心筋細胞のDNA合成と倍数性の同時評価：心筋細胞再生の定量化を支援する方法および売上高

動物の作業はニューカッスル大学の倫理審査委員会によって承認され、承認されました。全ての動物手順は、科学的な目的のために使用される動物の保護に関する欧州議会の指令63分の2010 / EUからのガイドラインに準拠して実施しました。 1. EDU管理 12.5ミリグラム/ mlの最終濃度で、滅菌生理食塩液中EDU（w / vの0.9％）を溶解させます。 完全に溶解するために40°Cと渦の溶液を加熱します。 6毎日の注射を可能にする研究にすべてのマウスを注入するために4℃で十分なEDU /生理食塩水を保管してください。 注：通常6以上のマウスが各実験群のために必要とされます。しかし、電力の計算は、独立した研究のために行われるべきです。 個々のマウスの重量を測定。各マウスにEDU /生理食塩水を100μg/グラム（グラムあたりの株式EDU液の8μl）を管理するために必要な量を計算します。 適切なvolumを描きます25 G針を有するインスリン注射器へのEDU /生理食塩水の電子。 承認された内務省の技法を用いてマウスを処理しながら、腹腔内（ip）注射を行います。 ケージの蓋の上にマウスを置きます。ゆっくり尾の付け根に引き戻し、しっかりと首筋によってマウスを把握します。 ヘッドのベース近くに人差し指と親指でマウスを保持し、床に向かって後方に動物の頭を傾けて注入するための腹部を公開します。 70％アルコール溶液で腹部を拭いてください。動物の正中線と右下の象限の位置を確認します。右下の象限に動物にEDU /生理食塩水を注入します。 EDU /食塩水をマウスに注射し、時刻を記録します。 繰り返して、6日間連続して、一日の同じ時間に1.4から1.2を繰り返します。 注：EDUネガティブコントロールは、フローサイトメトリー分析のためにゲートを設定するために必要とされるように、付加的な年齢、性別を注入し、実験的に一致EDUのない等量の生理食塩水とエドマウス。これは、必要な制御（無EDU制御）を提供します。この制御は、設定の試薬およびサイトメーターのバッチの変動を可能にするために、すべての研究のために含まれるべきです。 2.収穫ハーツ 6 番目の EDUの注射後24時間で、頸椎脱臼（または1内務省は、認可済みの代替スケジュール法）を用いてマウスを生け贄に捧げます。 仰臥位で犠牲に動物を置き、手術用ハサミで振動板に半ば腹部から皮膚切開を行います。 横隔膜をカットし、心臓を露出するために、左右カット、体腔から離れて胸骨を保持しています。 少し心を持ち上げ、胸腔から心臓を解剖する流出路の主要な血管を切ります。 すぐにPBSを4℃に冷やした10ミリリットルを含む個々の15​​mlの遠心管に各心を置きます。 9月に心を移し矢状方向に二​​つにそれぞれの心をカットメスを用いて、10センチメートルペトリ皿をarate、静かにピンセットで圧搾することにより心を洗います。そして、できるだけ多くの血液を除去するためにPBSを交換してください。二回、この手順を繰り返します。 同じ個体1.5ミリリットルマイクロ遠心チューブにそれぞれの心の両方の部分を置きます。 3または代替的に店舗標本に進み-80℃〜ステップ2.9と2.10で説明するように。 25 G針を使用して、心臓が処理されるときにマイクロ遠心チューブのふたに小さな穴が原因でガスの膨張開口部から蓋を防止することを可能にします。 凍結し、液体窒素の容器に各マイクロチューブや場所にラベルを付けます。 3.核解離および心筋細胞核のラベリング注：この核解離および心筋細胞核の標識はバーグマンらのものから適合されている11注入すべてのサンプルでこの手順を実行します。EDUと注入された生理食塩水（無EDU制御）を陰性対照と。これらの手順を実行するために必要なソリューションのレシピについては、 表1を参照してください。 各心臓を分析するために、30分間インキュベートし、超遠心チューブに1％BSA / PBS溶液36 mlで配置溶液を捨て、次いで空気乾燥さ許します。 注：このチューブはステップ3.6で使用されています。 心はミンチ処理中に解凍することを可能にメスを用いて氷とミンチに10ミリメートル皿に個々の冷凍心を置きます。 50mlの遠心チューブに細胞溶解バッファーの15ミリリットルに刻んだ心を置き、室温で25,000 rpmで15秒間プローブホモジナイザーで均質化します。 遠心チューブに細胞溶解バッファーのさらに15ミリリットルを追加し、大きなクリアランス乳棒で40ミリリットルダウンスに移します。乳棒で10ストロークを実行し、50ミリリットルの遠心分離管に100ミクロンを介して、その後40μmのセルストレーナーをフィルタリングします。 10分aの遠心分離機トン700 4℃でXG、上清を除去します。 ショ糖勾配溶液25mlに核ペレットを再懸濁し、3.1で製造した超遠心管中で新鮮なショ糖勾配溶液10mlの上に溶液を含む細胞核をレイヤー。 スイングアウトチューブローターを用いて4℃で1時間13,000×gで遠心分離します。 遠心分離後、上清を捨て、1.5 mlのマイクロ遠心チューブやラベルPCM1に核蓄積バッファの1300μlの核ペレットを再懸濁します。 新しいマイクロチューブに懸濁液の300μlのを削除し、新たな核格納用バッファの700μlに追加します。 ISOコントロールとしてこのチューブにラベルを付けます。 PCM1ラベルされたマイクロチューブにミリリットル8μgの/の最終濃度で抗PCM1を追加し、ISO制御ラベルされたマイクロチューブに8μgの/ mlの濃度でウサギIgGアイソタイプコントロール抗体を追加します。 4℃で一晩インキュベートします。次のincubエーション、10分間、700×gで遠心分離器は、700×gで10分間、再び新鮮な核格納バッファ、再懸濁と遠心1mlで置き換え、上清を捨てます。上清を捨て、新鮮な核貯蔵緩衝液1mlと交換してください。 2μg/ mlの最終濃度を達成するためのF（ab '）ヤギ抗ウサギIgG（H + L）抗体（FITCまたは同等の緑色蛍光色素）の2断片の1μlを添加します。 注：F（AB '）を使用する2フラグメント抗体は、マクロファージ及びB細胞を含む免疫細胞の非特異的標識の可能性を低下させます。 アルミホイルでラップ管は光から保護し、4℃で1時間インキュベートします。 EDU定款4.検出希薄10xが脱イオン水でEDU反応バッファー1:10に濃縮しました。 遠心機PCM-1およびISO制御標識核懸濁液10分間700×gで、上清を廃棄し、1mlの核ペレットを再懸濁1％BSA / PBS溶液。二回の核ペレットを洗浄します。 最後の洗浄後、上清を破棄し、EDU固定液100μlと交換してください。 光から保護し、室温で15分間インキュベートするアルミホイルでチューブを包みます。 700×gで1％BSA / PBS溶液を、遠心1mlで二回サンプルを洗浄し、室温で15分間、1Xサポニンベースの透過溶液でインキュベートします。 1×EDUのラベリングカクテル（ 表2）を準備します。 2反応を最小にはEDU制御を含まないために必要とされます。 既に1×サポニンベースの透過性溶液100μlに核を含む各サンプルに直接1xのEDUのラベリングカクテルの500μlを添加して、30分間、光から保護し、室温でインキュベートします。 1％BSA / PBSの1ミリリットルで700×gで再懸濁で遠心分離し、このステップをさらに2回繰り返します。 700×gで遠心分離し、上清を破棄し、4と交換DNA染色溶液の00μlの（ 材料の表を参照してください）。 試薬の名前 1.細胞溶解バッファー 0.32 Mスクロース 10mMトリス – 塩酸（pH値= 8） 5 mMのCaCl 2を 5 mMの酢酸マグネシウム 2.0 mMのEDTA 0.5mMのEGTA 1mMのDTT 2.Sucroseグラデーションソリューション 2.1 Mスクロース 10mMトリス – 塩酸（pH値= 8） 5 mMの酢酸マグネシウム 1mMのDTT 3.核蓄積バッファ（NSB） 0.44 Mスクロース 10mMトリス – 塩酸（pH値= 7.2） 70のKCl 10のMgCl 2 1.5ミリモルのスペルミン 表1： 核単離緩衝液成分プロトコルセクション3（核解離と心筋細胞核標識）で使用されるすべてのバッファのためのレシピ。 5.フローサイトメトリー分析注：以前に7,11,15説明したように、単離された核のフローサイトメトリーを実行します。 まず、破片（ 図2A）からの核の識別を可能にするために、前方散乱（FSC）および側方散乱（SSC）を記述するプロットを作成します。 高さ対）4をプロットすることにより、凝集体（ 図2B）から単核を識別するためのプロットを作成'、6-ジアミジノ-2-フェニルインドール（DAPI）エリア（3から405/450/50 A）（33から405/450 / 50-H）。 thaのを確認してくださいトン3から405/50分の450-信号は、DNA含有量の正確な決意を可能にするために、リニアスケールで収集されます。 535分の488/30 A（PCM-1）SSC対を記述したプロットを作成し、一集団中のPCM-1発現を評価するために、5.2で作成した一重ゲートからイベントのみを表示します。 PCM-1陽性ゲート（ 図2C）を確立するために、アイソタイプコントロールサンプルを実行します。 PCM1の少量を実行しPCM1表現する人口とゲート位置を確認するために、サンプルを標識しました。 （DAPIを検出するために）450分の405/50 A対SSC-Aを説明するプロットを作成します。このプロットでは、5.3で作成されたゲートを使用して、核を表現するだけシングレットPCM1を表示します。のみ2N核（ 図2D）が含まれている追加の階層ゲートを作成するには、このプロットを使用してください。 心筋細胞集団を表現するPCM1のEDU標識の同定を可能にするために1から633/20分の660-A対535分の488/30 Aを説明するプロットを作成します。一重である核のみを表示し、P上記のゲーティングを使用して、CM1 +および2N。 EDU正のゲート（ 図2E）を設定していないEDUコントロールから心臓サンプルを実行します。 EDU +細胞のための適切なゲートを作成します。 録音し定量シングレット、EDUが組み込まれているPCM-1を発現する、2N核。 合計一、PCM1 +核の割合として、この人口を計算します。これは、全心筋細胞核の割合として、7日EDUパルス期間中に、ネオ心筋細胞核発生速度を提供します。 注：DAPIがDNAに結合する蛍光強度はDNAの量に比例した化学量論的であるように。以前に7説明したように、450分の405/50信号の強度に基づいて、倍数性を決定します。 総心筋細胞集団内の倍数性を評価するために5.5に設立され、プロットし、DNA濃度7に基づいて、ゲート戦略を使用しています。 /files/ftp_upload/53979/53979fig2.jpg "/> 図2：心筋細胞EDUの取り込みと倍数性を定量化するためのゲーティング戦略 （A）核は前方散乱（FSC）および側方散乱（SSC）に基づいて破片から区別されます。 （B）線形ゲートが作成され、一核集団をDAPI標識と領域信号対405/450/50高さに基づいて特定されます。 （C）蛍光ゲーティングは心臓組織からの心筋細胞の核（PCM-陽性1）と非心筋細胞（PCM-1陰性）核の分離を可能にします。 （D）DAPI信号の強度は、DNA濃度およびPCM1 +心筋細胞集団のそれによって核倍数性を決定するために使用されます。マウスでは>心筋細胞核の80％は、二倍体（2n個）です。 （E）蛍光ゲーティングは2Nを分離することができ、2NからEDU（PCM + / EDU + = 0.9％）に組み込まれている心筋細胞核、EDU（PCM + EDU-）に組み込まれていない心筋。すべてのステップは、プロトコル5.0で詳述されています。 MDXから示す例- 。C57 / BL10の背景に/ A yマウスこの図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。