Экспрессия генов профилирования заражения микробами, использующим платформу цифровой штрих-кодирования
Summary
We developed a protocol that is fast, sensitive and reproducible for pathogen gene expression profiling during an infection.
Abstract
Для большинства возбудителей млекопитающих, экспрессия генов профилирования исследования были ограничены техническими трудностями точно количественно генов патогена стенограммы инфицированных тканей. Возбудитель РНК представляет собой небольшую часть от общего РНК, выделенной из образцов инфицированной ткани. Оба микрочипов и технологии RNAseq есть трудности в создании надежной читает для слабо выраженными генов возбудителя. Мутант штаммы патогенных с ограниченными в естественных условиях распространения представлять еще большую проблему. Здесь мы опишем естественных условиях протокол профилирования экспрессии генов, что очень быстро, чрезвычайно чувствительны и легко воспроизводимым. Мы разработали этот протокол во время нашего расследования грибковых патогенов Albicans Candida в мышиной модели hematogenously диссеминированного кандидоза. Используя этот протокол, мы зафиксировали время курсы динамически регулируется С. экспрессия гена Albicans во время инфекции почек и обнаружили неожиданные особенностиответы экспрессии генов к противогрибковым медикаментозное лечение в естественных условиях.
Introduction
Динамика экспрессии генов имеет жизненно важную информацию о том, как клетка отвечает на изменения окружающей среды. В случае заражения микроба, данных генной экспрессии может обеспечить клинически значимых представление о том, как возбудитель адаптируется к окружающей среде и инфекции приводит к повреждению хозяина. В последние два десятилетия, исследования экспрессии генов как в пробирке и в естественных условиях породили большое количество данных и заложили фундамент для понимания биологии инфекции 1-3. Тем не менее, современные технологии профилирования в том числе микрочипов и RNAseq, не являются оптимальными для профилирования экспрессии генов патогена во время инфекции. Хост РНК представляет собой подавляющую часть (обычно> 99%) от общего РНК, выделенной из образцов инфицированной ткани. Хозяин РНК способствует высоким фоном на микрочипов, и доминирует последовательность читает RNAseq. Выделение возбудителя из клеток инфицированной ткани, в теории, может помочь для обогащения патогена РНК, но она представляет добавлениеаль проблемы: она требует больших количеств инфицированной ткани; процедура может быть утомительным; и, самое главное, трудно сохранить естественное состояние или целостность РНК в ходе длительного процесса. Для того, чтобы генерировать более полных и точных данных на экспрессию генов возбудителя во время реальных инфекций, мы приступаем к разработке протокола, что позволяет надежную и экономичную количественное меньшинство РНК видов в смешанной популяции РНК.
NanoString nCounter является недавно разработанный платформа, оказывает непосредственное измерение мультиплексированный экспрессии генов с использованием цифровых пар датчиков штрих-кодом 4, 5. Эта платформа имеет уровень чувствительности, сравнимой с QRT-PCR, но не требует последующей энзиматической амплификацией. Технология не генома, что позволяет обнаруживать до 800 различных генов в каждом анализе. Поэтому, очень важно, чтобы выбрать информативные гены в качестве зондов для профилирования. Здесь мы используем выражение профилирования генной исследование крупного гулпатоген, Candida Albicans, во время инвазивной инфекции в качестве примера, чтобы продемонстрировать: 1) Технические данные экспериментальных процедур (протоколов), 2) чувствительность, воспроизводимость и динамический диапазон этого метода (представительные результаты), и 3) Важно соображения для проектирования и выполнения экспериментов, основанных на этом протоколе (обсуждение). Этот протокол может быть легко адаптирован для различных патогенов и была успешно применена в ряде моделей инфекции 6-9.
Protocol
Representative Results
Discussion
Этот протокол разработан с целью оптимизации транскрипции профилирование заражения микробами, используя платформу nanoString nCounter. Вся процедура, от сбора ткани к данным экспрессии, требует меньше 48 ч. Руки-на время составляет около 4 ч в течение 12 образцов. Одним из ключевых переменных в этом протоколе является количество буферной RLT добавлен в ткани на первом этапе. Слишком много буфер разбавить гомогената и привести к снижению концентрации РНК, в то время как слишком мало буфер может привести к образованию вязкого геля после стадии экстракции фенола хлороформа и не оставляют водную фазу для восстановления РНК. Эмпирически определены оптимальные объемы буферной RLT для тканей мыши (при условии типичных размеров) являются: почки (1,2 мл), язык (1,0 мл) и легких (2,0 мл). Для патогенных микроорганизмов, особенно это, выращенных в нитчатых форме, шаг шарик избиение помогает вскрывать толстый клеточной стенки, чтобы полностью освободить клеточное содержимое. В стадии элюирования, для того, чтобы повысить конечный РНКконцентрация, первый раунд элюат может быть добавлен обратно в колонну и элюируют второй раз. Приблизительно 100 мкг общей РНК ткани могут быть восстановлены из одного столбца RNeasy спина (~ 2 мкг / мкл × 50 мкл). Если большее количество РНК необходимо, второй Prep могут быть сделаны из оставшегося гомогената ткани. Не выбрасывайте оставшиеся гомогената до концентрации РНК не была измерена, на всякий случай.
В зависимости от модели инфекции, размер инокулята и штамм патогена, процент патогенов РНК в тотальной РНК ткани составляет от 0% -2%, и, как правило находится в пределах 0,05% -0,5% диапазона. Например, 10 мкг общей РНК из тканей C. Albicans инфицированных почек может генерировать сырые рассчитывает, что равные 10 нг чистой C. Albicans РНК из культуры в пробирке (10 нг / мкг = 10% 0,1). Поскольку процент патогенов РНК в тотальной РНК ткани колеблется в широком диапазоне, трудно знать количество pathogeп РНК в заданном количестве общей РНК. Чтобы избежать ненужной траты кодировки (250 х 192 генов реакций, стоимость реакции составляет около 200 $) на образцах с патогеном РНК ниже уровня определения, стадия контроля качества РНК может быть проведена для определения уровня возбудитель РНК в каждом образце. Это может быть сделано либо Q-RTPCR или небольшой кодировки, содержащей несколько генов домашнего хозяйства.
Нормализация с помощью генов патогенных является важным шагом перед профилей экспрессии можно сравнить между различными образцами. Существуют три основных метода нормализации. 1. Используйте суммарного количества из всех генов в кодировки. 2. Используйте один или несколько '' уборка гены. 3. Используйте среднее геометрическое (N-й корень из произведения N чисел) высоко выраженных генов. Для большого кодировки (> 100 генов), содержащий случайно выбранных зондов, с помощью всего рассчитывает на нормализацию может быть хороший выбор, потому что всего на счету большого числа не связанных между собой генов может религиозныхв полной мере отражает количество входных РНК. За небольшую кодировки (<100 генов), содержащие зонды, ориентированные на конкретного процесса (например, рост гиф, учитывая, что гены роста гиф, как правило, совместно регулируется), выбрав один или несколько генов домашнего хозяйства, как управление для нормализации является существенным. TDH3, А энергично выразил метаболический ген, служил также контроль за многих экспериментах. Третий способ представляет собой гибрид метода 1 и 2, с акцентом на равного вклада от высокой экспрессией генов.
Хотя платформа nCounter не генома, что позволяет количественно оценить уровень экспрессии до 800 генов в одном анализе. Поэтому, выбирая наиболее информативные гены анализировать имеет решающее значение для успеха профилирования. Два подхода для выбора для зондов были использованы. Первый подход "знание, основанное". Информация из опубликованных выражения и функциональных данных составляется на экран для генов, которые имеют потенциальный интерес для токаучиться, таких как гены экологических реагирования 6-9. Такой подход позволяет легко сравнить в естественных условиях данные профилирования на многих существующих наборов данных, следовательно, обеспечивая контекст для интерпретации данных. Второй подход «разведка на основе". Категория генов в геноме микробной, например, всех генов, определяющих транскрипционные факторы, киназы или протеины клеточной оболочки, которые выбраны для зондов. Этот подход позволяет выявить новых факторов вирулентности и открытия новых нормативных отношений, основанных на в естественных условиях профилирования данных 6.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была частично поддержана NIH R21 грантов DE023311 (АРМ), R56 AI111836 (APM & SGF), R01 AI054928 (SGF), и R01 DE017088 (SGF).
Materials
| gentleMACS Dissociator | Miltenyl Biotec | 130-093-235 | |
| gentelMACS M tube | Miltenyl Biotec | 130-093-236 | |
| RNeasy Mini Kit | QIAGEN | 74104 | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma | M-3148 | |
| Phenol:ChCl3:IAA | Sigma | P-2069 | |
| Zirconia beads | Biospec Products | 11079110zx | |
| Mini-Beadbeater-16 | Biospec Products | 607 | |
| nCounter Analysis system | nanoString Technologies | ||
| nCounter Gene Expression Codesets | nanoString Technologies | ||
| nSolver Analysis tool | nanoString Technologies |
References
- Cairns, T., Minuzzi, F., Bignell, E. The host-infecting fungal transcriptome. FEMS Microbiol Lett. 307 (1), 1-11 (2010).
- Westermann, A. J., Gorski, S. A., Vogel, J. Dual RNA-seq of pathogen and host. Nat Rev Microbiol. 10 (9), 618-630 (2012).
- Creecy, J. P., Conway, T. Quantitative bacterial transcriptomics with RNA-seq. Curr Opin Microbiol. 23C, 133-140 (2015).
- Geiss, G. K., et al. Direct multiplexed measurement of gene expression with color-coded probe pairs. Nat Biotechnol. 26 (3), 317-325 (2008).
- Malkov, V. A., et al. Multiplexed measurements of gene signatures in different analytes using the Nanostring nCounter Assay System. BMC Res Notes. 2, 80 (2009).
- Xu, W., et al. Activation and Alliance of Regulatory Pathways in C. albicans during Mammalian Infection. PLoS Biology. 13, e1002076 (2015).
- O’Meara, T. R., et al. The Cryptococcus neoformans Rim101 Transcription Factor Directly Regulates Genes Required for Adaptation to the Host. Mol Cell Biol. 34 (4), 673-684 (2014).
- Cheng, S., et al. Profiling of Candida albicans Gene Expression During Intra-Abdominal Candidiasis Identifies Biologic Processes Involved in Pathogenesis. J Infect Dis. 208 (9), 1529-1537 (2013).
- Fanning, S., et al. Divergent Targets of Candida albicans Biofilm Regulator Bcr1 in Vitro and In Vivo. Eukaryot Cell. 11 (7), 896-904 (2012).
- Saeed, A. I., et al. TM4: a free, open-source system for microarray data management and analysis. Biotechniques. 34 (2), 374-378 (2003).
