Simultaneous Assessment of Cardiomyocyte DNA Synthesis and Ploidy: A Method to Assist Quantification of Cardiomyocyte Regeneration and Turnover

Gavin D. Richardson

doi:10.3791/53979

JoVE Journal > Developmental Biology

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

Developmental Biology

Gelijktijdig Beoordeling van Cardiomyocyte DNA Synthese en Ploïdie: een methode om Assist Kwantificering van Cardiomyocyte Regeneration en Omzet

Published: May 23, 2016

doi:

10.3791/53979

Gavin D. Richardson¹

¹Institute of Genetic Medicine, International Centre for Life,Newcastle University

Summary

Quantification of cardiomyocyte turnover is challenging. The protocol described here makes an important contribution to this challenge by enabling accurate and sensitive quantification of neo-cardiomyocyte nuclei generation and nuclei ploidy.

Abstract

Hoewel wordt aangenomen dat het hart heeft een beperkte mogelijkheden om hartspiercellen na letsel en dat lage niveaus van de omzet cardiomyocyt situaties zich voordoet tijdens de normale veroudering te regenereren, kwantificering van deze gebeurtenissen blijft uitdagend. Dit is gedeeltelijk te wijten aan de zeldzaamheid van het proces en het feit dat meerdere cellulaire bronnen dragen bij aan het myocard onderhoud. Bovendien DNA duplicatie in cardiomyocyten leidt vaak tot een polyploïde cardiomyocyten en slechts zelden leidt tot nieuwe hartspiercellen door celdeling. Om nauwkeurig te kwantificeren cardiomyocyt omzet onderscheid tussen deze processen is essentieel. De hier beschreven protocol maakt gebruik nucleoside etikettering lange termijn om alle kernen die zijn ontstaan als gevolg van DNA-replicatie en cardiomyocyten kernen geïdentificeerd door gebruik kernen isolatie en vervolgens PCM1 immunokleuring labelen. Samen toelaat nauwkeurige en gevoelige identificatie van de nucleoside etikettering van de cardiomyocyte kernen bevolking. Verder 4 ', 6-diamidino-2-fenylindol labeling en analyse van kernen ploïdie, maakt de discriminatie van neo-cardiomyocyt kernen van nuclei die in polyploïdisatie nucleoside hebben opgenomen. Hoewel deze methode niet kan controleren voor cardiomyocyt binucleation, is het mogelijk een snelle en robuuste kwantificering van neo-cardiomyociet kernen, terwijl goed voor polyploïdisatie. Deze methode heeft een aantal afgeleide toepassingen zoals het beoordelen van mogelijke therapieën voor regeneratie cardiomyocyten verhogen of onderzoeken van de effecten van hartziekten op cardiomyocyten omzet en ploïdie. Deze techniek is ook geschikt voor de extra benedenstroomse immunohistologische technieken, waardoor kwantificatie van nucleoside incorporatie in alle cardiale celtypen.

Introduction

In de afgelopen jaren is er een opeenstapeling van bewijs tegen de veronderstelling dat het hart is een terminaal gedifferentieerde, post-mitotische orgel ^1,2 geweest. Echter, kwantificering van cardiomyocyt omzet en regeneratie blijft uitdagend.

De moeilijkheden bij het nauwkeurig identificeren van zeldzame cardiomyocyt generatie met behulp van standaard immunohistochemische technieken zijn goed gerapporteerd ^3. Bovendien, de cellulaire bron van cardiomyocyten generatie blijft onzeker bewijs bijdrage per cardiomyocyt proliferatie en differentiatie van stamcellen ^4-6. Daarom is het gebruik van lineage tracing modellen waarbij kennis van de cardiomyocyt voorlopercellen fenotype vereist onmogelijk en kwantificering van proliferatie in één populatie, zoals cardiomyocyten, ongepast is. Verder een cardiomyocyten het potentieel voor endoreplicatie zonder karyokinesis (resulterend in een polyploïde autodiomyocyte) of karyokinesis bij afwezigheid van cytokinese (resulterend in een binucleaire cardiomyocyten) ^7,8. De kwantificatie van de omzet cardiomyocyten afhankelijk van het vermogen om onderscheid te maken tussen deze gebeurtenissen en waar neo-cardiomyocyt generatie. Dit creëert unieke complicaties omdat DNA replicatie en expressie van cycline-afhankelijke kinasen in cardiomyocyten niet alleen tonen waar celdeling ^9,10.

Te helpen bij de kwantificering van neo-cardiomyocyt generatie, hebben we een gevestigde kernen isolatietechniek en immunologische kenmerken van pericentriolar materiaal 1 (PCM1) voor cardiomyocyten kernen identificatie gecombineerd zoals beschreven door Bergmann et al. ^7,11 met nieuwe werkwijzen voor langdurige DNA-etikettering en ploïdie analyse. PCM-1 is een centrosome eiwit dat accumuleert in de kern oppervlak van gedifferentieerde, niet-myocyten fietsen. Eerdere studies hebben aangetoond dat antilichamen tegenPCM-1 specifiek label cardiomyocyten kernen ^7,11 en als zodanig PCM1 is gebruikt door een aantal onafhankelijke groepen cardiomyocyten ^1,12,13 identificeren. Bovendien hebben we aangetoond dat expressie PCM1 kaarten genetisch gelabeld cardiomyocyten kernen in de TnT-Cre transgene muismodel ¹⁴ (aanvullende figuur 1).

De hier beschreven protocol maakt de nauwkeurige en gevoelige identificatie van neo cardiomyocyt nucleatie in het muizenhart, ongeacht de cellulaire oorsprong (Figuur 1A en B), terwijl tegelijkertijd uitzondering nucleoside labeling door polyploïdisatie van de analyse (figuur 1C en D). Hoewel deze methode niet kan worden bediend cardiomyocyten binucleation, is het mogelijk een snelle en gefundeerde kwantificering neo-cardiomyocyt kernen die nodig is voor de kwantificatie van de omzet cardiomyocyt. Voortshet biedt een snelle screening tool om potentiële veranderingen in de dynamiek van cardiomyocyt generatie te beoordelen.

Terwijl DNA labeling omvat gewoonlijk 5-Broom-2'-deoxyuridine (BrdU) als thymidine analoge, de hier beschreven protocol maakt gebruik van een 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (EDU) gebaseerde assay zoals minder verwerkingsstappen voor een snellere vereist doorvoercapaciteit en vereist geen denaturering van het DNA voor immunodetectie, waardoor compatibel met andere immunokleuring protocollen en daarmee de mogelijke verdere toepassingen van de werkwijze toeneemt.

Figuur 1: Continue pulseren met Edu labels neo-hartspiercellen, ongeacht hun voorouders. (A) EDU wordt geïncorporeerd in het DNA van cardiomyocyten tijdens de celdeling. Proliferatie in de cardiomyocyt bevolking zal Result een verhoging van, of vervanging van cardiomyocyten en derhalve productieve DNA synthese (draagt weefsel onderhoud en reparatie). (B) EDU is opgenomen in het DNA van cardiale progenitorcellen tijdens de celdeling. Dit zal in de cel behouden tijdens differentiatie de cardiomyocyt lijn. Deze stamcel differentiatie leidt ook tot een toename van het aantal cardiomyocyten en levert dus weefsel onderhoud en reparatie. (C) Cardiomyocytes het potentieel hebben om "niet-productieve" DNA replicatie resulteert in verhoogde ploïdie cardiomyocyten, die wordt geassocieerd met cardiomyocyt hypertrofie en myocardiale remodeling ondergaan, maar niet verloren cardiomyocyten vervangen. Werkwijze polyploïdisatie verschilt binucleation aangezien zij leidt tot een cardiomyocyt met één kernen die vier of meer sets van twee homologe chromosomen (> 2 N) bevat. (D) Naar aanleiding van een continue kernen pulse Dit protocol beschrijft kernen isolatie en identificatie van de cardiomyocyt kernen door PCM1 uitdrukking kwantificering van zowel cardiomyocyt ploïdie en Edu integratie mogelijk te maken. PCM1 expressie en Edu integratie gedetecteerd met behulp van flowcytometrie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Protocol

Animal toestemming is verleend en door de Universiteit van Newcastle Ethics Review Board goedgekeurd. Alle dierlijke procedures werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen van Richtlijn 2010/63 / EU van het Europees Parlement over de bescherming van dieren die voor wetenschappelijke doeleinden worden gebruikt. 1. EDU Administration Edu lossen in steriele zoutoplossing (0,9% w / v) bij een eindconcentratie van 12,5 mg / ml. Verwarm de oplossing tot 40 ° C en vortex om volledig op te lossen. WINKEL genoeg edu / zoutoplossing bij 4 ° C om alle muizen te injecteren in de studie waardoor 6 dagelijkse injecties. Opmerking: normaal meer dan 6 muizen worden voor elke experimentele groep. Echter dient vermogen berekeningen worden uitgevoerd voor onafhankelijke studies. Weeg individuele muizen. Bereken het benodigde volume tot 100 ug / g van Edu / zoutoplossing aan elke muis (8 ul van voorraad Edu oplossing per g) beheren. Teken de juiste volume van Edu / zoutoplossing in insulinespuit met een 25 G naald. Voer intraperitoneale (ip) injecties, terwijl de behandeling van de muizen met behulp van goedgekeurde Thuiskantoor technieken. Plaats een muis in de kooi deksel. Trek terug op de basis van de staart en stevig vastpakken van de muis door het nekvel. Expose de buik voor injectie door het vasthouden van de muis met de wijsvinger en duim dichtbij de basis van de kop en storten kop van het dier naar achteren naar de vloer. Veeg de buik met 70% alcohol oplossing. Lokaliseren middellijn van het dier en kwadrant rechtsonder. Spuit de EDE / zoutoplossing in het dier in de onderste rechter kwadrant. Injecteren muizen met Edu / zoutoplossing en het tijdstip van de dag vast te leggen. Herhaal stap 1,2 tot 1,4 op hetzelfde tijdstip van de dag, gedurende 6 opeenvolgende dagen. Opmerking: Als edu negatieve controle nodig is om de gating voor flowcytometrische analyse ingesteld, injecteert tegen leeftijd, geslacht en experimenteel overeenkomened muis met een equivalent volume zoutoplossing zonder Edu. Dit zal de benodigde controle (geen EDU control) te verstrekken. Deze controle moet worden opgenomen voor elk onderzoek om variaties in batches reagentia en cytometer ingesteld. 2. Oogsten Hearts Na 24 uur na het 6e EDE injectie, offeren de muizen met behulp van cervicale dislocatie (of een alternatieve Schedule 1 van Binnenlandse Zaken goedgekeurde methode). Plaats opgeofferd dier in liggende positie en maken de huid incisie van het midden buik om het membraan met chirurgische schaar. Snijd het membraan, en houden het borstbeen vanaf de lichaamsholte, gesneden bilateraal aan het hart bloot te leggen. Til het hart licht en snijd de grote bloedvaten van de uitstroom-darmkanaal naar het hart ontleden uit de borstholte. Plaats onmiddellijk elk hart in een afzonderlijke 15 ml centrifugebuis die 10 ml PBS afgekoeld tot 4 ° C. Transfer harten SEPderlijke 10 cm petrischalen, met een scalpel gesneden elke hart in twee in een sagittale richting en was het hart door voorzichtig te knijpen met een pincet. Vervang vervolgens de PBS om zoveel bloed te verwijderen mogelijk te maken. Herhaal deze stap twee keer. Plaats beide delen van elk hart in hetzelfde individu 1,5 ml microcentrifugebuis. Ga verder met stap 3 of als alternatief op te slaan exemplaren -80 ° C zoals beschreven in de stappen 2.9 en 2.10. Met een 25 G naald, maak een gaatje in de microcentrifugebuis deksel om het deksel niet worden geopend door de uitbreiding van gassen wanneer het hart wordt verwerkt. Label elke microcentrifugebuis en plaats in een container van vloeibare stikstof te bevriezen. 3. Kernen dissociatie en Cardiomyocyte Kernen Labeling Opmerking: Deze kernen dissociatie en cardiomyocyten kernen etikettering wordt aangepast van die van Bergmann et al 11 Deze werkwijze alle monsters geïnjecteerd.met Edu en zoutoplossing ingespoten (geen EDU control) negatieve controle. Zie tabel 1 voor het recept van oplossingen nodig is om deze stappen uit te voeren. Voor elk hart te analyseren, plaats 36 ml van 1% BSA / PBS-oplossing in een ultracentrifuge buis, incubeer gedurende 30 min, gooi de oplossing en laat aan de lucht drogen. Opmerking: Deze buis wordt gebruikt in stap 3,6. Plaats individuele bevroren harten op een 10 mm schotel op ijs en gehakt met behulp van een scalpel waardoor de harten te ontdooien tijdens het hakken proces. Plaats gehakt harten in 15 ml Cell Lysis Buffer in een 50 ml centrifugebuis en gehomogeniseerd met een probe homogenisator gedurende 15 seconden bij 25.000 rpm bij kamertemperatuur. Nogmaals 15 ml Cell Lysis Buffer aan de centrifugebuis overgebracht in een 40 ml Dounce met een grote speling stamper. Voer 10 slagen met de stamper en te filteren door middel van een 100 um dan 40 micrometer cel zeef in een 50 ml centrifugebuis. Centrifugeer gedurende 10 min eent 700 xg bij 4 ° C en verwijder het supernatant. Resuspendeer de nucleaire pellet in 25 ml sucrosegradiënt oplossing en laag het celkernen bevattende oplossing boven 10 ml vers sucrosegradiënt oplossing in de ultracentrifuge gereedgemaakte buis 3,1. Centrifugeer bij 13.000 xg gedurende 1 uur bij 4 ° C met een bal dunne buis rotor. Na het centrifugeren, gooi het supernatant en resuspendeer de kernen pellet in 1300 ui kernen opslag buffer in een 1,5 ml microcentrifugebuis en label PCM1. Verwijder 300 pi van de suspensie naar een nieuwe microcentrifugebuis en toe te voegen aan 700 ul van verse kernen opslag buffer. Label deze buis als ISO controle. Add anti-PCM1 bij een uiteindelijke concentratie van 8 ug / ml aan de microcentrifugebuis gemerkte PCM1 en voeg konijn IgG isotype controle-antilichaam bij een concentratie van 8 ug / ml aan de microcentrifugebuis gemerkte ISO control. Incubeer overnacht bij 4 ° C. Na incubatie, centrifugeer bij 700 xg gedurende 10 min, gooi het supernatans vervangen door 1 ml verse kernen opslagbuffer, hersuspenderen en centrifugeren opnieuw voor 10 min bij 700 x g. Verwijder het supernatant en vervangen door 1 ml verse kernen opslagbuffer. Voeg 1 pl F (ab ') 2 fragment van geit anti-konijn IgG (H + L) antilichaam (FITC of gelijkwaardig groene fluorescerende kleurstof) tot een eindconcentratie van 2 ug / ml te bereiken. Opmerking: Het gebruik van een F (ab ') 2 fragment antilichaam vermindert de kans op niet-specifieke labeling van immuuncellen zoals macrofagen en B-cellen. Wrap buizen aluminiumfolie ter bescherming tegen licht en incubeer gedurende 1 uur bij 4 ° C. 4. Detectie van Edu Incorporation Verdun 10x geconcentreerd Edu reactie buffer 01:10 met gedemineraliseerd water. Centrifuge de PCM-1 en ISO controle gelabelde kernen schorsingen bij 700 g gedurende 10 min, gooi het supernatant en resuspendeer de kernen pellet in 1 ml1% BSA / PBS oplossing. Was de kernen pellet tweemaal. Na de laatste wasbeurt, gooi het supernatant en te vervangen door 100 ul van EDU fixatief. Wikkel buizen aluminiumfolie ter bescherming tegen licht en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 15 min. Was de monsters tweemaal met 1 ml van 1% BSA / PBS oplossing, centrifugeer bij 700 xg en incubeer met 1x saponine gebaseerde permeabilisatie oplossing bij kamertemperatuur gedurende 15 min. Bereid 1x Edu etikettering cocktail (tabel 2). Minimaal 2 reacties nodig zijn om de controle geen EDU omvatten. Voeg 500 ul van 1 x EDU etikettering cocktail direct aan elk monster reeds kiembevattende in 100 pl 1x saponine gebaseerde permeabilisatie oplossing en incubeer bij kamertemperatuur beschermd tegen licht gedurende 30 minuten. Centrifugeer bij 700 xg en resuspendeer in 1 ml van 1% BSA / PBS en herhaal deze stap nog twee keer. Centrifuge bij 700 xg, verwijder supernatant en te vervangen door 400 ul van DNA-kleuring-oplossing (zie tabel of Materials). Naam van het reagens 1. Cell Lysis Buffer 0,32 M sucrose 10 mM Tris-HCl (pH = 8) 5 mM CaCl2 5 mM magnesiumacetaat 2,0 mM EDTA 0,5 mM EGTA 1 mM DTT 2.Sucrose Gradient Solution 2,1 M sucrose 10 mM Tris-HCl (pH = 8) 5 mM magnesiumacetaat 1 mM DTT 3. Kernen opslagbuffer (NSB) 0,44 M sucrose 10 mM Tris-HCl (pH = 7,2) 70 mM KCl 10 mM MgCl2 1,5 mM spermine Tabel 1: Kernen isolatie buffer ingrediënten Recept voor alle Buffers worden gebruikt in protocol deel 3 (Kernen dissociatie en cardiomyocyten kernen etikettering).. 5. Flow cytometrische analyse Opmerking: Voer Flowcytometrie op geïsoleerde kernen zoals eerder 7,11,15 beschreven. Maak eerst een perceel beschrijft Forward Scatter (FSC) en zijwaartse verstrooiing (SSC) aan de discriminatie van de kernen van puin (Figuur 2A) mogelijk te maken. Maak een complot om enkele kernen van aggregaten (figuur 2B) discrimineren door het uitzetten 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole) (DAPI) gebied (3-405 / 450/50-A) versus de hoogte (33-405 / 450 / 50-H). Zorg ervoor that de 3-405/450/50-A-signaal wordt verzameld op de lineaire schaal naar de juiste bepaling van DNA-inhoud toe te staan. Maak een plot beschrijft 488/535/30 A (PCM-1) vs SSC en slechts gebeurtenissen uit de singlet poort gecreëerd in 5.2 weer te geven met het oog op PCM-1 expressie te evalueren in de singlet bevolking. Voer het isotype controle monster met het oog op een PCM-1 positieve gate (figuur 2C) vast te stellen. Voer een kleine hoeveelheid PCM1 gelabeld monster tot PCM1 verifiëren expressie bevolking en gating positie. Maak een perceel beschrijven SSC-A versus 405/450/50-A (tot DAPI te detecteren). In deze plot, alleen weergave singlet PCM1 uitdrukken kernen, met behulp van de poorten die in 5.3. Gebruik dit complot om een extra hiërarchische poort die alleen 2N kernen (figuur 2D) bevat. Maak een plot dat beschrijft 488/535/30 A vs 1-633/660/20-A tot de identificatie van Edu etikettering van het PCM1 uitdrukken cardiomyocyt bevolking mogelijk te maken. Enkel weergeven kernen die singlet, P zijn CM1 + 2N met de bovenstaande gating. Ren hart monster van geen EDU controle om de EDU positieve gate (figuur 2E) in te stellen. Maak de juiste gate voor EDU + cellen. Record en kwantificeren singlet, PCM-1 uitdrukken, 2N kernen die Edu hebben opgenomen. Bereken deze populatie als percentage van de totale singlet, PCM1 + kernen. Dit zal de mate van neo-cardiomyocyt nucleatie verschaffen gedurende de 7 dagen EDU pulsperiode als percentage van de totale cardiomyocyt kernen. Opmerking: Als DAPI binding aan DNA stoichiometrische de fluorescentie-intensiteit evenredig is met de hoeveelheid DNA. Ploïdie bepalen op basis van de intensiteit van de 405/450/50 A-signaal, zoals hierboven beschreven 7. Om de ploïdie binnen het totale cardiomyocyt bevolking te evalueren gebruik maken van de plot in 5.5 opgericht en een gating strategie gebaseerd op DNA-concentratie 7. /files/ftp_upload/53979/53979fig2.jpg "/> Figuur 2:. Gating strategie om cardiomyocyt Edu oprichting en ploïdie kwantificeren (A) Kernen worden onderscheiden van puin op basis van voorwaartse verstrooiing (FSC) en zijwaartse verstrooiing (SSC). (B) een lineaire poort gemaakt en de singlet kernen populatie is geïdentificeerd op basis van DAPI etikettering en 405/450/50 hoogte vs area signaal. (C) Fluorescerende gating maakt de scheiding van cardiomyocyt kernen (PCM-1-positief) en niet-cardiomyocyt (PCM-1-negatieve) kernen van hartweefsel. (D) Intensiteit van DAPI signaal wordt gebruikt om DNA-concentratie en aldus kernen ploïdie van de PCM1 + cardiomyocyten populatie te bepalen. In muizen> 80% cardiomyocyt kernen diploïde (2n). (E) Fluorescent venstertijd maakt de scheiding van 2N, cardiomyocyt kernen die Edu (PCM + / EDU + = 0,9%) hebben opgenomen van 2N, hartspiercellen die niet hebben opgenomen Edu (PCM + onderwijs). Alle stappen worden beschreven in het protocol 5.0. Zo blijkt uit MDX -. / Y muizen op de C57 / BL10 achtergrond Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Representative Results

Deze methode maakt de kwantificering van de toegenomen Edu opname als gevolg van cardiomyocyt kernen divisie terwijl de controle voor verhoogde polyploïdisatie. Met een BrdU gebaseerde test, we eerder aangetoond dat het zoogdierhart reageert op chronische cardiomyocyten verlies in het mdx muismodel voor Duchenne spierdystrofie, de regeneratie van nieuwe cardiomyocyten. We hebben de hier beschreven onze gepubliceerde bevindingen verder te valideren en de bruikbaarheid van het protocol tonen methoden. Zoals aangegeven in het protocol beschreven; volwassene (12 weken oud) MDX en controle BL10 muizen werden gepulseerd met een dagelijkse injectie van Edu voor 7 dagen, meldde eerder statisch analyse tussen experimentele groepen 5,13 toe te staan. Immunohistologische analyse van gepulste harten toont de aanwezigheid van PCM1 uitdrukken hartspiercellen die Edu (figuur 3A) hebben opgenomen. De gegevens verkregen using immunohistologische methoden kunnen worden verkeerd geïnterpreteerd, zoals andere celtypen die Edu zijn overgenomen kunnen worden ten onrechte aangemerkt als hartspiercellen. Een voorbeeld hiervan wordt getoond in Figuur 1A en aanvullende B. Verder immunohistologische methoden geen onderscheid polyploïdisatie van nucleaire divisie. De flowcytometrie analyse beschreven in dit protocol stelt de snelle kwantificering van de cardiomyocyt nucleaire divisie in mdx en controle muizen, met uitsluiting van cellen die Edu was opgenomen als gevolg van polyploïdisatie. Vergelijkbaar met eerder gepubliceerde gegevens 13, analyse onthulde een verhoging van de prijs van neo-cardiomyocyt nucleatie in de mdx muisharten vergelijking met leeftijd gematchte controles (1,2% versus 0,17%; figuur 3B en C). Figuur 3: </strong> Kwantificering van Edu gelabeld hartspiercellen in wild-type en mdx hart. (A) Afbeelding van Z-stack projecties genomen van 40 pm dikke secties van mdx harten. PCM-1 tot expressie cardiomyocyt kernen (groen), die Edu (rood) heeft opgenomen. Gele pijl geeft aan Edu label hartspiercellen. i en ii geeft individuele EDU gelabeld cardiomyocyten in de Z-vlak. Kernen gelabeld met DAPI (blauw) (B en C) Flowcytometrie van geïsoleerde kernen tonen representatieve percelen 12-13 weken oude wild-type (C57 / BL10) en mdx muizen (MDX – / y op de C57 / BL10 achtergrond). (B) Histogram tonen DAPI intensiteit en de discriminatie tussen 2N en> 2N kernen. (C) Plots zien Edu opname in de 2N cardiomyocyt kernen bevolking wanneer geanalyseerd zoals beschreven in dit protocol. Voor alle muizen Edu toegediend gedurende 1 week vanaf 12 weken oud. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Aanvullende Figuur 1:. PCM-1 is een specifieke merker voor cardiomyocyten kernen gebruiken protocol beschreven kernen werden geïsoleerd uit een dubbele transgene muizen verkregen door kruising TNT-Cre muizen 14 met ROSA nT / nG cre gevoelige reporter lijn 16. In de resulterende muis cre activering onder de controle van troponine T (TNT) promotor leidt tot onomkeerbare expressie van GFP met is gelokaliseerd in de kernen. Kernen gelabeld met isotype controle (Iso) toont het vermogen aan de GFP expressie cardiomyocyt kernen populatie (488/530/30-A) te identificeren. Etikettering van kernen met anti-PCM1 (secundair antilichaam gedetecteerd door 633-660/20-A) toont de correlatie van PCM1 expressie met de GFP tot expressie cardiomyocyte kernen bevolking. In dit voorbeeld is 98,8% van de cardiomyocyt kernen zoals aangegeven door TNT promoter activiteit, worden gelabeld door PCM1 antilichaam. Klik hier om Aanvullende Figuur 1 te downloaden. Aanvullende Figuur 2:. Uitdagingen voor het kwantificeren cardiomyocyten vernieuwing door immunohistologische technieken (A) 2D beeld toont twee PCM-1 expressie cardiomyocyt kernen (groen) die ook worden gelabeld voor edu (rood) weergegeven. Gele pijlen geven wat lijkt op hartspiercellen die Edu hebben opgenomen zijn. Dit komt door de schijnbare co-lokalisatie van PCM1 expressie en EDU etikettering wanneer zichtbaar gemaakt met 2-dimensionale beeldvorming. (B) een 3-dimensionale projectie van dit beeld worden de EDU gemerkte cellen niet cardiomyocyten maar niet-cardiomyocyt cellen bovenliggende PCM1 expressie cardiomyocyten kernen. C57 / BL10 muizen op 12 weken oud gebruikt voor experimenten. Klik hier om Aanvullende Figuur 2A te downloaden. Klik hier om te downloaden Aanvullende Figuur 2B. reactiecomponenten Aantal reacties 2 5 PBS 875 pl 2,19 ml Copper beschermer 20 gl 50 gl Fluorescerende kleurstof picolyl azide 5 gl 12,5 pl verdund reactiebuffer bereid in 4.1 100 gl 250 gl Totaal reactievolume 1 ml 2,5 ml Tabel 2: Edu cocktail ingrediënten. Recept voor Edu etikettering cocktail nodig in protocol deel 4 (Detectie van Edu oprichting).

Discussion

Om nauwkeurig te kwantificeren omzet cardiomyocyt en regeneratie assays moeten onderscheid maken tussen echte cardiomyocyt generatie en niet-productieve DNA divisie. Vele studies blijven deze niet-productieve gebeurtenissen gewoon negeren, het kwantificeren van cardiomyocyt proliferatie uitsluitend via de expressie van cycline kinesis en celcyclus markers. Om een enkele methode die de nauwkeurige kwantificering van de omzet cardiomyocyt maakt terwijl de controle voor deze niet-productieve gebeurtenissen zinspelend blijft dateren. In het bijzonder blijft het moeilijk om rekening te cardiomyocyt polyploïdisatie die tot bijdraagt tot ~ 65% cardiomyocyt DNA replicatie ^13. Derhalve helpen bij de accurate kwantificering van cardiomyocyten generatie hebben we een protocol dat de gefundeerde kwantificering van de tarieven van neo cardiomyocyt kernen maakt met uitsluiting van DNA-replicatie die leidt tot verhoogde ploïdie ontwikkeld. Hoewel dit protocol kan geen discriminatie tussen de neo-cardiomyociet generatie en cardiomyocyten bi-nucleatie, kan het snel worden gebruikt en nauwkeurig te berekenen de bovengrens (goed voor ploïdie) van cardiomyocyt generatie. Dit protocol geeft daarom een screening tool om mogelijke veranderingen in de tarieven van de cardiomyocyt generatie en polyploïdisatie in ziektemodellen te beoordelen of om het potentieel rendement van therapieën te evalueren. Nadat de wijzigingen in de snelheid van neo-cardiomyocyt nucleatie worden geïdentificeerd met dit protocol latere studies kunnen worden gebruikt om vast te stellen of deze door veranderingen in cardiomyocyten generatie cardiomyocyten nucleatie nummer, zoals hiervoor beschreven ^2,13,17,18. Deze omvatten het gebruik van histologische kwantificatie cardiomyocyt nucleatie dynamiek tijdens de pulsperiode of analyses van weefselsecties verkregen van EDU gepulste dieren om de EDU opname vergelijken de mononucleaire en multinucleated cardiomyocyten populaties.

Vanwege de lage cardiomyocyt deze omzetprotocol maakt gebruik van meerdere injecties van Edu over een periode van 7 dagen. Dit maakt ook de "jagen" alle potentiële cellulaire bronnen van cardiomyocyten generatie en maakt kwantificering van cumulatieve cardiomyocyt nucleatie in deze periode. Afhankelijk van de studie, kan deze periode worden aangepast aan de verwachte niveaus van cardiomyocyten generatie passen. Voor de kwantificatie van edu opname in cardiomyocyten kernen, is het noodzakelijk dat er geen niet-specifieke labeling van de kernen met het secundaire antilichaam gebruikt om PCM-1 reactiviteit detecteren. Het zou daarom verstandig zijn om aanvullende secundair antilichaam titratie-experimenten uitvoeren om dit aspect van het protocol optimaliseren, vooral als een secundair antilichaam dan die voorgesteld in dit protocol wordt gebruikt. De hier beschreven protocol gebruikt PCM-1 expressie cardiomyocyten kernen identificeren. Hoewel dit een gevestigd cardiomyocyten marker kunnen alternatieve merkers worden gebruikt om te validerengegevens; deze omvatten antilichamen specifiek voor cardiaal troponine T die is geïdentificeerd als gedeeltelijk gelokaliseerd in cardiomyocyten kernen ^1. Evenzo kunnen alternatieve nucleair gelokaliseerde eiwitten worden gebruikt voor het identificeren en kwantificeren EDU verwerking in andere dan de cardiomyocyten kernen populaties. Het is belangrijk dat alle cardiomyocyt kernen die actief mitose ondergaan zijn uitgesloten van de analyse, aangezien het verdere verloop van dit DNA synthese is onbekend en kan ofwel celdeling of verhoogde ploïdie. PCM1 wordt gedemonteerd in de M fase van de celcyclus dan cardiomyocyten ondergaat mitose niet worden opgespoord door PCM1 expressie. Bovendien moeten alle kernen in de S-fase van de celcyclus worden uitgesloten van verdere analyse. Dit kan worden bereikt door gating alle kernen met DAPI intensiteit boven de 2N bevolking waaronder die met DAPI intensiteit tussen 2N en 4N populaties.

Hoewel het steedsaanvaard dat het hart heeft de capaciteit om cardiomyocyten vervangen tijdens normale veroudering en na acuut letsel, de bron en de mate van het mogelijke blijft controversieel. Daarnaast zijn uiteenlopende percentages van de omzet cardiomyocyt gemeld ^1,7,20-22. Dit kan voor een deel te wijten aan de moeilijkheden bij het nauwkeurig identificeren en kwantificeren van neo-cardiomyocyt generatie ^19. Tot op heden de meeste studies hebben alleen gebaseerd op het gebruik van histologische analyse en identificatie van cardiomyocyten via de expressie van cytoplasmatische eiwitten, waaronder eiwitten van het sarcomeer, voor de kwantificering van cardiomyocyten omzet en vernieuwing ^2,4,23,24. Het gebruik van deze werkwijzen om de expressie van proliferatiemerkers detecteren, of zoals hier getoond, kan de opname van thymidine analogen gemakkelijk leiden tot het onterecht overige cardiale celtypen zoals cardiomyocyten. Hoewel het gebruik van 3D confocale beeldvorming kan helpen om deze problemen verlichten these methoden zijn duur en tijdrovend. Interessant is dat de hier beschreven protocol toont neo-cardiomyocyt nucleatie optreedt met een snelheid van 0,17% per week. Dit is consistent met andere flowcytometrie op basis van studies aantonen van de wekelijkse omzet van maximaal 0,13% ^5. Hoewel het verleidelijk om jaaromzet tarieven te extrapoleren op basis van deze gegevens, zoals in eerdere studies ^2,5,25,26, dit is ongepast als de tarieven van de omzet zijn dynamisch tijdens de levensduur van een dier ^13.

Deze methode heeft een aantal potentiële toepassingen, waaronder de beoordeling van de mogelijke therapieën voor de cardiomyocyt regeneratie verbeteren of het onderzoek naar de gevolgen van hart-en vaatziekten op de omzet cardiomyocyten en de tarieven van de cardiomyocyt polyploïdisatie.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported by the British Heart Foundation, project grant PG/13/69/30454.

Materials

0.32 M sucrose	Sigma	84100
10 mM Tris-HCl (pH = 8)	Sigma	T3253
5 mM CaCl2	Sigma	c5086
5 mM magnesium acetate	sigma	M-5661
2.0 mM EDTA	Sigma	E5134
0.5 mM EGTA	Sigma	63779
1 mM DTT	Sigma	D0632
70 mM KCl	Sigma	P9541
10 mM MgCl2	Sigma	M8266
1.5 mM spermine	Sigma	85590
Isotype rabbit IgG- ChIP Grade	abcam	abc7415
Rabbit anti-PCM-1 antibody	Sigma	HPA023374
Alexa Fluor 488 F(ab')2 Fragment of Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody	Life technologies	A-11070
cell strainers 70 μm and 100μm	Fisher scientific	11597522, 11517532
Glass dounce (40 ml) and pestle large clearance	Sigma	D9188-1SET
EdU (5-ethynyl-2’-deoxyuridine)	Life technologies	A10044
Click-iT Plus EdU Alexa Fluor 647 Flow Cytometry Assay Kit	Life technologies	C10634	This kit inlcudes reagents required for section, EdU reaction buffer, EdU fixative, saponin-based permeabilization solution and the reagents required for the EdU labelling cocktail.
CyStain DNA 2 step kit,	Sysmex Partec	05 5005	This kit inlcudes reagents required for DAPI labelling (DNA staining solution)
Probe homogeniser e.g. TissueRuptor	Qiagen	9001273
TissueRuptor Disposable Probes	Qiagen	990890
ultracentrifuge	Sorvall
Facscanto II	BD Biosciences
Ultracentrifuge Tube, Thinwall, Polypropylene. 38.5 mL, 25 x 89 mm	Beckman Coulter	326823
Bovine serum albumin	Sigma	A2153

References

Bergmann, O., et al. Evidence for cardiomyocyte renewal in humans. Science. 324, 98-102 (2009).
Senyo, S. E., et al. Mammalian heart renewal by pre-existing cardiomyocytes. Nature. 493, 433-436 (2013).
Soonpaa, M. H., Rubart, M., Field, L. J. Challenges measuring cardiomyocyte renewal. Biochim Biophys Acta. 1833, 799-803 (2013).
Loffredo, F. S., Steinhauser, M. L., Gannon, J., Lee, R. T. Bone marrow-derived cell therapy stimulates endogenous cardiomyocyte progenitors and promotes cardiac repair. Cell Stem Cell. 8, 389-398 (2011).
Malliaras, K., et al. Cardiomyocyte proliferation and progenitor cell recruitment underlie therapeutic regeneration after myocardial infarction in the adult mouse heart. EMBO Mol Med. 5, 191-209 (2013).
Hsieh, P. C., et al. Evidence from a genetic fate-mapping study that stem cells refresh adult mammalian cardiomyocytes after injury. Nat Med. 13, 970-974 (2007).
Bergmann, O., et al. Identification of cardiomyocyte nuclei and assessment of ploidy for the analysis of cell turnover. Exp Cell Res. 317, 188-194 (2011).
Herget, G. W., Neuburger, M., Plagwitz, R., Adler, C. P. DNA content, ploidy level and number of nuclei in the human heart after myocardial infarction. Cardiovasc Res. 36, 45-51 (1997).
Scholzen, T., Gerdes, J. The Ki-67 protein: from the known and the unknown. J Cell Physiol. 182, 311-322 (2000).
Carmena, M., Earnshaw, W. C. The cellular geography of aurora kinases. Nat Rev Mol Cell Biol. 4, 842-854 (2003).
Bergmann, O., Jovinge, S. Isolation of Cardiomyocyte Nuclei from Post-mortem Tissue. J. Vis. Exp. , e4205 (2012).
Gilsbach, R., et al. Dynamic DNA methylation orchestrates cardiomyocyte development, maturation and disease. Nat Commun. 5, 5288 (2014).
Richardson, G., Laval, S., Owens, W. A. Cardiomyocyte regeneration in the mdx mouse model of non-ischemic cardiomyopathy. Stem Cells Dev. , (2015).
Jiao, K., et al. An essential role of Bmp4 in the atrioventricular septation of the mouse heart. Genes Dev. 17, 2362-2367 (2003).
Bergmann, O., et al. Cardiomyocyte renewal in humans. Circ Res. 110, e17-e18 (2012).
Prigge, J. R., et al. Nuclear double-fluorescent reporter for in vivo and ex vivo analyses of biological transitions in mouse nuclei. Mamm Genome. , (2013).
Naqvi, N., et al. A proliferative burst during preadolescence establishes the final cardiomyocyte number. Cell. 157, 795-807 (2014).
Liu, Z., Yue, S., Chen, X., Kubin, T., Braun, T. Regulation of cardiomyocyte polyploidy and multinucleation by CyclinG1. Circ Res. 106, 1498-1506 (2010).
Ang, K. L., et al. Limitations of conventional approaches to identify myocyte nuclei in histologic sections of the heart. Am J Physiol Cell Physiol. 298, C1603-C1609 (2010).
Kajstura, J., et al. Myocyte turnover in the aging human heart. Circ Res. 107, 1374-1386 (2010).
Kajstura, J., et al. Cardiomyogenesis in the adult human heart. Circ Res. 107, 305-315 (2010).
Walsh, S., Ponten, A., Fleischmann, B. K., Jovinge, S. Cardiomyocyte cell cycle control and growth estimation in vivo–an analysis based on cardiomyocyte nuclei. Cardiovasc Res. 86, 365-373 (2010).
Anversa, P., Leri, A., Kajstura, J. Cardiac regeneration. J Am Coll Cardiol. 47, 1769-1776 (2006).
Gonzalez-Valdes, I., et al. Bmi1 limits dilated cardiomyopathy and heart failure by inhibiting cardiac senescence. Nat Commun. 6, 6473 (2015).
Kimura, W., et al. Hypoxia fate mapping identifies cycling cardiomyocytes in the adult heart. Nature. 523, 226-230 (2015).
Soonpaa, M. H., Field, L. J. Assessment of cardiomyocyte DNA synthesis in normal and injured adult mouse hearts. Am J Physiol. 272, H220-H226 (1997).

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite This Article

Richardson, G. D. Simultaneous Assessment of Cardiomyocyte DNA Synthesis and Ploidy: A Method to Assist Quantification of Cardiomyocyte Regeneration and Turnover. J. Vis. Exp. (111), e53979, doi:10.3791/53979 (2016).

Automatically Generated