Simultaneous Assessment of Cardiomyocyte DNA Synthesis and Ploidy: A Method to Assist Quantification of Cardiomyocyte Regeneration and Turnover

Gavin D. Richardson

doi:10.3791/53979

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Developmental Biology

Die gleichzeitige Bewertung der Cardiomyocyte DNA-Synthese und Ploidy: Ein Verfahren zur Förderung des Quantifizierung von Cardiomyocyte Regeneration und Umsatz

Published: May 23, 2016

doi:

10.3791/53979

Gavin D. Richardson¹

¹Institute of Genetic Medicine, International Centre for Life,Newcastle University

Summary

Quantification of cardiomyocyte turnover is challenging. The protocol described here makes an important contribution to this challenge by enabling accurate and sensitive quantification of neo-cardiomyocyte nuclei generation and nuclei ploidy.

Abstract

Obwohl es angenommen wird, dass das Herz ein begrenztes Potential hat Kardiomyozyten nach Verletzungen und dass niedrige cardiomyocyte Umsatz treten während der normalen Alterung, Quantifizierung dieser Ereignisse zu regenerieren bleibt eine Herausforderung. Dies wird teilweise aufgrund der Seltenheit des Verfahrens und der Tatsache, dass mehrere Zellquellen myocardial Wartung beizutragen. Darüber hinaus innerhalb Kardiomyozyten DNA Vervielfältigung führt oft zu einer polyploid Kardiomyozyten und führt nur selten zu neuen Kardiomyozyten durch Zellteilung. Um zu genau Kardiomyozyten Umsatz Unterscheidung zwischen diesen Prozessen zu quantifizieren wesentlich. Das hier beschriebene Protokoll verwendet Langzeit Nukleosid Kennzeichnung, um alle Kerne zu bezeichnen, die durch die Verwendung von Kernen Isolierung und anschließende PCM1 Immunmarkierung identifiziert als Ergebnis der DNA-Replikation und Kardiomyozyten Kerne entstanden sind. Zusammen ermöglicht dies eine genaue und empfindliche Identifizierung der Nukleosid Kennzeichnung des cardiomyocyte Keimpopulation. Weiterhin, 4 ', 6-Diamidino-2-phenylindol Markierung und Analyse von Kernen Ploidie, ermöglicht die Unterscheidung von neo-Kardiomyozyten Kerne aus Kernen, die während Polyploidisierung Nukleosid eingebaut haben. Obwohl dieses Verfahren nicht für Kardiomyozyten binucleation steuern kann, ermöglicht es, eine schnelle und robuste Quantifizierung von neo-Kardiomyozyten Kerne während für Polyploidisierung ausmacht. Dieses Verfahren hat eine Anzahl von Downstream-Anwendungen einschließlich der potenziellen Therapeutika Beurteilung cardiomyocyte Regeneration oder die Untersuchung der Wirkungen von Herzerkrankungen auf Kardiomyozyten Umsatz und Ploidie zu erhöhen. Diese Technik ist auch kompatibel mit zusätzlichen nachgeschalteten immunhistologische Techniken, so dass die Quantifizierung von Nukleosid-Inkorporation in allen kardialen Zelltypen.

Introduction

In den letzten Jahren hat es eine Ansammlung von Beweisen Anfechtung der Annahme gegeben , dass das Herz eine terminal differenzierte, post-mitotischen organ ^1,2 ist. Allerdings Quantifizierung von Kardiomyozyten Umsatz und Regeneration bleibt eine Herausforderung.

Die Schwierigkeiten bei der genauen selten Kardiomyozyten Generation unter Verwendung von Standard immunhistochemischen Techniken zu identifizieren sind gut ³ berichtet. Darüber hinaus bleibt die zelluläre Quelle der Kardiomyozyten Generation unsicher mit Beweis für Beiträge von Kardiomyozyten Proliferation sowie durch Stammzelldifferenzierung ^4-6. Daher ist die Verwendung von lineage Verfolgungsmodelle Kenntnis der Kardiomyozyten-Vorläufer Phänotyps erforderlich ist unmöglich, und die Quantifizierung der Proliferation in einer Population, einschließlich Kardiomyozyten, ungeeignet ist. Weiterhin ist ein cardiomyocyte das Potential für Endoreplikation ohne karyokinesis hat (was zu einer polyploiden Autodiomyocyte) oder karyokinesis in Abwesenheit von Zytokinese (was zu einem zweikerniger cardiomyocyte) ^7,8. Die genaue Quantifizierung von Kardiomyozyten Umsatz hängt von der Fähigkeit zwischen diesen Ereignissen und wahre neo-Kardiomyozyten Generation zu unterscheiden. Dies schafft einzigartige Komplikationen , da die DNA – Replikation und Expression von Cyclin-abhängigen Kinasen in Kardiomyozyten nicht ausschließlich wahr Zelle zeigen Teilung ^9,10.

Zur Unterstützung bei der Quantifizierung von neo-Kardiomyozyten Generation haben wir eine etablierte Zellkerne Isolationstechnik und immunologische Markierung von pericentriolar Material 1 (PCM1) für Kardiomyozyten Kerne Identifizierung kombiniert , wie von Bergmann et al. ^7,11 mit neuartigen Verfahren der langfristigen DNA-Markierung und Ploidie-Analyse. PCM-1 ist ein Zentrosomen Protein, das an der Kernfläche der differenzierten, nicht-teil Myozyten ansammelt. Frühere Studien haben gezeigt, dass Antikörper demonstriert gegenPCM-1 kennzeichnen spezifisch cardiomyocyte Kerne ^7,11 und als solche PCM1 durch eine Anzahl von unabhängigen Gruppen verwendet wurde Kardiomyozyten ^1,12,13 zu identifizieren. Darüber hinaus haben wir gezeigt , dass PCM1 Ausdruck zuordnet genetisch markierten Kardiomyozyten Kerne in der TnT-cre transgenes Mausmodell ¹⁴ (Supplementary Abbildung 1).

Das hier beschriebene Protokoll ermöglicht die genaue und empfindliche Identifizierung von neo cardiomyocyte Kerne Erzeugung im Mäuseherz, unabhängig von den zellulären Ursprung (1A und B) , während gleichzeitig Nukleosid Kennzeichnung ohne aufgrund Polyploidisierung aus der Analyse (Abbildung 1C und D). Obwohl dieses Verfahren nicht für Kardiomyozyten binucleation steuern kann, ermöglicht es, eine schnelle und robuste Quantifizierung von neo-Kardiomyozyten Kerne, die für die genaue Quantifizierung von Kardiomyozyten Umsatz erforderlich ist. Außerdem,es stellt ein schnelles Screening-Tool mögliche Veränderungen in der Dynamik der Kardiomyozyten Generation zu bewerten.

Während DNA-Markierung in der Regel 5-Bromo-2'-desoxyuridin (BrdU) als das Thymidin-Analogon beschriebene Protokoll verwendet hier einen 5-ethinyl-2'-desoxyuridin (EDU) basierenden Assay, da es weniger Verarbeitungsschritte für einen rascheren erfordert Durchsatz und erfordert nicht für Immun-Detektion der DNA-Denaturierung es kompatibel mit anderen immunostaining Protokolle zu machen und dadurch die möglichen nachgelagerten Anwendungen des Verfahrens zu erhöhen.

Abbildung 1: Kontinuierliche Pulsieren mit EdU Etiketten neo-Kardiomyozyten unabhängig von ihrer Vorläufern. (A) EdU wird in die DNA von Kardiomyozyten während der Zellteilung einbezogen. Proliferation in der Kardiomyozyten Bevölkerung Result in einer Erhöhung oder Ersatz von Kardiomyozyten und ist deshalb produktiver DNA-Synthese (trägt zur Gewebe Wartung und Reparatur). (B) EdU wird in die DNA von Herzvorläuferzellen während der Zellteilung einbezogen. Dies wird in der Zelle während der Differenzierung in die Kardiomyozyten lineage beibehalten werden. Diese Stammzelldifferenzierung wird auch in einer Erhöhung der Anzahl von Kardiomyozyten führen und trägt daher zur Gewebe Wartung und Reparatur. (C) Kardiomyozyten haben das Potenzial , "nicht-produktive" DNA – Replikation zu unterziehen , zu einer erhöhten Kardiomyozyten Ploidie führt, die mit Kardiomyozytenhypertrophie und das myokardiale Remodeling assoziiert ist, ersetzt aber nicht verloren Kardiomyozyten. Der Prozess der Polyploidisierung unterscheidet sich von binucleation wie es in einem Kardiomyozyten mit einem einzelnen Kernen führt, die vier oder mehr Sätze von zwei homologen Chromosomen enthalten (> 2N). (D) Nach einem kontinuierlichen Kerne pUlse Dieses Protokoll beschreibt Kerne Isolierung und Identifizierung der Kardiomyozyten Kerne durch PCM1 Ausdruck Quantifizierung sowohl Kardiomyozyten Ploidie und EdU Einbau zu ermöglichen. PCM1 – Expression und EdU Einverleibung Durchflusszytometrie detektiert werden. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Protocol

Tier Arbeit wurde von der Universität Newcastle Ethics Review Board zugelassen und genehmigt. Alle Tierverfahren wurden über den Schutz von Tieren, die für wissenschaftliche Zwecke verwendet werden, um den Richtlinien von der Richtlinie 2010/63 / EU des Europäischen Parlaments durchgeführt entspricht. 1. EdU Verwaltung Auflösen EdU in steriler Kochsalzlösung (0,9% w / v) bei einer Endkonzentration von 12,5 mg / ml. Die Lösung wird auf 40 ° C und Wirbel um vollständig zu lösen. Bewahren Sie genug EdU / Saline bei 4 ° C alle Mäuse in der Studie zu injizieren, so dass für 6 tägliche Injektionen. Hinweis: In der Regel mehr als 6 Mäuse für jede Versuchsgruppe erforderlich sind. Allerdings Leistungsberechnungen sollten für unabhängige Studien durchgeführt werden. Wiegen Sie einzelne Mäuse. Berechnen Sie das erforderliche Volumen 100 ug / g EdU / Salzlösung zu jeder Maus (8 ul Lager EdU Lösung pro g) zu verabreichen. Zeichnen Sie die entsprechenden volume von EdU / Kochsalzlösung in Insulin-Spritze mit einer 25 G-Nadel. Führen Sie intraperitoneale (ip) Injektionen beim Umgang mit Mäusen mit zugelassenen Home Office-Techniken. Legen Sie eine Maus auf den Käfig Deckel. Ziehen Sie vorsichtig an der Basis des Schwanzes zurück und fest mit der Maus durch das Genick fassen. Expose den Bauch für die Injektion mit der Maus mit dem Zeigefinger und dem Daumen in der Nähe der Basis des Kopfes halten und kippt den Kopf des Tieres nach hinten auf den Boden. Wischen Sie den Bauch mit 70% Alkohollösung. Suchen Sie die Mittellinie des Tieres und unteren rechten Quadranten. Injizieren Sie die EDU / Salzlösung in das Tier in den unteren rechten Quadranten. Injizieren von Mäusen mit EdU / Kochsalzlösung und die Tageszeit aufzuzeichnen. Wiederholen Sie die Schritte 1.2 bis 1.4 an der gleichen Tageszeit, für 6 aufeinander folgenden Tagen. Hinweis: Da ein EdU Negativkontrolle erforderlich ist, die Gating für Durchflusszytometrie-Analyse zu setzen, injizieren ein zusätzliches Alter, Geschlecht und experimentell entsprechened Maus mit einem äquivalenten Volumen von Kochsalzlösung ohne EdU. Dadurch wird die erforderliche Kontrolle (keine EdU Kontrolle). Diese Kontrolle sollte einbezogen werden für jede Studie für Variationen in Chargen von Reagenzien zu ermöglichen und cytometer einzurichten. 2. Ernten Herzen Bei 24 Stunden nach dem 6. EdU Injektion, opfere Mäuse Zervikaldislokation (oder eine alternative Liste 1 Home Office genehmigt Methode). Legen geopfert Tier in Rückenlage und machen Hautschnitt aus der Mitte des Bauches auf die Membran mit einer chirurgischen Schere. Schneiden Sie das Zwerchfell, und Halten des Brustbeins weg von der Körperhöhle, schneiden bilateral das Herz aussetzen. Heben Sie das Herz leicht und schneiden Sie die großen Blutgefäße des Ausflusstraktes das Herz aus der Brusthöhle zu sezieren. Unmittelbar jedes Herz platzieren zu einem einzelnen 15 ml-Zentrifugenröhrchen mit 10 ml PBS auf 4 ° C gekühlt. Übertragen Herzen separate 10 cm Petrischalen, mit einem Skalpell jedes Herz in zwei Teile geschnitten in einer sagittalen Ausrichtung und waschen Sie das Herz, indem Sie vorsichtig mit einer Pinzette zusammendrücken. Dann ersetzen Sie die PBS so viel Blut wie möglich zu entfernen. Zweimal wiederholen Sie diesen Schritt. Legen Sie beide Teile jedes Herz in demselben Individuum 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Weiter zu Schritt 3 oder alternativ speichern Proben -80 ° C wie in den Schritten detailliert 2.9 und 2.10. Unter Verwendung einer 25 G Nadel, stellen ein kleines Loch in dem Mikrozentrifugenröhrchen Deckel, den Deckel von der Öffnung auf die Ausdehnung von Gasen durch zu verhindern, wenn das Herz verarbeitet wird. Beschriften Sie jedes Mikrozentrifugenröhrchen und in einen Behälter mit flüssigem Stickstoff einzufrieren. 3. Nuclei Dissoziation und Cardiomyocyte Nuclei Labeling Hinweis: Diese Kerne Dissoziation und Kardiomyozyten Kerne Kennzeichnung von der Bergmann et al angepasst ist 11 Führen Sie dieses Verfahren auf allen injizierten Proben.mit EdU und injizierten Salzlösung (keine EdU Kontrolle) negative Kontrolle. Siehe Tabelle 1 für das Rezept von Lösungen zur Durchführung dieser Schritte erforderlich. Für jeden Herz analysiert werden, legen 36 ml 1% BSA / PBS-Lösung in ein Ultrazentrifugenröhrchen, für 30 min inkubieren, um die Lösung zu verwerfen und dann an der Luft trocknen. Hinweis: Dieses Rohr in Schritt 3.6 verwendet wird. Legen Sie einzelne gefrorenen Herzen auf eine 10-mm-Schale auf Eis und Hackfleisch mit einem Skalpell so dass das Herz während des Zerkleinerungs- Prozess auftauen. Platzieren gehacktem Herzen in 15 ml of Cell Lysis Buffer in einem 50 ml-Zentrifugenröhrchen und homogenisieren mit einer Sonde Homogenisator für 15 Sekunden bei 25.000 rpm bei Raumtemperatur. In weitere 15 ml Zell-Lysepuffer in die Zentrifugenröhrchen und in ein 40 ml Dounce mit einem großen Freiraum Stößel. Führen Sie 10 Schläge mit dem Stößel und filtriert über ein 100 um dann 40 & mgr; m Zelle Sieb in ein 50 ml Zentrifugenröhrchen. Zentrifuge für 10 min eint 700 × g bei 4 ° C, und entfernen Sie den Überstand. Resuspendieren Kernpellet in 25 ml Saccharose-Gradienten-Lösung und die Schicht hergestellt, um die Zellkerne enthaltenden Lösung auf die Oberseite von 10 ml frischem Saccharosegradienten Lösung in dem Röhrchen Ultrazentrifuge in 3.1. Zentrifuge bei 13.000 × g für 1 Stunde bei 4 ° C einer Ausschwingzeit Rohr Rotor verwendet wird. Nach der Zentrifugation der Überstand verworfen und die Kerne resuspendieren Pellet in 1300 & mgr; l der Zellkerne Speicherpuffer in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen und Etiketten PCM1. Entfernen Sie 300 ul der Suspension auf ein neues Mikrozentrifugenröhrchen und fügen 700 ul frischen Kerne Speicherpuffer. Beschriften Sie diese Röhre als ISO-Steuerung. Hinzufügen anti-PCM1 bei einer Endkonzentration von 8 & mgr; g / ml an den Mikrozentrifugenröhrchen markiertem PCM1 und Kaninchen-IgG-Isotyp-Kontrollantikörper bei einer Konzentration von 8 & mgr; g / ml an den Mikrozentrifugenröhrchen markiertem ISO Steuerung hinzuzufügen. Inkubieren über Nacht bei 4 ° C. Nach incubation, Zentrifuge bei 700 × g für 10 min, den Überstand verwerfen, mit 1 ml frischem min bei 700 x g für 10 Kerne Speicherpuffer, resuspendieren und Zentrifuge wieder ersetzen. Überstand verwerfen und ersetzen mit 1 ml frischem Kerne Speicherpuffer. 1 & mgr; l F (ab ') 2 Fragment Ziege anti-Kaninchen IgG (H + L) Antikörper (FITC oder äquivalente grün fluoreszierenden Farbstoff) zu einer Endkonzentration von 2 ug / ml zu erreichen. Anmerkung: Die Verwendung eines F (ab ') 2-Fragment-Antikörper verringert das Potential für nicht-spezifische Markierung von Immunzellen, einschließlich Makrophagen und B-Zellen. Wrap Rohre in Aluminiumfolie vor Licht zu schützen und für 1 Stunde bei 4 ° C inkubieren. 4. Nachweis von EdU Incorporation Dilute 10x konzentriert EdU Reaktionspuffer im Verhältnis 1:10 mit VE-Wasser. Zentrifugieren Sie die PCM-1 und ISO-Steuerung markierten Kerne Suspensionen bei 700 × g für 10 min, den Überstand verwerfen und das Pellet-Kerne in 1 ml1% BSA / PBS-Lösung. Waschen Sie die Kerne Pellet zweimal. Nach dem letzten Waschen, den Überstand verwerfen und ersetzen mit 100 ul EdU Fixiermittel. Wickeln Rohre in Aluminiumfolie vom Licht geschützt und bei Raumtemperatur für 15 min. Waschen Sie die Proben zweimal mit 1 ml 1% BSA / PBS-Lösung, Zentrifugation bei 700 xg und inkubiere mit 1x Saponin basierenden Permeabilisierung Lösung bei Raumtemperatur für 15 min. Bereiten Sie 1x EdU Kennzeichnung Cocktail (Tabelle 2). Ein Minimum von 2 Reaktionen werden benötigt, die keine EdU Kontrolle aufzunehmen. Hinzufügen 500 ul 1x EdU Markierungscocktail direkt bereits zu jeder Probe Kerne in 100 ul 1x Saponin basierenden Permeabilisierung enthaltenden Lösung und Inkubation für 30 min bei Raumtemperatur vor Licht geschützt. Zentrifuge bei 700 xg und Resuspendieren in 1 ml 1% BSA / PBS und wiederholen Sie diesen Schritt zwei weitere Male. Zentrifuge bei 700 xg, Überstand verwerfen und ersetzen mit 400 & mgr; l DNA – Färbelösung (siehe Tabelle der Materialien). Benennen des Reagens 1. Zell – Lysepuffer 0,32 M Saccharose 10 mM Tris-HCl (pH = 8) 5 mM CaCl 2 5 mM Magnesiumacetat 2,0 mM EDTA 0,5 mM EGTA 1 mM DTT 2.Sucrose Gradient – Lösung 2,1 M Saccharose 10 mM Tris-HCl (pH = 8) 5 mM Magnesiumacetat 1 mM DTT 3. Nuclei Speicherpuffer (NSB) 0,44 M Saccharose 10 mM Tris-HCl (pH = 7,2) 70 mM KCl 10 mM MgCl 2 1,5 mM Spermin Tabelle 1: Nuclei Isolationspuffer Zutaten Rezept für alle verwendeten Puffer in Protokollabschnitt 3 (Nuclei Dissoziation und Kardiomyozyten Kerne Markierung).. 5. Analyse über Durchflusszytometrie Hinweis: Führen Sie Durchflusszytometrie auf isolierten Kernen wie zuvor beschrieben 7,11,15. Erstellen Sie zunächst eine Handlung beschreibt Forward Scatter (FSC) und Seitenstreuung (SSC) , um die Diskriminierung von Kernen aus Schutt (2A) zu ermöglichen. Erstellen Sie ein Grundstück zu einzelnen Kerne aus Aggregaten (2B) unterscheiden durch Auftragen 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole) (DAPI) Bereich (3-405 / 450/50 A) im Vergleich zu der Höhe (33-405 / 450 / 50-H). Stellen Sie sicher, that die 3-405 / 450/50-A-Signal auf der linearen Skala gesammelt wird, um die korrekte Bestimmung des DNA-Gehalts zu ermöglichen. Erstellen Sie eine Handlung beschreibt, 488/535/30-A (PCM-1) vs SSC und zeigt nur Ereignisse aus dem Singulett-Gate in 5.2 geschaffen, um PCM-1-Expression in den Singulett-Population zu beurteilen. Führen Sie die Isotypkontrollreagenzien Probe um ein PCM-1 positive Gate (2C) zu etablieren. Führen Sie eine kleine Menge von PCM1 Probe markiert, um die PCM1 exprimierenden Population und Gating-Position zu überprüfen. Erstellen Sie einen Plan beschreibt SSC-A vs 405/450/50-A (zu erkennen DAPI). In diesem Plot, nur Anzeige PCM1 exprimierenden Zellkerne Singulett, unter Verwendung der in 5.3 erstellt Tore. Verwenden Sie dieses Grundstück ein zusätzliches hierarchal Tor zu erzeugen , die nur 2N Kerne (2D) enthält. Erstellen Sie ein Plot, der 488/535 / 30-A vs 1-633 / 660/20 A beschreibt die Identifizierung von EdU Kennzeichnung des PCM1 exprimierenden Kardiomyozyten Bevölkerung zu ermöglichen. Anzeige nur Kerne, die Singulett sind, P CM1 + und 2N die obige Gating. Führen Sie Herz Probe von keiner EdU Kontrolle , um den EdU positiven Gate (Abbildung 2E). Erstellen Sie die entsprechende Tor für EdU + Zellen. Die Bilanz und zu quantifizieren, Singulett, PCM-1 exprimieren, 2N Kerne, die EdU eingebaut haben. Berechnen Sie diese Bevölkerung als Prozentsatz des Gesamt Singulett, PCM1 + Kerne. Dies wird die Rate der neo-Kardiomyozyten Kerne Generation, während der 7 Tage EdU Pulsperiode, ausgedrückt als Prozentsatz der gesamten cardiomyocyte Kerne bereitzustellen. Hinweis: Da DAPI zur DNA-Bindung stöchiometrisch ist die Fluoreszenzintensität mit der Menge an DNA proportional ist. Ploidie bestimmen basierend auf der Intensität von 405/450/50 A – Signal, wie vorher 7 beschrieben. Verwenden Sie die Ploidie in der gesamten Kardiomyozyten Bevölkerung zu bewerten Strategie die Handlung etabliert in 5.5 und einer Gating basierend auf DNA – Konzentration 7. /files/ftp_upload/53979/53979fig2.jpg "/> Abbildung 2:. Gating – Strategie Kardiomyozyten EdU Einbau und Ploidie zu quantifizieren (A) Nuclei aus Schutt diskriminiert basierend auf Vorwärtsstreuung (FSC) und Seitenstreuung (SSC). (B) ein lineares Gate angelegt und der Singulett – Keimpopulation beruht auf DAPI Kennzeichnung identifiziert und die Höhe 405/450/50 vs Bereichssignal. (C) Fluorescent Gating erlaubt die Trennung von Kardiomyozyten Kerne (PCM-1-positiv) und nicht-Kardiomyozyten (PCM-1-negativ) Zellkerne von Herzgewebe. (D) Die Intensität des DAPI – Signal wird verwendet , um DNA – Konzentration zu bestimmen und dadurch Kerne Ploidie der PCM1 + Kardiomyozyten Bevölkerung. In Maus> 80% der Kardiomyozyten Kerne sind diploiden (2n). (E) Fluorescent Gating ermöglicht die Trennung von 2N, Kardiomyozyten Kerne , die EDU (PCM + / EDU + = 0,9%) aus 2N eingebaut haben, Kardiomyozyten , die EdU nicht integriert haben (PCM + Edu-). Alle Schritte werden in dem Protokoll 5.0 beschrieben. Beispiel von MDX gezeigt -. / Y Mäuse auf dem C57 / BL10 Hintergrund Bitte klicken Sie hier eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Representative Results

Dieses Verfahren erlaubt die Quantifizierung von erhöhten EdU Inkorporation aufgrund cardiomyocyte Kerne Teilung während für erhöhte Polyploidisierung steuern. Unter Verwendung eines BrdU basierten Assays, wir haben bereits gezeigt , dass das Säugetier-Herz reagiert auf chronische Kardiomyozyten Verlust, in der MDX – Maus – Modell der Duchenne – Muskeldystrophie, mit der Regeneration der neuen Kardiomyozyten. Wir haben die hier beschriebenen Verfahren verwendet, um unsere veröffentlichten Ergebnisse validieren und die Nützlichkeit des Protokolls zu demonstrieren. Gemäß dem Protokoll beschrieben; Erwachsener (12 Wochen alt) MDX und Kontrolle BL10 Mäuse mit einer täglichen Injektion von EdU für 7 Tage gepulst wurden, berichtete zuvor 5,13 statisch Analyse zwischen experimentellen Gruppen zu ermöglichen. Immunhistologische Analyse gepulster Herzen zeigt die Anwesenheit von PCM1 exprimierenden Kardiomyozyten , die EDU (3A) eingearbeitet haben. Jedoch usin die erhaltenen Dateng immunhistologischen Methoden können falsch interpretiert werden, als andere Zelltypen, die EdU integriert haben können als Kardiomyozyten falsch identifiziert werden. Ein Beispiel hierfür ist in Ergänzungs 1A und B gezeigt. Außerdem immunhistologische Methoden unterscheiden nicht Polyploidisierung von Kernteilung. Die Durchflusszytometrie Analyse in diesem Protokoll detailliert ermöglicht die schnelle Quantifizierung von Kardiomyozyten Kernteilung in MDX und Kontrollmäuse, während ohne Zellen , die EdU aufgenommen hatte aufgrund Polyploidisierung. Ähnlich wie bei den zuvor veröffentlichten Daten 13, die Analyse ergab einen Anstieg der Preise von neo-Kardiomyozyten Kerne Generation in der MDX – Mäuseherzen im Vergleich zu gleichaltrigen Kontrollgruppe (1,2% im Vergleich zu 0,17%; 3B und C). Figur 3: </strong> Die Quantifizierung von EdU markierten Kardiomyozyten in Wildtyp- und MDX – Herzen. (A) Bild von 40 & mgr; m dicke Abschnitte von MDX Herzen genommen Z-Stack – Projektionen. PCM-1-exprimierenden Kardiomyozyten Kernen (grün), die EDU (rot) aufgenommen hat. Gelber Pfeil zeigt EdU Kardiomyozyten markiert. i und ii anzeigt einzelnen EdU Kardiomyozyten gezeigt in der Z-Ebene bezeichnet. Nuclei markiert mit DAPI (blau) (B und C) Durchflusszytometrie von isolierten Kernen zeigt repräsentativen Parzellen von 12 bis 13 Wochen alten Wildtyp (C57 / BL10) und mdx – Mäusen (MDX – / y auf dem C57 / BL10 Hintergrund). (B) Histogramm zeigt DAPI Intensität und Diskriminierung zwischen 2 N und> 2 N Kernen. (C) Plots zeigt EdU Einbau in den 2N Kardiomyozyten Keimpopulation , wenn sie in diesem Protokoll so detailliert analysiert. Für alle Mäuse wurde Edu für 1 Woche ab 1 verabreichtAlter von 2 Wochen. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen. Ergänzende Abb . 1: PCM-1 ist ein spezifischer Marker für Kardiomyozyten Kerne unter Verwendung des Protokolls beschriebenen Kerne aus der doppelt transgenen Maus durch Kreuzung TNT-cre Mäusen isoliert wurden 14 mit dem ROSA nT / nG cre – sensitives Reporterlinie 16. In der resultierenden Maus cre Aktivierung unter der Kontrolle von Troponin T (TNT) Promotor führt zu irreversiblen Expression von GFP mit den Kernen lokalisiert ist. Nuclei, markiert mit Isotypkontrollreagenzien (Iso) zeigt die Fähigkeit der GFP exprimierenden cardiomyocyte Keimpopulation (488/530/30-A) zu identifizieren. Die Markierung von Kernen mit anti-PCM1 (sekundärer Antikörper nachgewiesen durch 633-660 / 20-A) zeigt die Korrelation von PCM1 Ausdruck mit dem GFP-exprimierenden cardiomyocyte Keimpopulation. In diesem Beispiel 98,8% der Kardiomyozyten Kerne wie durch TNT Promotoraktivität identifiziert, durch PCM1 Antikörper markiert sind. Bitte hier klicken Ergänzender 1 zum Download bereit . Ergänzende Abbildung 2:. Herausforderungen für die durch immunhistologische Techniken Kardiomyozyten Erneuerung Quantifizierung (A) 2D – Bild zeigt zwei PCM-1 – exprimierenden Kardiomyozyten Kernen (grün) , die auch für EdU (rot) markiert angezeigt werden. Gelbe Pfeile zeigen an, was Kardiomyozyten zu sein scheint, die EdU integriert haben. Dies ist aufgrund der scheinbaren Kolokalisation von PCM1 Expression und EdU Kennzeichnung wenn 2-dimentional Bildgebung sichtbar gemacht werden. (B) Ein 3-dimensionale Projektion dieses Bildes identifiziert die EdU markierten Zellen nicht Kardiomyozyten sind aber sind nicht-Kardiomyozyten Zellen PC überlagerndenM1 zum Ausdruck Kardiomyozyten Kerne. C57 / BL10 – Mäuse im Alter von 12 Wochen für Experimente verwendet. Bitte hier klicken Ergänzender 2A zum Download bereit . Bitte hier klicken Ergänzender 2B zum Download bereit . Reaktionskomponenten Anzahl der Reaktionen 2 5 PBS 875 & mgr; l 2,19 ml Copper protectant 20 ul 50 ul Fluoreszenzfarbstoff Picolylgruppe Azid 5 ul 12,5 ul Verwässertes Reaktion-Puffer in 4.1 100 ul 250 ul Die gesamte Reaktionsvolumen 1 ml 2,5 ml Tabelle 2: EdU Cocktail Zutaten. Rezept für EdU Kennzeichnung Cocktail in Protokollabschnitt 4 (Nachweis von EdU-Einbau) erforderlich.

Discussion

Zur Quantifizierung genau Kardiomyozyten Umsatz und Regeneration Tests müssen zwischen echten Kardiomyozyten Generation und unproduktiven DNA Teilung unterscheiden. Viele Studien weiterhin einfach diese unproduktiven Ereignisse ignorieren, Kardiomyozyten Proliferation Quantifizierung ausschließlich über die Expression von Cyclin kinesis und Zellzyklus-Marker. Um eine einzelne Methode Datum, das die genaue Quantifizierung von Kardiomyozyten Umsatz ermöglicht, während für diese unproduktiven Ereignisse Steuerung bleibt allusive. Insbesondere bleibt es schwierig für Kardiomyozyten Polyploidisierung zu berücksichtigen , die ¹³ bis ~ 65% der Kardiomyozyten DNA – Replikation trägt auf. Daher sind in der genauen Quantifizierung von Kardiomyozyten Generation zu unterstützen wir ein Protokoll entwickelt, das die robuste Quantifizierung der Raten von neo Kardiomyozyten Kerne erlaubt, während die DNA-Replikation ohne die erhöhte Ploidie führt. Obwohl dieses Protokoll keine Diskriminierung zwischen neo-Kardiomyozyten Gattungention und Kardiomyozyten bi-Nukleation, kann sie schnell eingesetzt werden und genau die obere Grenze (Bilanzierung von Ploidie) von Kardiomyozyten Generation berechnen. Dieses Protokoll stellt daher ein Screening-Tool zu möglichen Veränderungen in den Raten von Kardiomyozyten Generation und Polyploidisierung in Krankheitsmodellen zu bewerten oder das Potenzial, die Effizienz von Therapeutika zu bewerten. Sobald Änderungen in der Rate der neo-Kardiomyozyten Kerne Generation identifiziert werden unter Verwendung dieses Protokolls können nachfolgenden Studien verwendet werden , um festzustellen , ob dies aufgrund von Änderungen in Kardiomyozyten Erzeugung von Kardiomyozyten Nukleation Nummer, wie zuvor beschrieben ^2,13,17,18. Dazu gehört die Verwendung von histologischen Quantifizierung Kardiomyozyten Nukleation Dynamik während der Pulsperiode oder Analysen von Gewebeschnitten, die aus EdU gepulsten Tiere in EdU Einarbeitung in die einkernigen und mehrkernigen Kardiomyozyten Populationen zu vergleichen.

Aufgrund der geringen Mengen an Kardiomyozyten Umsatz dieserProtokoll verwendet mehrere Injektionen von EdU über einen Zeitraum von 7 Tagen. Dies ermöglicht auch die aller potentiellen zellulären Quellen von Kardiomyozyten generation "jagen" und ermöglicht die Quantifizierung der kumulativen cardiomyocyte Kerne Generation über diesen Zeitraum. Je nach Studie kann dieser Zeitraum eingestellt werden, um die vorhergesagten Niveaus der Kardiomyozyten Generation gerecht zu werden. Für die genaue Quantifizierung von EdU Inkorporation in Kardiomyozyten Kerne, ist es unerlässlich, dass es keine nicht-spezifische Markierung der Kerne mit dem sekundären Antikörper verwendet werden, um PCM-1 Reaktivität nachzuweisen. Es wäre daher sinnvoll sein, zusätzliche sekundäre Antikörper Titrationsexperimente durchzuführen, um diesen Aspekt des Protokolls zu optimieren, insbesondere, wenn ein sekundärer Antikörper anders als das vorgeschlagen in diesem Protokoll verwendet werden soll. Das hier beschriebene Protokoll verwendet PCM-1-Expression cardiomyocyte Kerne zu identifizieren. Während dies eine etablierte Kardiomyozyten Marker ist, können alternative Marker verwendet werden, um zu überprüfen,Daten; Dazu gehören Antikörper , die spezifisch für die kardiale Troponin T , die als teilweise in Kardiomyozyten Kerne ¹ lokalisiert identifiziert wurde. In ähnlicher Weise alternative Kern lokalisierte Proteine verwendet werden können EdU Inkorporation in Kerne Populationen andere als die der Kardiomyozyten zu identifizieren und zu quantifizieren. Es ist wichtig, dass alle cardiomyocyte Kerne, die aktive Mitose durchlaufen werden von der Analyse ausgeschlossen, da das Schicksal dieses DNA-Synthese bekannt ist, und kann zu entweder der Zellteilung oder erhöhte Ploidie. PCM1 wird deshalb durch Mitose PCM1 Expression nicht Kardiomyozyten läuft während der M-Phase des Zellzyklus zerlegt identifiziert werden. Darüber hinaus werden alle Kerne in der S-Phase des Zellzyklus sollte eine nachfolgende Analyse ausgeschlossen werden. Dies kann durch die Ausblendung aller Kerne mit DAPI Intensität oberhalb der 2N Bevölkerung einschließlich derjenigen mit einer DAPI Intensität zwischen 2N und 4N Populationen erreicht werden.

Obwohl es zunehmendangenommen, dass das Herz die Fähigkeit Kardiomyozyten während der normalen Alterung und nach einer akuten Verletzung zu ersetzen hat, bleibt die Quelle und das Ausmaß dieses Potential umstritten. Darüber hinaus haben unterschiedliche Raten von Kardiomyozyten Umsatz wurde ^1,7,20-22 berichtet. Dies kann aufgrund der Schwierigkeiten teil werden in genau der Identifizierung und Quantifizierung von neo-Kardiomyozyten Generation ^19. Bis heute wurden die meisten Studien stützte sich nur auf die Verwendung von histologischen Analyse und die Identifizierung von Kardiomyozyten über die Expression von cytoplasmatischen Proteinen, einschließlich Proteine des Sarkomers, für die Quantifizierung von Kardiomyozyten Umsatz und Erneuerung ^2,4,23,24. Die Verwendung dieser Methoden, um die Expression von Proliferationsmarker zu detektieren, oder wie hier gezeigt, kann der Einbau von Thymidin-Analoga leicht in der Fehlidentifizierung von anderen kardialen Zelltypen wie Kardiomyozyten führen. Während die Verwendung von bildgebenden 3D-konfokalen kann diese Probleme zu lindern helfen these Methoden sind teuer und zeitraubend. Interessanterweise beschrieben das Protokoll hier demonstriert neo-Kardiomyozyten Kerne Generation mit einer Rate von 0,17% erfolgt pro Woche. Dies steht im Einklang mit anderen Durchflusszytometrie basierte Studien , die zeigen Wochenumsatz von bis zu 0,13% ^5. Obwohl es verlockend ist jährlichen Umsatzraten zur Extrapolation auf der Grundlage dieser Daten, wie es in früheren Studien ^2,5,25,26, das ist unangemessen , da die Preise des Umsatzes während ihres Lebenszyklus eines Tieres ¹³ dynamisch sind.

Dieses Verfahren hat eine Reihe von möglichen Anwendungen, einschließlich der potenziellen Therapeutika Beurteilung cardiomyocyte Regeneration oder die Untersuchung der Wirkungen von Herzerkrankungen auf Kardiomyozyten Umsatz und die Raten der Kardiomyozyten Polyploidisierung zu verbessern.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported by the British Heart Foundation, project grant PG/13/69/30454.

Materials

0.32 M sucrose	Sigma	84100
10 mM Tris-HCl (pH = 8)	Sigma	T3253
5 mM CaCl2	Sigma	c5086
5 mM magnesium acetate	sigma	M-5661
2.0 mM EDTA	Sigma	E5134
0.5 mM EGTA	Sigma	63779
1 mM DTT	Sigma	D0632
70 mM KCl	Sigma	P9541
10 mM MgCl2	Sigma	M8266
1.5 mM spermine	Sigma	85590
Isotype rabbit IgG- ChIP Grade	abcam	abc7415
Rabbit anti-PCM-1 antibody	Sigma	HPA023374
Alexa Fluor 488 F(ab')2 Fragment of Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody	Life technologies	A-11070
cell strainers 70 μm and 100μm	Fisher scientific	11597522, 11517532
Glass dounce (40 ml) and pestle large clearance	Sigma	D9188-1SET
EdU (5-ethynyl-2’-deoxyuridine)	Life technologies	A10044
Click-iT Plus EdU Alexa Fluor 647 Flow Cytometry Assay Kit	Life technologies	C10634	This kit inlcudes reagents required for section, EdU reaction buffer, EdU fixative, saponin-based permeabilization solution and the reagents required for the EdU labelling cocktail.
CyStain DNA 2 step kit,	Sysmex Partec	05 5005	This kit inlcudes reagents required for DAPI labelling (DNA staining solution)
Probe homogeniser e.g. TissueRuptor	Qiagen	9001273
TissueRuptor Disposable Probes	Qiagen	990890
ultracentrifuge	Sorvall
Facscanto II	BD Biosciences
Ultracentrifuge Tube, Thinwall, Polypropylene. 38.5 mL, 25 x 89 mm	Beckman Coulter	326823
Bovine serum albumin	Sigma	A2153

References

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Richardson, G. D. Simultaneous Assessment of Cardiomyocyte DNA Synthesis and Ploidy: A Method to Assist Quantification of Cardiomyocyte Regeneration and Turnover. J. Vis. Exp. (111), e53979, doi:10.3791/53979 (2016).

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