Kardiyomiyosit DNA Sentezi ve ploidinin Eşzamanlı Değerlendirme: Bir Yöntem kardiyomiyosit Yenilenme ve ciro miktarının belirlenmesi Yrd

Hayvan çalışmaları yetkili ve Newcastle Üniversitesi Etik inceleme kurulu tarafından onaylanmıştır. Tüm hayvan prosedürleri bilimsel amaçlarla kullanılan hayvanların korunmasına ilişkin Yönerge'de 2010 Avrupa Parlamentosu / 63 / EU gelen yönergelere uygun gerçekleştirilir bulundu. 1. Edu İdaresi steril tuzlu su çözeltisi içinde çözülür edu (w /% 0.9 h) 12.5 mg / ml'lik bir nihai konsantrasyonda. tamamen çözülmesi için 40 ° C ve vorteks çözelti ısıtılır. 6 günlük enjeksiyonlar için izin çalışmada tüm fareleri enjekte 4 ° C'de yeterli edu / Saline saklayın. Not: Genellikle 6 farelerin her bir deney grubu için gereklidir. Ancak, güç hesapları bağımsız çalışmalar için yapılmalıdır. Bireysel fareler tartılır. Her fare edu / tuzlu su çözeltisi içinde 100 ug / g (g başına stok edu solüsyonu 8 ul) yönetmek için gerekli hacmi hesaplayın. Uygun volum çizmek25 G iğne ile insülin şırınga içine edu / tuzlu e. onaylı Ev Ofis tekniklerini kullanarak fareleri işlerken intraperitoneal (ip) enjeksiyonları gerçekleştirin. kafes kapağındaki bir fare yerleştirin. Yavaşça kuyruk tabanı geri çekin ve sıkıca yapışmak fare kavramak. kafa tabanına yakın işaret parmağı ve başparmak ile fare tutan ve yere doğru geriye hayvanın kafasını devrilme enjeksiyon için karın Açığa. % 70 alkol solüsyonu ile karın silin. Hayvanın orta hat ve sağ alt kadranda bulun. Sağ alt kadran içine hayvana edu / Tuzlu çözüm enjekte. Edu / tuzlu su çözeltisi ile fareler enjekte edilir ve günün saatini kaydeder. Tekrarlayın 6 gün boyunca, günün aynı anda 1.4 1.2 adımları tekrarlayın. Not: Bir Edu negatif kontrol akım sitometri analizi için yolluk ayarlamak için gerekli olduğundan, ek bir yaş, cinsiyet enjekte ve deneysel maçEdu olmayan tuz denk hacimde Ed fare. Bu, gerekli kontrolü (hiçbir EDU kontrolü) sağlayacaktır. Her çalışma reaktiflerin gruplar halinde varyasyonlara izin için bu kontrol dahil edilmelidir ve sitometresi kurdu. 2. Hasat Kalpler 6. Edu enjeksiyonundan 24 saat sonra, servikal dislokasyon (ya da 1 Home Office onaylı alternatif Çizelgesi yöntemi) kullanılarak fareler kurban. Bir yatar pozisyonda kurban hayvan koyun ve cerrahi makas ile diyaframa orta karın cilt kesi yapmak. diyaframı kesti ve kalp maruz bilateral kesilmiş vücut boşluğunda uzak sternum tutarak. biraz kalbi kaldırın ve göğüs boşluğu dışında kalbini incelemek için çıkış yolunda büyük kan damarları kesilmiş. Hemen PBS 4 ° C'ye soğutulmuş 10 ml içeren bağımsız bir 15 ml santrifüj tüpüne her kalp yerleştirin. sep kalpleri aktarınarate 10 cm Petri kapları, bir neşter sagital yönde ikiye her kalbi kesilmiş ve yavaşça forseps bir çift ile sıkarak kalbi yıkayın kullanarak. Sonra mümkün olduğunca kan kaldırmak için PBS değiştirin. İki kez bu adımı yineleyin. Aynı birey 1.5 ml mikrosantrifüj tüp içine her kalbin iki parçayı yerleştirin. 3 veya alternatif mağaza örnekleri adıma -80 ° C adımlarla 2.9 ve 2.10 ayrıntılı olarak devam etmektedir. 25 G iğne kullanılarak, kalp işlendiğinde Mikrosantrifüj tüpü kapak küçük bir delik dolayı gazların genişlemesine kapağın açılmasını önlemek için kullanılır. dondurma için sıvı azotun, bir kap içinde her bir mikrosantrifüj tüpü ve yer etiketi. 3. Çekirdekler Ayrılma ve kardiyomiyosit Çekirdekler Etiketleme . 11 Bu çekirdekler ayrılma kardiyomyosit çekirdekleri etiketleme Bergmann ve ark o uyarlanmıştır enjekte tüm örnekler üzerinde bu yordamı gerçekleştirin: NotEdu ve enjekte tuz (hiçbir EDU kontrolü) negatif kontrol ile. Bu adımları gerçekleştirmek için gerekli çözümlerin tarifi için Tablo 1'e bakınız. Her bir kalp analiz edilmesi için, 30 dakika inkübe edilir, bir ultra santrifüj tüpüne% 1 BSA / PBS çözeltisi 36 mL yer çözeltisi atılır ve daha sonra kurumaya bırakın. Not: Bu tüp adım 3.6 kullanılır. kalpleri kıyma işlemi sırasında defrost sağlayan bir neşter kullanılarak buz ve kıyma üzerinde 10 mm çanak üzerine bireysel dondurulmuş kalpleri yerleştirin. 50 ml'lik bir santrifüj tüpünde hücre lisis tamponu, 15 ml inceltilmiş kalpleri yerleştirin ve oda sıcaklığında 25.000 rpm'de 15 saniye için bir sonda homojenleştirici ile homojenize edilmiştir. Santrifüj tüpüne Celi Lysis Buffer bir başka 15 ml ilave edilir ve geniş bir açıklık havan tokmağı ile 40 ml'lik bir Dounce transfer. havaneli ile 10 kez gerçekleştirmek ve 50 ml'lik bir santrifüj tüpü içine, bir 100 um ile daha sonra 40 mikron hücre süzgecinden süzülür. 10 dk için santrifüjT 700, 4 ° C'de xg ve supernatant çıkarın. Sükroz Gradyan çözeltiden 25 ml, nükleer pelet yeniden süspanse edin ve 3.1 hazırlanan bir ultra santrifüj tüpüne taze sukroz gradyanlı çözeltisi 10 ml üzerine çözelti içeren hücre çekirdekleri katman. bir salıncak üzerinden boru rotor kullanılarak 4 ° C sıcaklıkta 1 saat boyunca 13.000 x g'de santrifüjleyin. Santrifüj sonrasında, süpernatant atılır ve 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü ve etiket PCM1 çekirdekler saklama tamponu 1.300 ul çekirdekleri pelletini. Yeni bir mikrosantrifüj tüpüne süspansiyon 300 ul çıkarın ve taze çekirdekler depolama tamponu 700 ul ekle. ISO kontrolü gibi bu tüp etiketleyin. PCM1 etiketli mikrosantrifüj tüpüne mi 8 ug / mL'lik nihai bir konsantrasyonda anti PCM1 ekleyin ve ISO kontrolü etiketli mikrosantrifüj tüpüne 8 ug / ml bir konsantrasyonda Tavşan IgG izotip kontrol antikoru ilave edin. 4 ° C'de bir gece boyunca inkübe edilir. aşağıdaki inkubasyonation, 10 dakika boyunca 700 x g'de santrifüj 700 x g'de 10 dakika boyunca tekrar taze çekirdek saklama tamponu, tekrar süspansiyon ve santrifüj 1 ml yerine, süpernatant atılır. Süpernatantı atın ve taze çekirdekler depolama tamponu 1 ml ile değiştirin. 2 ug / ml'lik bir nihai konsantrasyon elde etmek için F (ab ') Keçi anti-tavşan IgG (H + L) antikoru (FITC veya eşdeğer yeşil floresan boya) 2 Fragment 1 ul ekle. Not: bir F (ab ') kullanımı 2 fragmanı antikorun makrofajlar ve B hücreleri gibi immün hücrelerin spesifik olmayan etiketleme potansiyelini azaltır. alüminyum folyo sarma borular ışıktan korumak ve 4 ° C'de 1 saat boyunca inkübasyona. Edu Kuruluş 4. Algılama Seyreltin 10x deiyonize su ile edu reaksiyon tamponu 01:10 konsantre. Santrifüj PCM-1 ve ISO kontrolü etiketli çekirdek süspansiyonları, 10 dakika boyunca 700 x g hızında, süpernatan atılır ve 1 ml çekirdekleri pelet% 1 BSA / PBS solüsyonu. iki çekirdek pelet yıkayın. Son yıkamadan sonra, süpernatantı atmak ve edu fiksatif 100 ul ile değiştirin. ışıktan korumak ve 15 dakika oda sıcaklığında inkübe edin, alüminyum folyo ile tüpler sarın. 700 xg% 1 BSA / PBS çözeltisi, santrifüj kez 1 ml örneği yıkama ve 15 dakika boyunca oda sıcaklığında 1 x saponin bazlı permeabilizasyon çözeltisi ile inkübe edilir. 1x edu etiketleme kokteyl (Tablo 2) hazırlayın. 2 reaksiyonların en az hiçbir EDU kontrolü de gerekecektir. şirketinden önce 1x saponin bazlı permeabilizasyon çözeltisi 100 ul çekirdek içeren her bir örnek için 1x edu markalama kokteyl 500 ul ilave edin ve 30 dakika boyunca ışıktan korunarak oda sıcaklığında inkübe edin. % 1 BSA / PBS 1 ml 700 xg ve tekrar süspansiyon Santrifüj ve bu adımı iki kez daha tekrarlayın. 700 xg'de santrifüj, supernatant atmak ve 4 ile değiştirinDNA boyama çözeltisi 00 ul (Malzeme Tablo). Reaktif Adı 1. Hücre Liziz Tamponu 0.32 M sukroz 10 mM Tris-HCI (pH = 8) 5 mM CaCl2 5 mM magnezyum asetat 2.0 mM EDTA 0.5 mM EGTA 1 mM DTT 2.Sucrose Gradyan Çözelti 2.1 M sukroz 10 mM Tris-HCI (pH = 8) 5 mM magnezyum asetat 1 mM DTT 3. Çekirdekler depolama tamponu (NSB) 0.44 M sukroz 10 mM Tris-HCI (pH = 7.2) 70 mM KCI 10 mM MgCl2 1.5 mM spermin Tablo 1: Çekirdekler izolasyon tampon maddeler protokol bölüm 3 (Çekirdekler ayrışma kardiyomyosit çekirdekleri etiketleme) kullanılan tüm Tamponlar için Reçete.. 5. Akım Sitometrisi Analizi Not: Daha önce 7,11,15 tarif edildiği gibi izole çekirdekler üzerinde sitometri Akışı gerçekleştirin. İlk olarak, enkaz (Şekil 2A) gelen çekirdeklerin ayrımcılık izin İleri Yayılım (FSC) ve Yana Yayılım (SSC) açıklayan bir arsa oluşturun. Yüksekliği karşı 4 çizerek agrega (Şekil 2B) dan tek çekirdekleri ayırmak için bir komplo ', 6-diamidino-2-phenylindole) oluşturun (DAPI) alan (3-405 / 450/50-A) (33-405 / 450 / 50-H). tha sağlamakt 3-405 / 450/50 sinyal DNA içeriğinin doğru belirlenmesini sağlamak için doğrusal bir ölçek üzerinde toplanır. SSC vs 488/535/30 A açıklayan bir arsa (PCM-1) oluşturma ve tekli popülasyonda PCM-1 ifadesini değerlendirmek için 5.2 oluşturulan tekli kapısından sadece olayları görüntülemek. PCM-1 pozitif kapı (Şekil 2C) oluşturmak üzere İzotip kontrol örneği çalıştırın. PCM1 küçük bir miktar nüfus ve yolluk konumunu ifade PCM1 doğrulamak için örnek etiketli çalıştırın. 405/450/50-A (DAPI algılamak için) vs SSC-A açıklayan bir arsa oluşturun. Bu arsa içinde, ekran sadece 5.3 oluşturulan kapıları kullanarak, PCM1 ifade çekirdekleri tekli. Sadece 2N çekirdekleri (Şekil 2B) içeren ek bir hiyerarşik kapısı yaratmak için bu komplo kullanın. Kardiyomiyosit nüfusu ifade PCM1 EDU etiketleme tanımlanmasını sağlamak için 1-633 / 660/20-A vs 488/535 / 30 A tanımlayan bir arsa oluşturun. tekli, P sadece çekirdekleri görüntülemek Yukarıdaki ayırıp kullanarak CM1 + ve 2N. Hiçbir EDU kontrolü çalıştırın kalp örnek edu pozitif kapısı (Şekil 2E) ayarlamak için. Edu + hücreleri için uygun kapı oluşturun. Tutanak ve ölçmek tekli, Edu dahil olması PCM-1 ifade 2N çekirdekler. toplam tekli, PCM1 + çekirdek bir yüzdesi olarak bu nüfusu hesaplayın. Bu, toplam kardiyomiyosit çekirdekleri bir yüzdesi olarak, 7 günlük edu darbe süresince neo-kardiyomiyosit çekirdek oluşum oranını sağlayacaktır. Not: DNA bağlanma DAPI stoikiometrik olduğu floresan yoğunluğu DNA miktarı ile orantılıdır. Daha önce tarif edildiği gibi, 7 405/450/50 bir sinyalin yoğunluğuna dayalı olarak ploidi belirler. Toplam kardiyomiyosit nüfus içinde ploidi değerlendirmek için 5.5 kurulan arsa ve DNA konsantrasyonu 7 dayalı bir yolluk strateji kullanın. /files/ftp_upload/53979/53979fig2.jpg "/> Şekil 2:. Kardiyomiyosit Edu katılmasını ve ploidi ölçmek için strateji yolluk (A) Çekirdekler forward scatter (FSC) ve yan dağılım (SSC) dayalı enkaz ayırt edilir. (B) doğrusal kapı oluşturulur ve tekli çekirdek nüfus DAPI etiketleme ve alan sinyali vs 405/450/50 boyuna göre belirlenir. (C), Floresan yolluk kalp dokusunda kardiyomiyosit çekirdekleri (PCM-pozitif 1) ve non-kardiyomiyosit (PCM-1-negatif) çekirdeklerin ayrılmasını sağlar. DAPI sinyalinin (D) Yoğunluk DNA konsantrasyonu ve PCM1 + kardiyomiyosit nüfusun böylece çekirdek ploidi belirlemek için kullanılır. farede> kardiyomiyosit çekirdeklerinin% 80 diploid (2n) 'dir. (E) Floresan yolluk 2N ayrılmasını sağlar 2N Edu (PCM + / EDU + =% 0.9) dahil olması kardiyomiyosit çekirdeklerinin, Edu dahil değil kardiyomiyositlerde (PCM + EDU-). Tüm adımlar protokolde 5.0 detaylandırılmıştır. MDX gösterilmeleri Örnek -. C57 / BL10 arka plan üzerinde / y fareler bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.