מדידת ייצור פחמן דו-חמצני מן radiolabeled מצעים ב<em> תסיסנית</em
Summary
This paper describes a method for the measurement of fuel oxidation in Drosophila melanogaster in which trace amounts of specific radiolabeled metabolic substrates are fed to flies. The exhaled radiolabeled CO2 that is a produced from fuel oxidation is collected and measured.
Abstract
כוחה של הגנטיקה תסיסנית הולכת ומיושמת בהדרגה לשאלות של איתות הורמון ואת חילוף החומרים כדי פיתוח מודלים של מחלות אנושיות באורגניזם זה. רגישות שיטות למדידות של פרמטרים כגון קצב חילוף חומרים נדרשות לנהוג להבנת פיזיולוגיה ומחלות בבעלי חיים קטנים כמו זבוב הפרות. השיטה המתוארת כאן מעריך חמצון דלק במספרים קטנים של זבובים בוגרים נמאס מזון המכיל כמויות זעירות של 14 מצעים C שכותרתו כגון גלוקוז או חומצת שומן. לאחר תקופת ההאכלה וכל מניפולציות ניסיוני נוספות, זבובים מועברים צינורות קצרים כתרים עם רשת, אשר ממוקמים אז צלוחיות זכוכית המכילות נייר סינון KOH-רווי כי מלכודות נשף, CO radiolabeled 2 שנוצר מפני התחמצנות של מצעים רדיואקטיבי כמו אשלגן ביקרבונט, KHCO 3. ביקרבונט radiolabeled זו נמדד על ידי ספירת נצנץ. זהו aquantitative, לשחזור, גישה פשוטה לחקר חמצון דלק. השימוש של גלוקוז רדיואקטיבי, חומצות שומן, חומצות אמינו או מאפשר לקבוע את תרומתו של מקורות דלק שונים אלה לחילוף אנרגיה בתנאים שונים כגון האכלה וצום וב רקע גנטי שונה. זה משלים גישות אחרות המשמשות למדידה במטבוליזם אנרגית vivo וצריך לקדם את ההבנה של ויסות חילוף חומרים.
Introduction
עבודה באורגניזם מודל תסיסנית תרמה רבות להבנת עקרונות גנטיים, תהליכים התפתחותיים, צמיחה, הזדקנות, התנהגות, חסינות ומחלות של בני אדם 1,2. מספר עצום של גישות ביולוגיות גנטיות תא תסיסנית העלתה התקדמות בתחומים אלה. עם זאת, המחקר של חילוף החומרים זבוב הפירות פיתחה לאט יותר, בין השאר כתוצאה גדול קשיים במדידת פרמטרים מטבוליים חיה קטנה כזאת. העניין באמצעות תסיסנית כמודל לחקר מחלות אנושיות כגון סוכרת להבנת תרומתם של חילוף החומרים כדי פתולוגיות צמיחה שונים דחף בתחום לפתח ולהתאים טכניקות מטבולית אורגניזם הזה 3,4.
שיטות אמינות זמינות כעת למדידת מספר הפרמטרים מטבוליים זבוב הפרות. לדוגמה, זה פשוט להעריך את צריכת המזון <sעד> 5, רמות הטריגליצרידים מאוחסנים גליקוגן, כמו גם רמות hemolymph במחזור של גלוקוז והסוכר במחזור מרכזי לטוס, trehalose, שהינה דו סוכר המורכב משתי מולקולות של גלוקוז 4. שימוש קליעים נותבים מטבולית אפשרה בחקר מזין הקליטה מן הדיאטה ואת ההמרה של חומרים מזינים נספגים כגון גלוקוז אל גליקוגן צורות אחסון וטריגליצרידים 6. קצב חילוף החומרים ניתן להעריכם זבוב הפירות באמצעות מדידת צריכת החמצן 7,8 ופחמן דו חמצני (CO 2) ייצור. במעגל החומצה הציטרית מתחמצן יחידות דו-חמצנים שיכולים להיכנס למעגל כמו אצטיל-אנזים (COA), אשר נגזרה מטבוליזם של פחמימות בתזונה ומאוחסן וחומצות שומן. כל סיבוב של מחזור מייצר מולקולה אחת של GTP (או ATP) ואת תורם אלקטרון 2 FADH, שלוש מולקולות של NADH, ואת שתי מולקולות של CO פסולת 2. הפקה משותפת 2 יכוללהשתמש כדי להעריך את קצב חילוף חומרים בסיסי. ייצור הכולל CO 2 ניתן לכמת תסיסנית באמצעות-הזמין מסחרית או בעבודת יד respirometers 9-10,11.
מדידת הייצור הכולל CO 2, במיוחד כאשר מצמידים עם מדידת צריכת O 2, מספק תובנה חשובה לחילוף חומרים של אנרגיה לכל הגוף. עם זאת, מדד זה לא יזהה את המזין מלהיות חמצון עבור אדנוזין אדנוזין (ATP) ייצור. שלושה סוגים עיקריים של חומרים מזינים יכול להיכנס ההמרה הבאה מעגל החומצה הציטרית כדי אצטיל CoA: פחמימות, חומצות שומן, וחלבונים. גלוקוז-6-פוספט, נגזר מן הגלוקוז תזונתיים או הגליקוגן, ניתן להמיר ל פירובט כי הוא decarboxylated ידי פירובט דהידרוגנאז לגבש CoA אצטיל. התפלגות חומצות שומן נגזרות הדיאטה או טריגליצרידים מאוחסנים על ידי תשואות-חמצון ß אצטיל CoA כי אז נכנסה במעגל החומצה הציטרית. סוף כל סוף, ברוב של חומצות אמינו יכול להיכנס למעגל חומצת הלימון הבא המרתי ל פירובט, אצטיל ביניים מחזור CoA או חומצת לימון כגון ketoglutarate אלפא.
מזין ספציפי תרומה לחילוף אנרגיה במהלך בסיס ותנאי מגורה ניתן לנטר באמצעות קליעים נותבים רדיואקטיביים. הפרוטוקול המובא כאן הוא מותאם לשימוש תסיסנית מתוך פרוטוקול המשמש להערכת חמצון בתאים הגדלים בתרבית 12,13. לפי גישה זו, זבובי פרות ניזונים 14 מצעים מטבולית C-רדיואקטיבי (פחמימות, חומצות שומן, או חומצות אמינו) בתזונה לזמן קצר (שעות) או ארוכים (ימים) דופק, רדפו על מזון ללא תווית, ולאחר מכן נחשף תא המכיל אשלגן הידרוקסידי (KOH) נייר סינון -saturated על השמנת CO ננשף 2 כמו ביקרבונט. ניתן לכמת ביקרבונט radiolabeled ידי ספירת נצנץ. הבדלי radiolabeled-CO 2 ייצור בין הניסויקבוצות אל זבובים עשויות לשקף שימוש בדלקים שונים לייצור ATP במהלך של הבדלים מהר או פנימיים ממושך במטבוליזם דלק בין גנוטיפים, למשל.
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטוקול זה מתאר שיטה למדידת החמצון של מצעים רדיואקטיבי מסוימים תסיסנית מבוגר. טכניקה זו היא פשוטה, כמוני, לשחזור ורגיש, והוא משלים שיטות קיימות מודדות ייצור הכולל CO 2 וצריכה O 2 כי זה יכול לשמש כדי לזהות את המזין (s) being חמצון לייצור ATP.
מדידת CO 2 ששוחררה החמצון של מצעי radiolabeled ספציפיים באמצעות השיטה המתוארת כאן היא משלימה טכניקות המודדים ייצור CO 2 בקטגוריה כולה. הייצור הכולל CO 2 (CO2 V) מאפשר הערכה של קצב חילוף החומרים, וכאשר הצריכה הכוללת O 2 (V O2) ידוע, את קצב חילוף החומרים ניתן לחשב ואת מקור דלק עבור חמצון ניתן להעריך על בסיס יחס החליפין הנשימה (V O2 CO2 / V = RER). מתיפחמימות הן המצע בלעדי, RER = 1, אבל כאשר חומצות שומן הם המקור הבלעדי, RER = 0.7, בשל והרכב של התגובות של גלוקוז וחמצון שומנים. בהיעדר ציוד למדידת צריכת חמצן תסיסנית 14, מקור דלק החמצונים לא ניתן לזהות. עם זאת, על ידי תיוג טס עם כמויות זעירות של מצע רדיואקטיבי זו או אחרת ושיעורי מדידה של ייצור radiolabeled CO 2, אפשר להסיק מסקנות לגבי היכולת של זבובים לחמצן מצע נתון בנקודות זמן שונות במהלך גירוי או על ההשפעות של נתון מוטציה על חמצון דלק.
ישנם מספר שלבים קריטיים בפרוטוקול זה. ראשית, יש לנקוט משנה זהירות בעת שימוש בחומרים רדיואקטיביים כדי שלא יישפכו וזיהום של תחומי מחקר. שנית, כאשר בהרדמת זבובים במהלך השלבים 2.1 ו -3.4, הנסיין צריך לעבוד במהירות כדי למנוע תופעות של CO 2 ממושךחשיפה על חילוף חומרים ועל התנהגות. קבוצה של 20 זבובים יכולה להיות מורדמת והועברה בקבוקון חדש או לתוך תרמיל לטוס ב -20 שניות או פחות. כאשר נגזרים מנגנון הרדמה כדי בקבוקון מזון, הבקבוקון צריך להיות מונח על צידו כדי למנוע זבובים הרדימו מ להיתקע על פני שטח המזון. כאשר הזבובים מזון רדיואקטיבי הפד במהלך כמה ימים כמו בשלב 2.2, הנסיין צריך להבטיח כי המזון לא להתייבש כמו זבובים רגישים להתייבשות.
הפד או צם המדינה לפני תיוג, הבחירה של התווית, את משך הזמן תיוג, את משך הזמן בתרמיל לטוס, ואת שיטת ההרדמה הם פרמטרים שיכולים להיות חשוף פתרון בעיות ושינוי בעת שימוש בטכניקה זו. ראשית, זבובים נתונים תקופות תיוג קצרות (2 – 3 שעות) צפויים לצרוך כמויות משמעותיות של מזון רדיואקטיבי, אלא אם כן נתון תקופת צום לפני כן. שנית, הבחירה של ג תוויתלהשפיע מסקנות אחד יכול לצייר על פנוטיפים מטבוליים. לדוגמה, ייצור CO 2 רדיואקטיבי מ D- [1- 14 C] -glucose יכול לשקף חמצון דרך מחזור חומצת לימון או שנט פוספט pentose, בעוד שהייצור CO 2 רדיואקטיבי מ D- [6- 14 C] -glucose משקף חמצון דרך מחזור חומצת לימון בלבד 12,15,16. האכלת זבובים עם נותב רדיואקטיבי עבור חומצת אמינו חיונית 17,18 תהיה אסטרטגיה טובה להערכת חמצון של חומצות אמינו נגזרו חלבונים. לבסוף, תקופות תיוג ממושכות עם גלוקוז רדיואקטיבי גם מעלות את האפשרות של שילוב של מבשר זה למעמדות אחרות של מולקולות כגון טריגליצרידים 19 וחומצות אמינו כגון אלאנין, אשר interconverts בקלות עם פירובט. זה יכול להיות מוערך על ידי מדידת רדיואקטיביות שולבה מעמדות שונות אלה של מולקולות 6. ואכן, קבוצות נפרדות של זבובים יכולות להיות מוזן radiolabeled מצעים באותו אופן ואז המשמשים בניסויים תרמיל זבוב או מדידת radiolabel המאוחסן ונשאר גליקוגן וטריגליצרידים הפד וצם התנאים 6, למשל. אסטרטגיה נוספת היא להשתמש לתקופות קצרות תיוג כי צפויים לחשוף חמצון של הרכיבים התזונתיים radiolabeled עצמם ולא צורות אחסון של חומרים מזינים אלו. שלישית, אפשר גם כי שתי קבוצות של זבובים יכול להיות בשיעורים זהים של 14 ייצור CO 2 על פני פרק זמן נתון, אך בקצב שונה מאוד בתחילה. לכן, שינוי משך הזמן טס לבלות בתרמיל הזבובים עלול להיות פרמטר חשוב לשנות כאשר מעריכים וריאציה פנוטיפי. לבסוף, פרוטוקול זה מחייב שימוש של תקופה קצרה של CO 2 הרדמה כאשר לשים זבובים לתוך המנגנון תרמיל זבוב. יתכן כי הרדמה 2 CO עלול להשפיע על התפקוד המטבולי במהלך הניסוי תרמיל זבוב. ממלא מקוםpproach היא להשתמש הרדמה חנקן אשר אינה משפיעה על קצב חילוף החומרים 20.
כמו בכל טכניקה מודדת מערכת מורכבת כגון חמצון דלק קצב חילוף חומרים, השיטה המתוארת כאן יש מגבלות. ראשית, יתכן כי זבובים בקבוצות שונות עשויים לצרוך כמויות שונות של מזון רדיואקטיבי וכך היה נכנס שלב איסוף CO 2 של assay עם כמויות התחלה שונות של מצע. זה יכול להיות נשלט על במידה מסוימת על ידי ביצוע הניסוי עם מדגמים גדולים ועל ידי האכלת זבובים בהמוניהם. לתקופות תיוג קצרות, זבובים עם אומץ בצבע כחול דומה יהיה צרך את radiolabel וניתן להעברת חלק המרדף של הניסוי. כמות radiolabel שנותר קבוצה של זבובים ניתן למדוד גם בסוף הניסוי מתבצע בקבוצות נפרדות של זבובים לאחר תום ההנקה ותקופת מרדף ראשוני. שנית, רמת הפעילות ביןקבוצות של זבובי התרמילים לטוס עשויות להיות שונות. זה יצטרך להיקבע באופן ניסיוני ומובאות כאשר לפרש נתונים. שלישית, טכניקה זו אינה מודדת ייצור הכולל CO 2, ייצור רק מזין תזונתי ספציפי או בצורת האחסון (ים) של המזין. פרוטוקול זה אינו מהווה תחליף אלא הוא משלים מדידות של VCO 2 משום שהוא מספק מידע שונה נוסף.
השיטה המתוארת כאן מודד נשף, radiolabeled CO 2 כי הוא תוצר של חמצון של כמויות זעירות של מצעים מטבוליים ספציפיים. על ידי שינוי התווית בשימוש – גלוקוז, חומצות שומן, או חומצת אמינו – אחד יכול לעצב ניסויים מתוחכמים יותר ויותר להעריך את תרומתם של מצעים שונים למטבוליזם בתנאים פיסיולוגיים שונים כגון הרעבה על רקע גנטי שונה. יישומים עתידיים של טכניקה זו כוללים מדידת metabolisמ בשלבי זחל גלמים של פיתוח, שני שלבי מחזור החיים תסיסנית המאופיינות קצוות של אחסון מזין והתמוטטות, בהתאמה.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The author thanks Drs. Mingjian Lu and Morris Birnbaum for helpful advice and funding support from NIDDK (R21DK089391).
Materials
| PALMITIC ACID, [1-14C]-, 50 µCi | PerkinElmer | NEC075H050UC | |
| GLUCOSE, D-[6-14C]-, 50µCi | PerkinElmer | NEC045X050UC | |
| Glucose, D-[1-14C]-, 50µCi | PerkinElmer | NEC043X050UC | |
| Drosophila Vials, Narrow, Polystyrene | Genesee Scientific | 32-116 | |
| Round-Bottom Polypropylene Tubes, 12X75 mm | Fisher Scientific | 14-959AA | |
| Mesh, nitex nylon, 120 µm | Genesee Scientific | 57-102 | |
| 20ml borosilicate glass scintillation vials | Fisher Scientific | 03-337-15 | |
| Flask top stopper with off-center hole | Fisher Scientific | K882310-0000 | |
| Polypropylene center well | Fisher Scientific | K882320-0000 | |
| Whatman GF/B glass microfiber filter paper, circle, 2.1cm diameter | 09-874-20 | ||
| Ecoscint A | National Diagnostics | LS-273 | |
| 6ml Scintillation Vials with Push-On/Twist-Off Caps | National Diagnostics | SVC-06 |
References
- Wangler, M. F., Yamamoto, S., Bellen, H. J. Fruit flies in biomedical research. Genetics. 199 (3), 639-653 (2015).
- Bier, E. Drosophila, the golden bug, emerges as a tool for human genetics. Nat Rev Genet. 6 (1), 9-23 (2005).
- Owusu-Ansah, E., Perrimon, N. Modeling metabolic homeostasis and nutrient sensing in Drosophila: implications for aging and metabolic diseases. Dis Model Mech. 7 (3), 343-350 (2014).
- Tennessen, J. M., Barry, W. E., Cox, J., Thummel, C. S. Methods for studying metabolism in Drosophila. Methods. 68 (1), 105-115 (2014).
- Deshpande, S. A., Carvalho, G. B., et al. Quantifying Drosophila food intake: comparative analysis of current methodology. Nat methods. 11 (5), 535-540 (2014).
- Bland, M. L., Lee, R. J., Magallanes, J. M., Foskett, J. K., Birnbaum, M. J. AMPK supports growth in Drosophila by regulating muscle activity and nutrient uptake in the gut. Dev biol. 344 (1), 293-303 (2010).
- Hulbert, A. J., Clancy, D. J., Mair, W., Braeckman, B. P., Gems, D., Partridge, L. Metabolic rate is not reduced by dietary-restriction or by lowered insulin/IGF-1 signalling and is not correlated with individual lifespan in Drosophila melanogaster. Exp Geront. 39 (8), 1137-1143 (2004).
- Van Voorhies, W. A. Metabolic function in Drosophila melanogaster in response to hypoxia and pure oxygen. J. Exp. Biol. 212 (19), 3132-3141 (2009).
- Montooth, K. L., Marden, J. H., Clark, A. G. Mapping determinants of variation in energy metabolism, respiration and flight in Drosophila. Genetics. 165 (2), 623-635 (2003).
- Yatsenko, A. S., Marrone, A. K., Kucherenko, M. M., Shcherbata, H. R. Measurement of metabolic rate in Drosophila using respirometry. JoVE. (88), e51681 (2014).
- Icreverzi, A., de la Cruz, A. F., Van Voorhies, W. A., Edgar, B. A. Drosophila cyclin D/Cdk4 regulates mitochondrial biogenesis and aging and sensitizes animals to hypoxic stress. Cell cycle. 11 (3), 554-568 (2012).
- Tuttle, S., Muschel, R., Bernhard, E., McKenna, W. G., Biaglow, J. Decreased ability of cells overexpressing MYC proteins to reduce peroxide and hydroperoxides. Br J Cancer. 27, 140-144 (1996).
- Ontko, J. A., Jackson, D. Factors affecting the rate of oxidation of fatty acids in animal tissues. Effect of substrate concentration, pH, and coenzyme a in rat liver preparations. J Biol Chem. 239, 3674-3682 (1964).
- Vincent, A., Briggs, L., et al. parkin-induced defects in neurophysiology and locomotion are generated by metabolic dysfunction and not oxidative stress. Hum Mol Gen. 21 (8), 1760-1769 (2012).
- Katz, J., Abraham, S., Hill, R., Chaikoff, I. L. The occurrence and mechanism of the hexose monophosphate shunt in rat liver slices. J Biol Chem. 214 (2), 853-868 (1955).
- Katz, J., Wood, H. G. The use of glucose-C14 for the evaluation of the pathways of glucose metabolism. J Biol Chem. 235 (8), 2165-2177 (1960).
- Piper, M. D. W., Blanc, E., et al. A holidic medium for Drosophila melanogaster. Nat methods. 11 (1), 100-105 (2014).
- Sang, J. H., King, R. C. Nutritional Requirements of Axenically Cultured Drosophila Melanogaster Adults. J Exp Biol. , (1961).
- Chernick, S. S., Chaikoff, I. L. Insulin and hepatic utilization of glucose for lipogenesis. J Biol Chem. 186 (2), 535-542 (1950).
- Van Voorhies, W. A., Khazaeli, A. A., Curtsinger, J. W. Testing the “rate of living” model: further evidence that longevity and metabolic rate are not inversely correlated in Drosophila melanogaster. J Appl Phys. 97 (5), 1915-1922 (2004).
