Mesure de dioxyde de carbone de production de radiomarqué Substrats en<em> Drosophila melanogaster</em
Summary
This paper describes a method for the measurement of fuel oxidation in Drosophila melanogaster in which trace amounts of specific radiolabeled metabolic substrates are fed to flies. The exhaled radiolabeled CO2 that is a produced from fuel oxidation is collected and measured.
Abstract
La puissance de la génétique de Drosophila est de plus appliquée aux questions de la signalisation hormonale et le métabolisme et le développement de modèles de maladies humaines dans cet organisme. Des méthodes sensibles pour la mesure de paramètres tels que les taux métaboliques sont nécessaires pour conduire la compréhension de la physiologie et de la maladie chez les petits animaux tels que la mouche des fruits. La méthode décrite ici évalue l' oxydation du carburant dans un petit nombre de mouches adultes nourris avec des aliments contenant des quantités infimes de 14 substrats de carbone marqué tels que le glucose ou un acide gras. Après la période d'alimentation et toutes les manipulations expérimentales supplémentaires, les mouches sont transférés dans des tubes courts coiffés de maille, qui sont ensuite placés dans des flacons en verre contenant du papier filtre de KOH saturé qui emprisonne exhalé, CO radiomarqué 2 produite à partir de l' oxydation des substrats radiomarqués comme le bicarbonate de potassium, KHCO 3. Ce bicarbonate radiomarqué est mesurée par comptage par scintillation. Ceci est aqapproche QUANTITATIVE, reproductible et simple pour l'étude de l'oxydation du carburant. L'utilisation du glucose radiomarqué, des acides gras, ou des acides aminés permet de déterminer la contribution de ces sources de carburant différentes pour le métabolisme énergétique dans des conditions différentes telles que l'alimentation et le jeûne et dans différents contextes génétiques. Cela vient compléter d' autres approches utilisées pour mesurer dans le métabolisme énergétique vivo et devrait favoriser la compréhension de la régulation métabolique.
Introduction
Le travail dans l'organisme modèle Drosophila melanogaster a grandement contribué à la compréhension des principes de la génétique, les processus de développement, la croissance, le vieillissement, le comportement, l' immunité et la maladie humaine 1,2. Une myriade d'approches biologiques génétiques et cellulaires chez la drosophile a entraîné des progrès dans ces domaines. Cependant, l'étude du métabolisme de la mouche des fruits a développé plus lentement, en grande partie grâce à des difficultés dans la mesure des paramètres métaboliques dans un si petit animal. L'intérêt d'utiliser la drosophile comme modèle pour l' étude des maladies humaines telles que le diabète et pour comprendre les contributions du métabolisme à des pathologies de croissance et divers a poussé le terrain pour développer et adapter les techniques métaboliques pour cet organisme 3,4.
Des méthodes fiables sont maintenant disponibles pour la mesure d'un certain nombre de paramètres métaboliques dans la mouche des fruits. Par exemple, il est facile d'évaluer l'apport alimentaire <sup> 5, les niveaux de triglycérides stockés et du glycogène, ainsi que les taux circulants de glucose hémolymphe et le principal sucre circulant dans la mouche, le trehalose, qui est un disaccharide constitué de deux molécules de glucose 4. L' utilisation de traceurs métaboliques a permis l'étude de l' absorption des nutriments dans l'alimentation et la conversion des nutriments absorbés tels que le glucose à la forme de stockage du glycogène et de triglycérides 6. Les taux métaboliques peuvent être évalués dans le fruit voler à travers la mesure de la consommation d'oxygène 7,8 et de dioxyde de carbone (CO 2). Le cycle de l'acide citrique deux unités oxyde de carbone qui peuvent entrer dans le cycle en tant que coenzyme acétyle A (CoA), qui est dérivé du métabolisme des glucides alimentaires et stockés et les acides gras. Chaque tour du cycle génère une molécule chacun des GTP (ou ATP) et le donneur d'électrons FADH 2, trois molécules de NADH, et deux molécules du CO produit des déchets 2. Production de CO 2 peutêtre utilisé pour estimer le taux de métabolisme de base. La production totale de CO 2 peut être quantifiée chez la drosophile par l'utilisation de disponibles dans le commerce ou à la main respiromètres 9-10,11.
La mesure de la production totale de CO 2, en particulier lorsqu'elle est associée à la mesure de consommation d' O 2, fournit des informations précieuses sur le métabolisme énergétique du corps entier. Toutefois, cette mesure ne permet pas d'identifier le nutriment oxydé pour l'adénosine triphosphate (ATP). Trois grandes classes de nutriments peuvent entrer dans le cycle de l'acide citrique conversion suivante en acétyl CoA: hydrates de carbone, des acides gras et des protéines. Glucose-6-phosphate, le dérivé de glucose alimentaire ou de glycogène, peut être converti en pyruvate est décarboxylé en pyruvate déshydrogénase pour former l'acétyl-CoA. Dégradation des acides gras dérivés de l'alimentation ou de triglycérides stockés par des rendements de ß-oxydation, l'acétyl-CoA qui pénètre ensuite dans le cycle de l'acide citrique. finalementUne majorité des acides aminés peut entrer dans le cycle de l'acide citrique après conversion en pyruvate, l'acétyl-CoA ou de l'acide citrique intermédiaires du cycle tels que l'alpha-cétoglutarate.
apport spécifique de substances nutritives pour le métabolisme énergétique en conditions basales et stimulées peut être contrôlée par l'utilisation de traceurs radioactifs. Le protocole présenté ici est adapté pour être utilisé dans Drosophila à partir d' un protocole utilisé pour évaluer l' oxydation dans les cellules cultivées en culture 12,13. Dans cette approche, les mouches des fruits sont nourris 14 substrats C-radiomarquée métaboliques (glucides, acides gras ou acides aminés) dans le régime alimentaire pour un court (heures) ou longues (jours) impulsion, chassés sur les aliments sans étiquette, puis exposés à un la chambre contenant de l' hydroxyde de potassium (KOH) , du papier filtre saturé en CO exhalé pour le piégeage 2 sous forme de bicarbonate. bicarbonate radiomarqué peut être quantifiée par comptage par scintillation. Les différences de radiomarqué-production de CO 2 entre l' expériencegroupes al de mouches peuvent refléter l'utilisation de différents combustibles pour la production d'ATP au cours d'une des différences intrinsèques rapides ou prolongées dans le métabolisme de carburant entre les génotypes, par exemple.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ce protocole décrit un procédé pour mesurer l'oxydation des substrats spécifiques radiomarqués chez les adultes de Drosophila melanogaster. Cette technique est simple, quantitative, reproductible et sensible, et il vient compléter les méthodes existantes qui mesurent la production totale de CO 2 et O 2 consommation , car il peut être utilisé pour identifier l'élément nutritif (s) est oxydé pour la production d'ATP.
Mesure du CO 2 libérée par l'oxydation de substrats radiomarqués spécifiques en utilisant la méthode décrite ici est complémentaire des techniques qui mesurent la production totale de CO 2. CO Total 2 production (V CO2) permet d' estimer le taux métabolique et, si le montant total O 2 Consommation (V O2) est connu, le taux métabolique peut être calculé et la source de combustible pour l' oxydation peut être estimée sur la base du ratio d'échange respiratoire (V CO2 / V O2 = RER). Quandles hydrates de carbone sont le substrat exclusif, RER = 1, mais lorsque les acides gras sont la source exclusive, RER = 0,7, grâce à la stoechiométrie des réactions de glucose et de l'oxydation des lipides. En l'absence d'équipements pour mesurer la consommation d'oxygène chez la drosophile 14, la source de combustible oxydant ne peut être identifié. Cependant, par l' étiquetage vole avec des quantités infimes d'un substrat radioactif ou d'une autre et les taux de mesure de radiomarqué production de CO 2, on peut tirer des conclusions quant à la capacité des mouches pour oxyder un substrat donné à différents moments au cours d' un stimulus ou sur les effets d'une étant donné la mutation sur l'oxydation du carburant.
Il y a un certain nombre d'étapes critiques dans ce protocole. Tout d'abord, il faut prendre soin lors de l'utilisation des matières radioactives pour éviter les déversements et la contamination des zones de recherche. Deuxièmement, lorsque anesthésier les mouches pendant les étapes 2.1 et 3.4, l'expérimentateur doit travailler rapidement pour éviter les effets de CO 2 prolongéel'exposition sur le métabolisme et le comportement. Un groupe de 20 mouches peut être anesthésiée et transféré dans un nouveau flacon ou dans une nacelle de braguette en 20 secondes ou moins. Lorsqu'ils sont transférés d'un appareil d'anesthésie à un flacon alimentaire, le flacon doit être posé sur le côté pour empêcher les mouches anesthésiées de se coincer sur la surface des aliments. Quand les mouches sont des aliments radiomarqué nourris au cours de plusieurs jours comme dans l'étape 2.2, l'expérimentateur devrait assurer que la nourriture ne se dessèche pas que les mouches sont sensibles à la déshydratation.
L'état nourri ou à jeun avant l'étiquetage, le choix de l'étiquette, la longueur du temps d'étiquetage, la longueur de temps dans la nacelle à la mouche, et la méthode de l'anesthésie sont des paramètres qui peuvent être soumis au dépannage et à la modification lors de l'utilisation de cette technique. Tout d'abord, les mouches soumis à des périodes d'étiquetage courtes (2 – 3 hr) ne sont pas susceptibles de consommer des quantités importantes de nourriture radiomarqué moins soumis à une période de jeûne préalable. D'autre part, le choix du marqueur cune incidence sur les conclusions que l'on peut tirer sur les phénotypes métaboliques. Par exemple, la production de CO 2 radiomarqué à partir de D- [1- 14C] -glucose peut refléter l' oxydation par le cycle de l' acide citrique ou du phosphate pentose, alors que la production de CO 2 radiomarqué à partir D- [6- 14C] -glucose reflète l' oxydation à travers le cycle de l' acide citrique seul 12,15,16. Nourrir les mouches avec un traceur radiomarqué pour un acide aminé essentiel 17,18 serait une bonne stratégie pour évaluer l' oxydation des acides aminés dérivés de protéines. Enfin, les périodes longues de marquage avec du glucose radiomarqué soulèvent également la possibilité d'incorporation de ce précurseur dans d' autres classes de molécules telles que les triglycérides 19 et des acides aminés tels que l' alanine, qui interconvertit facilement avec du pyruvate. Elle peut être évaluée en mesurant la radioactivité incorporée dans les différentes classes de molécules 6. rad En effet, des cohortes distinctes de mouches peuvent être nourrissubstrats iolabeled de la même manière et ensuite utilisé pour des expériences mouche pod ou la mesure de radiomarqueur qui sont stockées et reste en glycogène et de triglycérides dans nourris et jeûné conditions 6, par exemple. Une autre stratégie consiste à utiliser de courtes périodes d'étiquetage qui sont susceptibles de révéler l'oxydation des nutriments alimentaires radiomarqués eux-mêmes et non pas des formes de stockage de ces nutriments. Troisièmement, il est également possible que deux groupes de mouches pourraient avoir des taux identiques de 14 production de CO 2 sur une période de temps donnée, mais des vitesses très différentes au départ. Par conséquent, faire varier la quantité de temps qui vole passer dans la nacelle de mouche peut être un paramètre important de modifier l'évaluation de la variation phénotypique. Enfin, ce protocole prévoit l'utilisation d'une courte période de CO 2 anesthésie lors de la mise mouches dans l'appareil mouche pod. Il est possible que les CO 2 anesthésie peuvent affecter la fonction métabolique au cours de l'expérience mouche pod. Un suppléant approche est d'utiliser l' anesthésie d'azote qui ne modifie pas le taux métabolique 20.
Comme avec toute technique qui mesure un système aussi complexe que l'oxydation du carburant et le taux métabolique, le procédé décrit ici a des limites. Tout d' abord, il est possible que les mouches dans les différents groupes pourraient consommer différentes quantités de nourriture radiomarqué et ne serait donc entrer dans la phase de collecte de CO 2 de l'essai avec différentes quantités de départ de substrat. Ceci peut être contrôlé par une certaine mesure en effectuant l'expérience avec de grandes tailles d'échantillon et en alimentant les mouches en masse. Pour les périodes d'étiquetage courtes, les mouches avec les tripes de couleur bleue similaires auront consommé radiomarqueur et peuvent être reportés à la partie de chasse de l'expérience. La quantité de radiomarqueur restant dans un groupe de mouches peut également être mesurée à la fin de l'expérience et des cohortes distinctes de mouches après la fin de l'alimentation et de la période de chasse initiale. Deuxièmement, les niveaux d'activité entregroupes de mouches dans les gousses de mouches peuvent différer. Cela devra être déterminée expérimentalement et pris en compte lors de l'interprétation des données. Troisièmement, cette technique ne permet pas de mesurer la production totale de CO 2, seule la production d'un nutriment alimentaire spécifique ou la forme (s) de stockage de ce nutriment. Ce protocole ne remplace pas pour mais est complémentaire aux mesures de VCO 2 , car il fournit des informations différentes et complémentaires.
La méthode décrite ici mesures exhalé, CO 2 radiomarqué qui est un produit de l'oxydation des quantités infimes de substrats métaboliques spécifiques. En faisant varier l'étiquette utilisée – glucose, acides gras ou acides aminés – on peut concevoir des expériences de plus en plus sophistiqués pour évaluer les contributions des différents substrats du métabolisme dans différentes conditions physiologiques telles que la famine et sur différents fonds génétiques. Les applications futures de cette technique comprennent la mesure de METABOLIm dans les stades larvaires et pupes de développement, deux étapes du cycle de vie de Drosophila qui sont caractérisées par des extrêmes de stockage des éléments nutritifs et la ventilation, respectivement.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The author thanks Drs. Mingjian Lu and Morris Birnbaum for helpful advice and funding support from NIDDK (R21DK089391).
Materials
| PALMITIC ACID, [1-14C]-, 50 µCi | PerkinElmer | NEC075H050UC | |
| GLUCOSE, D-[6-14C]-, 50µCi | PerkinElmer | NEC045X050UC | |
| Glucose, D-[1-14C]-, 50µCi | PerkinElmer | NEC043X050UC | |
| Drosophila Vials, Narrow, Polystyrene | Genesee Scientific | 32-116 | |
| Round-Bottom Polypropylene Tubes, 12X75 mm | Fisher Scientific | 14-959AA | |
| Mesh, nitex nylon, 120 µm | Genesee Scientific | 57-102 | |
| 20ml borosilicate glass scintillation vials | Fisher Scientific | 03-337-15 | |
| Flask top stopper with off-center hole | Fisher Scientific | K882310-0000 | |
| Polypropylene center well | Fisher Scientific | K882320-0000 | |
| Whatman GF/B glass microfiber filter paper, circle, 2.1cm diameter | 09-874-20 | ||
| Ecoscint A | National Diagnostics | LS-273 | |
| 6ml Scintillation Vials with Push-On/Twist-Off Caps | National Diagnostics | SVC-06 |
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