Simultaneous Assessment of Cardiomyocyte DNA Synthesis and Ploidy: A Method to Assist Quantification of Cardiomyocyte Regeneration and Turnover

Gavin D. Richardson

doi:10.3791/53979

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Developmental Biology

Évaluation simultanée de cardiomyocytes synthèse de l'ADN et Ploïdie: Une méthode pour aider Quantification de cardiomyocytes Régénération et Chiffre d'affaires

Published: May 23, 2016

doi:

10.3791/53979

Gavin D. Richardson¹

¹Institute of Genetic Medicine, International Centre for Life,Newcastle University

Summary

Quantification of cardiomyocyte turnover is challenging. The protocol described here makes an important contribution to this challenge by enabling accurate and sensitive quantification of neo-cardiomyocyte nuclei generation and nuclei ploidy.

Abstract

Bien qu'il soit admis que le cœur a un potentiel limité pour régénérer cardiomyocytes après une blessure et que de faibles niveaux de chiffre d'affaires de cardiomyocytes se produisent au cours du vieillissement normal, la quantification de ces événements reste difficile. Ceci est dû en partie à la rareté du processus et le fait que de multiples sources cellulaires contribuent à l'entretien du myocarde. En outre, duplication de l'ADN dans les cardiomyocytes conduit souvent à une cardiomyocytes polyploïdes et conduit rarement à de nouveaux cardiomyocytes par division cellulaire. Afin de quantifier avec précision la discrimination fondée sur le chiffre d'affaires de cardiomyocytes entre ces processus est essentielle. Le protocole décrit ici utilise l'étiquetage nucléoside à long terme afin de marquer tous les noyaux qui ont surgi à la suite de la réplication de l'ADN et cardiomyocytes noyaux identifiés en utilisant l'isolement des noyaux et après immunomarquage PCM1. Ensemble, ce qui permet l'identification précise et sensible de l'étiquetage nucléoside de cardiomyocyte population noyaux. En outre, 4 ', l'étiquetage et à l'analyse de la ploïdie des noyaux 6-diamidino-2-phénylindole, permet la discrimination des noyaux néo-cardiomyocytes à partir de noyaux qui ont incorporé nucléoside pendant Polyploïdisation. Bien que cette méthode ne peut pas contrôler les cardiomyocytes binucléation, il permet une quantification rapide et robuste de noyaux néo-cardiomyocytes tout en tenant compte polyploïdisation. Cette méthode présente un certain nombre d'applications en aval, y compris l'évaluation des agents thérapeutiques potentiels pour améliorer la régénération des cardiomyocytes ou d'enquêter sur les effets de la maladie cardiaque sur le chiffre d'affaires de cardiomyocytes et ploïdie. Cette technique est également compatible avec les techniques immunohistologiques supplémentaires en aval, ce qui permet la quantification de l'incorporation de nucléoside dans tous les types de cellules cardiaques.

Introduction

Ces dernières années , il y a eu une accumulation de preuves contestant la supposition que le cœur est un ^1,2 organe terminale différenciée, post-mitotique. Cependant, la quantification du chiffre d'affaires de cardiomyocytes et la régénération reste difficile.

Les difficultés à identifier avec précision la génération de cardiomyocytes rare en utilisant des techniques immunohistochimiques standard sont bien rapportés ^3. En outre, la source cellulaire de génération cardiomyocytes reste incertaine avec des preuves pour les contributions de la prolifération des cardiomyocytes ainsi que par la différenciation des cellules souches ^4-6. Par conséquent, l'utilisation de modèles de la lignée de traçage qui exigent des connaissances du phénotype cardiomyocytes progénitrices est impossible et la quantification de la prolifération dans une seule population, y compris les cardiomyocytes, est inappropriée. En outre, un cardiomyocytes a le potentiel pour endoréplication sans karyokinèse (entraînant une voiture polyploïdesdiomyocyte) ou karyokinèse en l'absence de la cytokinèse (résultant en un cardiomyocytes binucléées) ^7,8. La quantification précise de la rotation des cardiomyocytes dépend de la capacité de faire la distinction entre ces événements et vraie génération de néo-cardiomyocytes. Cela crée des complications particulières , car la réplication de l' ADN et l' expression des kinases cycline-dépendantes dans les cardiomyocytes ne démontrent pas exclusivement la division cellulaire vraie ^9,10.

Pour aider à la quantification de la production néo-cardiomyocytes, nous avons combiné une technique bien établie d'isolement des noyaux, et l' étiquetage immunologique du matériel péricentriolaire 1 (PCM1) pour l' identification des noyaux de cardiomyocytes comme décrit par Bergmann et al. , ^7,11 à de nouveaux procédés de longue durée , l'étiquetage de l'ADN et l'analyse de ploïdie. MCP-1 est une protéine qui accumule centrosome à la surface nucléaire différenciés, les myocytes non cyclistes. Des études antérieures ont démontré que les anticorps contreMIC-1 étiqueter spécifiquement les noyaux des cardiomyocytes et ^7,11 en tant que telle PCM1 a été utilisée par plusieurs groupes indépendants pour identifier les cardiomyocytes ^1,12,13. De plus, nous avons démontré que l' expression PCM1 mappe à noyaux marqués génétiquement cardiomyocytes dans le modèle TnT-Cre souris transgénique ¹⁴ (figure 1 supplémentaire).

Le protocole décrit ici permet l'identification précise et sensible des néo génération cardiomyocytes noyaux dans le coeur de la souris, quelles que soient les origines cellulaires (Figure 1A et B) tout en excluant simultanément l' étiquetage nucléoside en raison de polyploïdisation de l'analyse (figure 1C et D). Bien que cette méthode ne peut pas contrôler les cardiomyocytes binucléation, il permet une quantification rapide et robuste de noyaux néo-cardiomyocytes qui est nécessaire pour la quantification précise de la rotation des cardiomyocytes. En outre,il fournit un outil de dépistage rapide pour évaluer les changements potentiels dans la dynamique de génération de cardiomyocytes.

Alors que l'étiquetage de l'ADN implique généralement 5-bromo-2'-désoxyuridine (BrdU) comme analogue de la thymidine, le protocole décrit ici utilise dosage 5-éthynyl-2'-désoxyuridine (UED) en fonction car il nécessite moins d'étapes de traitement pour une plus rapide traversants mis et ne nécessite pas de dénaturation de l'ADN pour l'immuno-détection, ce qui rend compatible avec d'autres protocoles d'immunocoloration et augmentant ainsi les applications potentielles en aval du procédé.

Figure 1: palpitation continue avec EdU étiquettes néo-cardiomyocytes , indépendamment de leurs progéniteurs. (A) EdU est incorporé dans l'ADN des cardiomyocytes durant la division cellulaire. Prolifération dans la population de cardiomyocytes se Result en une augmentation ou le remplacement des cardiomyocytes et est donc la synthèse d'ADN productive (contribue à l'entretien et la réparation tissulaire). (B) EdU est incorporé dans l'ADN des cellules souches cardiaques au cours de la division cellulaire. Ceci sera retenu dans la cellule lors de la différenciation de la lignée des cardiomyocytes. Cette différenciation des cellules souches se traduira également par une augmentation du nombre de cardiomyocytes et contribue donc à la maintenance et la réparation tissulaire. (C) Les cardiomyocytes sont susceptibles de subir une réplication de l' ADN "non-productive" entraînant une augmentation de la ploïdie des cardiomyocytes, qui est associée à une hypertrophie des cardiomyocytes et le remodelage du myocarde, mais ne remplacent pas les cardiomyocytes perdus. Le procédé de Polyploïdisation diffère de binucléation car il en résulte une cardiomyocytes avec un seul noyau, qui contient quatre ensembles ou plus de deux chromosomes homologues (> 2N). (D) A la suite d' un noyau p continueUlse, ce protocole décrit l'isolement des noyaux et l'identification des noyaux de cardiomyocytes par expression PCM1 pour permettre la quantification des deux cardiomyocytes ploïdie et EdU incorporation. Expression PCM1 et EdU incorporation détectée par cytométrie de flux. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Protocol

le travail des animaux a été autorisé et approuvé par l'Université de Newcastle comité d'éthique. Toutes les procédures animales ont été réalisées conformément aux indications de la directive 2010/63 / UE du Parlement européen sur la protection des animaux utilisés à des fins scientifiques. 1. Administration EdU Dissoudre EdU dans une solution saline stérile (0,9% p / v) à une concentration finale de 12,5 mg / ml. Chauffer la solution à 40 ° C et à vortex afin de dissoudre complètement. Stocker assez EdU / Saline à 4 ° C pour injecter toutes les souris dans l'étude permettant 6 injections quotidiennes. Remarque: En général plus de 6 souris sont nécessaires pour chaque groupe expérimental. Cependant, les calculs de puissance doivent être effectués pour des études indépendantes. Peser souris individuelles. Calculer le volume nécessaire pour administrer 100 pg / g de solution EdU / saline à chaque souris (8 pi de solution mère EdU par g). Dessinez le volum appropriée de EdU / solution saline dans l'insuline seringue avec une aiguille 25 G. Effectuer intrapéritonéale (ip) injections lors de la manipulation des souris en utilisant des techniques Home Office approuvées. Placer une souris sur le couvercle de la cage. Tirez doucement sur la base de la queue et de saisir fermement la souris par la peau. Exposer l'abdomen pour l'injection en maintenant la souris avec l'index et le pouce près de la base de la tête et basculer la tête de l'animal vers l'arrière vers le sol. Essuyez l'abdomen avec une solution d'alcool à 70%. Localisez la ligne médiane de l'animal et le quadrant inférieur droit. Injecter la solution EdU / Saline dans l'animal dans le quadrant inférieur droit. Injecter souris avec une solution / saline EdU et enregistrer l'heure du jour. Répéter les étapes 01/02 à 01/04 en même temps, de jour, pendant 6 jours consécutifs. Remarque: Comme un contrôle EdU négatif est nécessaire pour régler le déclenchement de l'analyse de cytométrie de flux, injecter un âge supplémentaire, le sexe et correspond expérimentalementsouris ed avec un volume équivalent de solution saline sans EdU. Cela fournira le contrôle nécessaire (pas de commande EdU). Ce contrôle doit être inclus pour chaque étude afin de permettre des variations de lots de réactifs et cytomètre mis en place. 2. Coeurs de récolte A 24 heures après l'injection EdU 6 ème, sacrifier des souris en utilisant la dislocation cervicale (ou une alternative annexe 1 Home Office a approuvé la méthode). Placez animal sacrifié dans une position couchée et de faire l'incision de la peau à partir du milieu de l'abdomen à la membrane avec des ciseaux chirurgicaux. Couper le diaphragme, et la tenue du sternum loin de la cavité du corps, coupé au niveau bilatéral pour exposer le cœur. Soulevez le coeur légèrement et couper les gros vaisseaux sanguins des voies de sortie pour disséquer le coeur de la cavité thoracique. Immédiatement placer chaque coeur dans un tube de 15 ml de centrifugeuse individuelle contenant 10 ml de PBS refroidi à 4 ° C. Transfert cœurs separate 10 cm des boîtes de Pétri, en utilisant un scalpel couper chaque coeur en deux dans une orientation sagittale et laver le cœur en pressant doucement avec une paire de pinces. Puis remplacer le PBS pour éliminer autant de sang que possible. Répéter deux fois cette étape. Placez les deux parties de chaque cœur dans le même individu 1,5 ml microtube. Passez à l'étape 3 ou encore conserver les échantillons à -80 ° C comme indiqué dans les étapes 2.9 et 2.10. En utilisant une aiguille G 25, faire un petit trou dans le couvercle du tube à centrifuger pour empêcher le couvercle de l'ouverture en raison de l'expansion des gaz lorsque le cœur est traité. Étiquetez chaque tube de microcentrifugation et placer dans un récipient d'azote liquide pour geler. 3. Noyaux Dissociation et cardiomyocytes Nuclei Étiquetage Remarque: Ce noyaux étiquetage dissociation et cardiomyocytes noyaux est adaptée de celle de Bergmann et al 11 Effectuez cette procédure sur tous les échantillons injectés.avec EdU et une solution saline injectée (aucun contrôle EdU) contrôle négatif. Voir le tableau 1 pour la recette des solutions nécessaires pour effectuer ces étapes. Pour chaque coeur à analyser, placer 36 ml de BSA à 1% / solution PBS dans un tube d'ultracentrifugation, incuber pendant 30 min, jeter la solution, puis laisser sécher à l'air. Remarque: Ce tube est utilisé dans l'étape 3.6. Placez les coeurs congelés individuels sur un plat de 10 mm sur la glace et mince à l'aide d'un scalpel qui permet aux coeurs de dégivrage pendant le processus de hachage. Placez les coeurs émincées dans 15 ml de tampon de lyse cellulaire dans un tube centrifuge de 50 ml et homogénéiser avec un homogénéiseur de sonde pendant 15 secondes à 25.000 tours par minute à température ambiante. Ajouter encore 15 ml de tampon de lyse cellulaire au tube Centrifugeuse et transfert à 40 ml dounce avec un grand pilon de dégagement. Effectuer 10 coups avec le pilon et filtrer à travers un 100 um puis 40 um cellule crépine dans un tube centrifuge de 50 ml. Centrifugeuse pendant 10 min unt 700 xg à 4 ° C et retirer le surnageant. Remettre en suspension le culot nucléaire dans 25 ml de solution de gradient de saccharose et de la couche des noyaux cellulaires contenant la solution au-dessus de 10 ml de solution fraîche de gradient de saccharose dans le tube d'ultracentrifugeuse préparé en 3.1. Centrifugeuse à 13.000 xg pendant 1 heure à 4 ° C en utilisant un tube rotor oscillant out. Après centrifugation, éliminer le surnageant et remettre en suspension le culot de noyaux dans 1300 ul de tampon de stockage des noyaux dans un tube de 1,5 ml et l'étiquette PCM1. Retirer 300 pi de la suspension à un nouveau tube et ajouter à 700 pi de tampon de stockage de noyaux frais. Nommez ce tube comme le contrôle ISO. Ajouter anti PCM1 à une concentration finale de 8 pg / ml au microtube marqué PCM1 et ajouter un anticorps IgG de lapin témoin isotype à une concentration de 8 pg / ml au microtube marqué contrôle de l'ISO. Incuber une nuit à 4 ° C. Après Incubation, centrifuger à 700 g pendant 10 min, jeter le surnageant, remplacer par 1 ml de tampon de stockage de noyaux frais, resuspendre et centrifuger à nouveau pendant 10 min à 700 x g. Jeter le surnageant et le remplacer par 1 ml de tampon de stockage de noyaux frais. Ajouter 1 pi de F (ab ') 2 Fragment de chèvre anti-lapin IgG (H + L) de l'anticorps (FITC ou d'un colorant vert fluorescent équivalent) afin d'obtenir une concentration finale de 2 pg / ml. Remarque: L'utilisation d'un F (ab ') 2 d'anticorps de fragments diminue le risque de marquage non spécifique des cellules immunitaires, y compris les macrophages et les cellules B. tubes envelopper dans du papier d'aluminium pour protéger de la lumière et incuber pendant 1 heure à 4 ° C. 4. Détection de EdU Incorporation Diluer 10x concentré EdU tampon de réaction 1:10 avec de l'eau déminéralisée. Centrifuger le PCM-1 et ISO noyaux de contrôle marqué par des suspensions à 700 g pendant 10 minutes, jeter le surnageant et remettre en suspension le culot de noyaux dans 1 ml de1% de BSA / solution PBS. Laver deux fois le culot de noyaux. Après le lavage final, jeter le surnageant et le remplacer par 100 ul de EdU fixateur. Enveloppez tubes dans une feuille d'aluminium pour le protéger de la lumière et incuber à température ambiante pendant 15 min. Laver les échantillons deux fois avec 1 ml de BSA à 1% / solution PBS, centrifuger à 700 x g et on incube avec une solution de perméabilisation 1x à base de saponine à température ambiante pendant 15 min. Préparer 1x étiquetage cocktail EdU (tableau 2). Un minimum de 2 réactions sera tenu d'inclure le témoin sans EdU. Ajouter 500 ul de 1 x cocktail EdU marquage directement à chaque échantillon contenant des noyaux déjà dans 100 ul de 1 x solution de perméabilisation à base de saponine et laisser incuber à la température ambiante à l'abri de la lumière pendant 30 minutes. Centrifuger à 700 xg et remettre en suspension dans 1 ml de 1% de BSA / PBS et répétez cette étape deux fois plus. Centrifuger à 700 xg, éliminer le surnageant et le remplacer par 400 pi de solution d' ADN de coloration (voir le tableau des matériaux). Nom du réactif 1. Tampon de lyse cellulaire 0,32 M de saccharose 10 mM de Tris-HCl (pH = 8) 5 mM de CaCl2 l'acétate de magnésium 5 mM 2,0 mM d'EDTA 0,5 mM d'EGTA 1 mM de DTT 2.Sucrose Gradient Solution 2,1 M de saccharose 10 mM de Tris-HCl (pH = 8) l'acétate de magnésium 5 mM 1 mM de DTT 3. tampon de stockage Nuclei (NSB) 0,44 M de saccharose 10 mM de Tris-HCl (pH = 7,2) 70 mM KCI 10 mM de MgCl2 1,5 mM spermine Tableau 1: Noyaux ingrédients tampons d'isolement Recette pour tous les tampons utilisés dans la section de protocole 3 (Nuclei dissociation et cardiomyocytes noyaux étiquetage).. 5. Analyse par cytométrie en flux Remarque: Effectuez cytométrie en flux sur des noyaux isolés comme décrit précédemment 7,11,15. Tout d' abord, créer un diagramme décrivant Forward Scatter (FSC) et Side Scatter (SSC) pour permettre la discrimination des noyaux des débris (figure 2A). Créer un complot visant à discriminer les noyaux simples à partir de granulats (figure 2B) en traçant 4 ', 6-diamidino-2-phénylindole) zone (DAPI) (3-405 / 450/50-A) par rapport à la hauteur (33-405 / 450 / 50-H). Assurez-that-A 50 signaux 3-405 / 450 / est collectée sur l'échelle linéaire pour permettre la détermination correcte de la teneur en ADN. Créer un terrain décrivant 488/535 / 30-A (PCM-1) vs SSC et afficher uniquement les événements de la porte singlet créé en 5.2 afin d'évaluer PCM-1 expression dans la population singlet. Exécutez l'exemple de contrôle isotypique afin d'établir un PCM-1 porte positive (figure 2C). Exécuter une petite quantité de PCM1 étiqueté échantillon pour vérifier l'PCM1 exprimant la population et gating poste. Créer un terrain décrivant SSC-A vs 405/450 / 50-A (pour détecter DAPI). Dans cette parcelle, affichage seulement singlet PCM1 noyaux exprimant, en utilisant les portes créées en 5.3. Utilisez cette parcelle pour créer une porte hiérarchisé supplémentaire qui ne contient que 2N noyaux (figure 2D). Créer un terrain qui décrit 488/535 / 30-A vs 1-633 / 660/20-A pour permettre l'identification de l'étiquetage EdU de l'PCM1 exprimant la population de cardiomyocytes. Afficher uniquement les noyaux qui sont singlet, P CM1 + et 2N utilisant le déclenchement ci-dessus. Exécutez échantillon de coeur d'aucun contrôle EdU pour régler la porte positif EdU (figure 2E). Créer la porte appropriée pour EdU cellules +. Record et quantifier singlet, PCM-1 exprimant, des noyaux 2N qui ont incorporé EdU. Calculer cette population en pourcentage du total des singulet, PCM1 + noyaux. Cela fournira le taux de néo-cardiomyocytes génération noyaux, au cours de la période d'impulsion EdU 7 jours, en tant que pourcentage du nombre total de noyaux de cardiomyocytes. Remarque: Comme DAPI liaison à l'ADN est stoechiométrique l'intensité de fluorescence est proportionnelle à la quantité d'ADN. Déterminer la ploïdie sur la base de l'intensité de la / 450/50 Un signal 405, comme décrit précédemment 7. Pour évaluer la ploïdie au sein de la population de cardiomyocytes totale utiliser la parcelle établie à 5,5 et une stratégie de déclenchement en fonction de la concentration d'ADN 7. /files/ftp_upload/53979/53979fig2.jpg "/> Figure 2:. Gating stratégie visant à quantifier les cardiomyocytes EdU constitution et ploïdie (A) Noyaux sont discriminé des débris sur la base de diffusion vers l' avant (FSC) et de diffusion latérale (SSC). (B) Une porte linéaire est créé et la population de noyaux singlet est identifié sur la base de l' étiquetage DAPI et la hauteur 405/450/50 vs signal de zone. (C) déclenchement fluorescent permet de séparer les noyaux des cardiomyocytes noyaux (PCM-1-négatif) (PCM-1-positif) et non cardiomyocytes à partir de tissu cardiaque. (D) Intensité du signal de DAPI est utilisé pour déterminer la concentration d'ADN et donc ploïdie des noyaux de la population de cardiomyocytes PCM1 +. Chez la souris> 80% de noyaux de cardiomyocytes sont diploïdes (2n). (E) gating fluorescente permet la séparation des 2N, les noyaux de cardiomyocytes qui ont incorporé EdU (PCM + / EDU + = 0,9%) à partir 2N, les cardiomyocytes qui ne sont pas incorporés EdU (PCM + enseignement). Toutes les étapes sont détaillées dans le protocole 5.0. Exemple illustré de mdx -. / Y souris sur l'arrière – plan C57 / de BL10 S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Representative Results

Cette méthode permet la quantification de l'augmentation de l'incorporation EdU en raison de cardiomyocytes division de noyaux tout en contrôlant l'augmentation polyploïdisation. En utilisant un essai basé sur la BrdU, nous avons démontré précédemment que le coeur de mammifère répond à la perte de cardiomyocytes chronique, dans le modèle de souris mdx dystrophie musculaire de Duchenne, à la régénération des cardiomyocytes. Nous avons utilisé les méthodes décrites ici pour valider davantage nos résultats publiés et de démontrer l'utilité du protocole. Selon le protocole décrit; (âgés de 12 semaine) souris mdx BL10 et de contrôle des adultes ont été puisées avec une injection quotidienne de EdU pendant 7 jours, ont indiqué précédemment pour permettre une analyse statique entre les groupes expérimentaux 5,13. L' analyse immunohistologique des coeurs puisés démontre la présence de cardiomyocytes exprimant PCM1 qui ont incorporé EdU (figure 3A). usin Cependant, les données obtenuesg méthodes immunohistologiques peuvent être mal interprétés, comme d'autres types de cellules qui ont incorporé EdU peuvent être mal identifiés comme cardiomyocytes. Un exemple de cela est illustré dans la figure 1A complémentaire et B. En outre des méthodes immunohistologiques ne distinguent pas polyploïdisation de la division nucléaire. La cytométrie en flux analyse détaillée dans ce protocole permet la quantification rapide de la division nucléaire cardiomyocytes chez la souris mdx et de contrôle, tout en excluant les cellules ayant incorporé EdU en raison de polyploïdisation. Similaires aux données publiées précédemment 13, l' analyse a révélé une augmentation des taux de néo-cardiomyocytes génération noyaux dans les cœurs de souris mdx par rapport à l' âge des contrôles (Figure 3B; et C 1,2% contre 0,17%) appariés. Figure 3: </strong> Quantification de EdU étiqueté cardiomyocytes dans les cœurs et de type sauvage mdx. (A) Image de projections Z-stack prises à partir de 40 um d' épaisseur des sections de coeurs mdx. PCM-1 exprimant les noyaux de cardiomyocytes (vert) qui a incorporé EdU (rouge). La flèche jaune indique EdU étiqueté cardiomyocytes. i et ii indique individuel EdU marqué cardiomyocytes indiquées dans le plan Z. Nuclei marqué avec DAPI (bleu) (B et C) par cytométrie de flux de noyaux isolés montrant des parcelles représentatives 12-13 semaine vieux type sauvage (C57 / BL10) et la souris mdx (mdx – / y sur le C57 / BL10 arrière – plan). (B) Histogramme montrant l' intensité et de la discrimination DAPI entre 2N et 2N> noyaux. (C) Parcelles montrant EdU incorporation dans la population de noyaux 2N cardiomyocytes lorsqu'il est analysé comme décrit dans ce protocole. Pour toutes les souris Edu a été administré pendant 1 semaine à partir de 12 semaines d'âge. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. Figure supplémentaire 1:. PCM-1 est un marqueur spécifique pour les noyaux cardiomyocytes En utilisant le protocole décrit les noyaux ont été isolés de la souris à double transgénique produite par le croisement des souris TNT-cre 14 avec la ligne rapporteur cre sensible ROSA nT / nG 16. L'activation cre de la souris résultante sous le contrôle de la troponine T (TNT) , le promoteur conduit l'expression irréversible de la GFP est localisé avec les noyaux. Nuclei marqué avec le contrôle isotypique (Iso) démontre la capacité d'identifier la GFP exprimant cardiomyocytes population noyaux (488/530/30-A). Étiquetage des noyaux avec anti- PCM1 (anticorps secondaire détectés par 633-660 / 20-A) démontre la corrélation d'expression PCM1 avec le cardiomyocy GFP exprimantla population des noyaux te. Dans cet exemple , 98,8% des noyaux de cardiomyocytes identifiés par l' activité du promoteur TNT, sont marquées par l' anticorps PCM1. S'il vous plaît cliquer ici pour télécharger la figure 1 supplémentaire. Figure complémentaire 2:. Défis pour quantifier le renouvellement des cardiomyocytes par des techniques immunohistologiques (A) Image 2D montre deux PCM-1 exprimant des noyaux de cardiomyocytes (vert) qui semblent être également marqué pour EdU (rouge). Les flèches jaunes indiquent ce qui semble être des cardiomyocytes qui ont incorporé EdU. Cela est dû à la co-localisation apparente d'expression PCM1 et l'étiquetage EdU lorsque visualisées en utilisant l'imagerie 2-dimensionnel. (B) une projection en 3 dimensions de l'image identifie l'étiquette EdU cellules ne sont pas des cardiomyocytes , mais sont des cellules non superposées PC cardiomyocytesM1 exprimant des noyaux de cardiomyocytes. Souris C57 / BL10 à 12 semaines d'âge utilisé pour des expériences. S'il vous plaît cliquer ici pour télécharger complémentaire Figure 2A. S'il vous plaît cliquer ici pour télécharger complémentaire Figure 2B. Composants de réaction Nombre de réactions 2 5 PBS 875 pi 2,19 ml protectant Cuivre 20 ul 50 ul un colorant fluorescent azoture picolyle 5 ul 12,5 pi dilué réactiontampon préparé en 4.1 100 ul 250 ul Le volume total de réaction 1 ml 2,5 ml Tableau 2: EdU ingrédients cocktail. Recette pour l'étiquetage EdU cocktail nécessaire dans la section de protocole 4 (Détection de EdU incorporation).

Discussion

Afin de quantifier avec précision le chiffre d'affaires des cardiomyocytes et des essais de régénération doivent distinguer entre le vrai génération de cardiomyocytes et la division de l'ADN improductive. De nombreuses études continuent de simplement ignorer ces événements improductives, quantifier la prolifération des cardiomyocytes uniquement par l'expression de kinésie cycline et les marqueurs du cycle cellulaire. À ce jour, une seule méthode qui permet la quantification précise de la rotation des cardiomyocytes tout en contrôlant ces événements improductives reste allusive. En particulier , il reste difficile d'expliquer cardiomyocytes polyploïdisation qui contribue jusqu'à ~ 65% des cardiomyocytes réplication de l' ADN ^13. Par conséquent, pour aider à la quantification précise de la génération de cardiomyocytes, nous avons mis au point un protocole qui permet la quantification robuste des taux de noyaux cardiomyocytes neo, tout en excluant la réplication de l'ADN qui se traduit par une augmentation de la ploïdie. Bien que ce protocole ne peut pas la discrimination entre les genres néo-cardiomyocytestion et cardiomyocytes bi-nucléation, il peut être utilisé rapidement et de calculer avec précision la limite supérieure (ce qui représente une ploïdie) de génération de cardiomyocytes. Ce protocole fournit donc un outil de dépistage pour évaluer les changements potentiels dans les taux de génération de cardiomyocytes et polyploïdisation dans des modèles de maladie ou d'évaluer l'efficacité potentielle de la thérapeutique. Une fois que l' évolution du taux de néo-cardiomyocytes génération noyaux sont identifiés en utilisant ce protocole des études ultérieures peuvent être utilisées pour déterminer si cela en raison de changements dans la production d'cardiomyocytes du nombre cardiomyocytes de nucléation, comme décrit précédemment ^2,13,17,18. Ceux-ci comprennent l'utilisation de la dynamique histologiques de nucléation quantification des cardiomyocytes au cours de la période d'impulsion ou des analyses des coupes de tissus obtenus à partir d'animaux EdU pulsés pour comparer EdU incorporation dans les populations de cardiomyocytes mononucléées et multinucléées.

En raison des faibles niveaux de chiffre d'affaires cette cardiomyocytesprotocole utilise des injections multiples de EdU sur une période de 7 jours. Cela permet également la «chasse» de toutes les sources cellulaires potentielles de génération de cardiomyocytes et permet la quantification de cumulative génération cardiomyocytes noyaux au cours de cette période de temps. Selon l'étude, ce délai peut être ajusté en fonction des niveaux prévus de génération de cardiomyocytes. Pour la quantification précise de EdU incorporation dans les noyaux des cardiomyocytes, il est impératif qu'il n'y ait pas de marquage non spécifique des noyaux avec l'anticorps secondaire utilisé pour détecter PCM-1 de réactivité. Il serait donc prudent de procéder à des expériences de titrage d'anticorps secondaires supplémentaires afin d'optimiser cet aspect du protocole, en particulier si un anticorps secondaire autre que celui suggéré dans ce protocole doit être utilisé. Le protocole décrit ici utilise PCM-1 expression pour identifier les noyaux cardiomyocytes. Bien que ce soit un marqueur de cardiomyocytes établi, d'autres marqueurs peuvent être utilisés pour validerdonnées; ceux – ci comprennent des anticorps spécifiques pour la troponine cardiaque T qui a été identifiée comme étant en partie localisée dans les noyaux des cardiomyocytes ^1. De même, les protéines nucléaires localisées alternatives peuvent être utilisées pour identifier et quantifier EdU l'incorporation dans les populations des noyaux autres que ceux des cardiomyocytes. Il est important que tous les noyaux cardiomyocytes qui subissent une mitose active sont exclus de l'analyse, comme le sort de cette synthèse de l'ADN est inconnue et peut se traduire soit par une division cellulaire ou une augmentation de la ploïdie. PCM1 est démonté au cours de la phase M du cycle cellulaire par conséquent cardiomyocytes mitose ne sera pas identifié par l'expression PCM1. En outre, tous les noyaux en phase S du cycle cellulaire doivent être exclues de l'analyse ultérieure. Ceci peut être réalisé par gating sur tous les noyaux ayant une intensité de la population au-dessus du DAPI 2N y compris ceux ayant une intensité de DAPI entre les 2N et 4N populations.

Bien qu'il ne soit plus en plusaccepté que le cœur a la capacité de remplacer les cardiomyocytes au cours du vieillissement normal et une lésion aiguë qui suit, la source et le degré de ce potentiel reste controversé. En outre, les taux disparates de chiffre d'affaires de cardiomyocytes ont été signalés ^1,7,20-22. Cela peut être en partie en raison des difficultés d'identification et de quantification néo-cardiomyocytes génération ¹⁹ avec précision. À ce jour , la majorité des études se sont appuyés uniquement sur l'utilisation de l' analyse histologique et l'identification des cardiomyocytes via l'expression de protéines cytoplasmiques, y compris des protéines du sarcomère, pour la quantification du chiffre d'affaires de cardiomyocytes et le renouvellement ^2,4,23,24. L'utilisation de ces procédés pour détecter l'expression des marqueurs de prolifération, ou comme le démontre ici, l'incorporation d'analogues de la thymidine peut facilement conduire à une mauvaise identification d'autres types de cellules cardiaques comme cardiomyocytes. Bien que l'utilisation d'imagerie confocale 3D peut aider à atténuer ces problèmes eméthodes ese sont coûteux et prend du temps. Fait intéressant, le protocole décrit ici montre néo-cardiomyocytes génération noyaux se produit à un taux de 0,17% par semaine. Ceci est cohérent avec d' autres flux cytométrie études basées démontrant les taux de rotation hebdomadaires allant jusqu'à 0,13% ^5. Bien qu'il soit tentant d'extrapoler les taux de rotation annuel sur la base de ces données, comme dans les études précédentes ^2,5,25,26, cela est inapproprié que les taux de rotation sont dynamiques au cours de la durée de vie d'un animal ^13.

Cette méthode présente un certain nombre d'applications potentielles, y compris l'évaluation des agents thérapeutiques potentiels pour améliorer la régénération des cardiomyocytes ou d'enquêter sur les effets de la maladie cardiaque sur le chiffre d'affaires de cardiomyocytes et les taux de cardiomyocytes polyploïdisation.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported by the British Heart Foundation, project grant PG/13/69/30454.

Materials

0.32 M sucrose	Sigma	84100
10 mM Tris-HCl (pH = 8)	Sigma	T3253
5 mM CaCl2	Sigma	c5086
5 mM magnesium acetate	sigma	M-5661
2.0 mM EDTA	Sigma	E5134
0.5 mM EGTA	Sigma	63779
1 mM DTT	Sigma	D0632
70 mM KCl	Sigma	P9541
10 mM MgCl2	Sigma	M8266
1.5 mM spermine	Sigma	85590
Isotype rabbit IgG- ChIP Grade	abcam	abc7415
Rabbit anti-PCM-1 antibody	Sigma	HPA023374
Alexa Fluor 488 F(ab')2 Fragment of Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody	Life technologies	A-11070
cell strainers 70 μm and 100μm	Fisher scientific	11597522, 11517532
Glass dounce (40 ml) and pestle large clearance	Sigma	D9188-1SET
EdU (5-ethynyl-2’-deoxyuridine)	Life technologies	A10044
Click-iT Plus EdU Alexa Fluor 647 Flow Cytometry Assay Kit	Life technologies	C10634	This kit inlcudes reagents required for section, EdU reaction buffer, EdU fixative, saponin-based permeabilization solution and the reagents required for the EdU labelling cocktail.
CyStain DNA 2 step kit,	Sysmex Partec	05 5005	This kit inlcudes reagents required for DAPI labelling (DNA staining solution)
Probe homogeniser e.g. TissueRuptor	Qiagen	9001273
TissueRuptor Disposable Probes	Qiagen	990890
ultracentrifuge	Sorvall
Facscanto II	BD Biosciences
Ultracentrifuge Tube, Thinwall, Polypropylene. 38.5 mL, 25 x 89 mm	Beckman Coulter	326823
Bovine serum albumin	Sigma	A2153

References

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Richardson, G. D. Simultaneous Assessment of Cardiomyocyte DNA Synthesis and Ploidy: A Method to Assist Quantification of Cardiomyocyte Regeneration and Turnover. J. Vis. Exp. (111), e53979, doi:10.3791/53979 (2016).

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