والبيكربونات. بيكربونات رديولبلد يمكن قياسها عن طريق عد التلألؤ. الاختلافات في رديولبلد-CO 2 إنتاج بين التجربةقد تعكس مجاميع كتائب من الذباب استخدام أنواع مختلفة من الوقود لإنتاج ATP على مدار فروق سريعة أو الجوهرية طويلة في التمثيل الغذائي الوقود بين التراكيب الوراثية، على سبيل المثال.
Protocol
Representative Results
Discussion
يصف هذا البروتوكول وسيلة لقياس أكسدة ركائز رديولبلد محددة في الكبار ذبابة الفاكهة. هذه التقنية هي واضحة، الكمية، يمكن استنساخه وحساسة، ومكملة لطرق الحالية التي تقيس مجموع CO 2 الإنتاج والاستهلاك O 2 لأنها يمكن أن تستخدم لتحديد المغذيات (ق) التي تتأكسد لإنتاج ATP.
قياس ثاني أكسيد الكربون 2 تتحرر من أكسدة ركائز رديولبلد محددة باستخدام الطريقة الموصوفة هنا هو مكمل لتقنيات قياس مجموع CO 2 الإنتاج. إجمالي CO 2 إنتاج (V CO2) يسمح تقدير معدل الأيض، وعندما يعرف الكلي O 2 استهلاك (V O2)، ويمكن حساب معدل الأيض ومصدر الوقود للأكسدة يمكن أن يقدر على أساس نسبة التبادل التنفسي (V CO2 / V O2 = RER). متىالكربوهيدرات هي الركيزة حصرية، RER = 1، ولكن عندما الأحماض الدهنية هي المصدر الوحيد، RER = 0.7، نظرا للرياضيات الكيمياء من ردود فعل الجلوكوز وأكسدة الدهون. في حالة عدم وجود معدات لقياس استهلاك الأوكسجين في ذبابة الفاكهة 14، لا يمكن تحديد مصدر وقود الأكسدة. ومع ذلك، من خلال وضع العلامات الذباب مع كميات ضئيلة من الركيزة المشعة أو بأخرى ومعدلات قياس رديولبلد إنتاج CO 2، يمكن للمرء استخلاص استنتاجات حول قدرة الذباب على أكسدة ركيزة بالنظر في نقاط زمنية مختلفة خلال التحفيز أو عن آثار نظرا طفرة على أكسدة الوقود.
وهناك عدد من الخطوات الهامة في هذا البروتوكول. أولا، ينبغي توخي الحذر عند استخدام المواد المشعة لتجنب تسرب وتلوث من المجالات البحثية. ثانيا، عندما التخدير الذباب خلال الخطوات 2.1 و 3.4، يجب المجرب العمل بسرعة لتجنب الآثار من ثاني أكسيد الكربون لفترة طويلة 2تعرض على عملية التمثيل الغذائي والسلوك. مجموعة من 20 الذباب يمكن تخدير ونقل إلى قارورة جديدة أو في جراب ذبابة في 20 ثانية أو أقل. عند نقلها من جهاز التخدير إلى قارورة الغذاء، يجب أن استراح في قارورة من جانبها لمنع الذباب تخدير من أن يعلقوا على سطح الطعام. عندما الذباب هي الغذاء رديولبلد بتغذية على مدى عدة أيام كما في الخطوة 2.2، يجب المجرب تأكد من أن الغذاء لا تجف كما الذباب حساسة للجفاف.
بنك الاحتياطي الفيدرالي أو الدولة صام قبل وضع العلامات، واختيار التسمية، وطول الوقت وضع العلامات، وطول الوقت في جراب الطاير، وطريقة التخدير والمعلمات التي يمكن أن تتعرض لاستكشاف الأخطاء وإصلاحها وتعديل عند استخدام هذه التقنية. أولا، الذباب تعرض لفترات وضع العلامات قصيرة (2-3 ساعة) من غير المرجح أن تستهلك كميات كبيرة من المواد الغذائية رديولبلد إلا إذا تعرض لفترة الصيام مسبقا. الثاني، واختيار التسمية جوتؤثر على استنتاجات واحد قادر على رسم حول الظواهر الأيضية. على سبيل المثال، رديولبلد CO 2 الإنتاج من د- [1- 14 C] -glucose يمكن أن تعكس الأكسدة من خلال دورة حمض الستريك أو تحويلة الفوسفات البنتوز، في حين رديولبلد CO 2 الإنتاج من د- [6- 14 C] -glucose يعكس الأكسدة خلال دورة حمض الستريك فقط 12،15،16. أن تغذية الذباب مع التتبع رديولبلد لمن الأحماض الأمينية الأساسية 17،18 تكون الإستراتيجية الجيدة لتقييم أكسدة الأحماض الأمينية المستمدة من البروتينات. وأخيرا، وفترات وضع العلامات مطولة مع الجلوكوز رديولبلد تثير أيضا إمكانية إدراج هذه السلائف إلى فئات أخرى من الجزيئات مثل الدهون الثلاثية 19 والأحماض الأمينية مثل ألانين، التي interconverts بسهولة مع البيروفات. ويمكن تقييم ذلك من خلال قياس النشاط الإشعاعي تدمج في هذه فئات مختلفة من الجزيئات 6. راد في الواقع، الأفواج منفصلة من الذباب يمكن تغذيةiolabeled ركائز بنفس الطريقة وتستخدم بعد ذلك لإجراء التجارب جراب ذبابة أو قياس radiolabel التي يتم تخزينها ويبقى في الجليكوجين والدهون الثلاثية في تغذية وصام الظروف 6، على سبيل المثال. استراتيجية أخرى هي استخدام فترات قصيرة وضع العلامات التي من المرجح أن تكشف أكسدة المواد الغذائية الغذائية رديولبلد أنفسهم وليس أشكال تخزين هذه المواد المغذية. ثالثا، من الممكن أيضا أن مجموعتين من الذباب يمكن أن يكون معدلات مماثلة من 14 CO 2 إنتاج أكثر من كمية معينة من الوقت، ولكن بنسب مختلفة جدا في البداية. لذلك، تفاوت مقدار الوقت الذي يتجه قضاء في جراب الطيران قد يكون معيارا هاما لتغيير عند تقييم التباين المظهري. وأخيرا، يدعو هذا البروتوكول للاستخدام خلال فترة قصيرة من CO 2 التخدير عند وضع الذباب في الجهاز جراب الطاير. ومن الممكن أن التخدير CO 2 قد تؤثر على وظيفة التمثيل الغذائي على مدى التجربة جراب الطاير. وعلى البديلpproach هو استخدام التخدير النيتروجين الذي لا يؤثر على معدل الأيض (20).
كما هو الحال مع أي أسلوب الذي يقيس مثل هذا النظام المعقد كما أكسدة الوقود ومعدل الأيض، وطريقة وصفها هنا له حدود. أولا، فمن الممكن أن تسير في مجموعات مختلفة يمكن أن تستهلك كميات مختلفة من المواد الغذائية رديولبلد وبالتالي ستدخل مرحلة جمع CO 2 للمقايسة مع كميات مختلفة بدءا من الركيزة. هذا ويمكن للرقابة لإلى حد ما عن طريق إجراء التجربة على عينات كبيرة الحجم وعن طريق تغذية الذباب بشكل جماعي. لفترات قصيرة وضع العلامات، والذباب مع الشجاعة مماثلة أزرق اللون سيكون قد استهلك radiolabel ويمكن ان يتم تطويرها إلى الجزء مطاردة من التجربة. كما يمكن قياس كمية radiolabel المتبقية في مجموعة من الذباب في نهاية التجربة وفي الأفواج منفصلة من الذباب بعد نهاية التغذية وفترة مطاردة الأولية. الثانية، ومستويات النشاط بينقد تختلف مجموعات من الذباب في القرون الطاير. وهذا يجب أن يكون تجريبيا وأخذها في الاعتبار عند تفسير البيانات. ثالثا، هذه التقنية لا يقيس إجمالي CO 2 الإنتاج، والإنتاج فقط من المغذيات غذائية معينة أو شكل التخزين (ق) من تلك المواد الغذائية. هذا البروتوكول ليست بديلا للبل هو مكمل لقياسات VCO 2 لأنه يوفر معلومات مختلفة وإضافية.
الطريقة الموصوفة هنا يقيس الزفير، CO رديولبلد 2 الذي هو نتاج أكسدة كميات ضئيلة من ركائز المحددة للتمثيل الغذائي. من خلال تغيير التسمية المستخدمة – الجلوكوز، والأحماض الدهنية، أو الأحماض الأمينية – يمكن للمرء أن تصميم تجارب متطورة على نحو متزايد لتقييم المساهمات من ركائز مختلفة لعملية التمثيل الغذائي في ظل الظروف الفسيولوجية المختلفة مثل الجوع وعلى خلفيات وراثية مختلفة. وتشمل التطبيقات المستقبلية لهذه التقنية قياس metabolisم في مراحل اليرقات والعذارى للتنمية، واثنين من مراحل دورة حياة ذبابة الفاكهة التي تتميز بها اقصى تخزين المواد الغذائية وانهيار، على التوالي.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The author thanks Drs. Mingjian Lu and Morris Birnbaum for helpful advice and funding support from NIDDK (R21DK089391).
Materials
| PALMITIC ACID, [1-14C]-, 50 µCi | PerkinElmer | NEC075H050UC | |
| GLUCOSE, D-[6-14C]-, 50µCi | PerkinElmer | NEC045X050UC | |
| Glucose, D-[1-14C]-, 50µCi | PerkinElmer | NEC043X050UC | |
| Drosophila Vials, Narrow, Polystyrene | Genesee Scientific | 32-116 | |
| Round-Bottom Polypropylene Tubes, 12X75 mm | Fisher Scientific | 14-959AA | |
| Mesh, nitex nylon, 120 µm | Genesee Scientific | 57-102 | |
| 20ml borosilicate glass scintillation vials | Fisher Scientific | 03-337-15 | |
| Flask top stopper with off-center hole | Fisher Scientific | K882310-0000 | |
| Polypropylene center well | Fisher Scientific | K882320-0000 | |
| Whatman GF/B glass microfiber filter paper, circle, 2.1cm diameter | 09-874-20 | ||
| Ecoscint A | National Diagnostics | LS-273 | |
| 6ml Scintillation Vials with Push-On/Twist-Off Caps | National Diagnostics | SVC-06 |
References
- Wangler, M. F., Yamamoto, S., Bellen, H. J. Fruit flies in biomedical research. Genetics. 199 (3), 639-653 (2015).
- Bier, E. Drosophila, the golden bug, emerges as a tool for human genetics. Nat Rev Genet. 6 (1), 9-23 (2005).
- Owusu-Ansah, E., Perrimon, N. Modeling metabolic homeostasis and nutrient sensing in Drosophila: implications for aging and metabolic diseases. Dis Model Mech. 7 (3), 343-350 (2014).
- Tennessen, J. M., Barry, W. E., Cox, J., Thummel, C. S. Methods for studying metabolism in Drosophila. Methods. 68 (1), 105-115 (2014).
- Deshpande, S. A., Carvalho, G. B., et al. Quantifying Drosophila food intake: comparative analysis of current methodology. Nat methods. 11 (5), 535-540 (2014).
- Bland, M. L., Lee, R. J., Magallanes, J. M., Foskett, J. K., Birnbaum, M. J. AMPK supports growth in Drosophila by regulating muscle activity and nutrient uptake in the gut. Dev biol. 344 (1), 293-303 (2010).
- Hulbert, A. J., Clancy, D. J., Mair, W., Braeckman, B. P., Gems, D., Partridge, L. Metabolic rate is not reduced by dietary-restriction or by lowered insulin/IGF-1 signalling and is not correlated with individual lifespan in Drosophila melanogaster. Exp Geront. 39 (8), 1137-1143 (2004).
- Van Voorhies, W. A. Metabolic function in Drosophila melanogaster in response to hypoxia and pure oxygen. J. Exp. Biol. 212 (19), 3132-3141 (2009).
- Montooth, K. L., Marden, J. H., Clark, A. G. Mapping determinants of variation in energy metabolism, respiration and flight in Drosophila. Genetics. 165 (2), 623-635 (2003).
- Yatsenko, A. S., Marrone, A. K., Kucherenko, M. M., Shcherbata, H. R. Measurement of metabolic rate in Drosophila using respirometry. JoVE. (88), e51681 (2014).
- Icreverzi, A., de la Cruz, A. F., Van Voorhies, W. A., Edgar, B. A. Drosophila cyclin D/Cdk4 regulates mitochondrial biogenesis and aging and sensitizes animals to hypoxic stress. Cell cycle. 11 (3), 554-568 (2012).
- Tuttle, S., Muschel, R., Bernhard, E., McKenna, W. G., Biaglow, J. Decreased ability of cells overexpressing MYC proteins to reduce peroxide and hydroperoxides. Br J Cancer. 27, 140-144 (1996).
- Ontko, J. A., Jackson, D. Factors affecting the rate of oxidation of fatty acids in animal tissues. Effect of substrate concentration, pH, and coenzyme a in rat liver preparations. J Biol Chem. 239, 3674-3682 (1964).
- Vincent, A., Briggs, L., et al. parkin-induced defects in neurophysiology and locomotion are generated by metabolic dysfunction and not oxidative stress. Hum Mol Gen. 21 (8), 1760-1769 (2012).
- Katz, J., Abraham, S., Hill, R., Chaikoff, I. L. The occurrence and mechanism of the hexose monophosphate shunt in rat liver slices. J Biol Chem. 214 (2), 853-868 (1955).
- Katz, J., Wood, H. G. The use of glucose-C14 for the evaluation of the pathways of glucose metabolism. J Biol Chem. 235 (8), 2165-2177 (1960).
- Piper, M. D. W., Blanc, E., et al. A holidic medium for Drosophila melanogaster. Nat methods. 11 (1), 100-105 (2014).
- Sang, J. H., King, R. C. Nutritional Requirements of Axenically Cultured Drosophila Melanogaster Adults. J Exp Biol. , (1961).
- Chernick, S. S., Chaikoff, I. L. Insulin and hepatic utilization of glucose for lipogenesis. J Biol Chem. 186 (2), 535-542 (1950).
- Van Voorhies, W. A., Khazaeli, A. A., Curtsinger, J. W. Testing the “rate of living” model: further evidence that longevity and metabolic rate are not inversely correlated in Drosophila melanogaster. J Appl Phys. 97 (5), 1915-1922 (2004).
