Gene Expression Profiling von Infecting Mikroben Mit einem Digital-Strichcode-Plattform
Summary
We developed a protocol that is fast, sensitive and reproducible for pathogen gene expression profiling during an infection.
Abstract
Bei den meisten Säugetieren Erreger haben Genexpressionsstudien durch technische Schwierigkeiten begrenzt worden, um genau zu quantifizieren Erreger Gentranskripten aus infizierten Geweben. Pathogen-RNA bildet einen kleinen Teil der Gesamt-RNA aus infizierten Gewebeproben isoliert. Beide Mikroarray und RNAseq Technologien haben Schwierigkeiten bei der Erzeugung zuverlässiger liest für schwach ausgeprägt Erreger Gene. Mutant Erregerstämme mit reduzierten in vivo-Proliferation stellen eine noch größere Herausforderung. Hier beschreiben wir ein in vivo Genexpressions Protokoll, das sehr schnelle, hochempfindliche und sehr gut reproduzierbar ist. Wir dieses Protokoll entwickelt, während unserer Untersuchung der pilzlichen Pathogens Candida albicans in einem Mausmodell der hämatogen disseminierte Candidiasis. Mit diesem Protokoll haben wir Zeitverläufe der dynamisch geregelten C. dokumentiert albicans Genexpression während der Nieren-Infektion, und entdeckte unerwartete MerkmaleGenexpression Antworten auf medikamentöse Behandlung in vivo Antimykotika.
Introduction
Genexpression Dynamik hält wichtige Informationen darüber, wie eine Zelle auf Umweltveränderungen reagiert. Im Fall eines infizierenden Mikroben könnte Genexpressionsdaten klinisch relevanten Erkenntnisse darüber, wie ein Pathogen passt sich der Infektion Umwelt und verursacht Schäden an den Host liefern. In den vergangenen zwei Jahrzehnten haben Genexpressionsstudien in vitro und in vivo große Menge von Daten erzeugt und legte eine Grundlage für das Verständnis der Infektionsbiologie 1-3. Doch aktuelle Profilierung Technologien wie Mikroarrays und RNAseq, sind nicht optimal für die Profilierung des Erregers Genexpression während der Infektion. Wirts-RNA stellt eine überwiegende Teil (in der Regel> 99%) der Gesamt-RNA aus infizierten Gewebeproben isoliert. Der Host-RNA trägt zu hohen Hintergrund auf Mikroarrays, und dominiert Folge liest aus RNAseq. Pathogen Zellisolierung aus infiziertem Gewebe, in der Theorie, kann dazu beitragen, für die Pathogen-RNA zu bereichern, aber es stellt sich zusätzlichal-Probleme: es große Mengen von infiziertem Gewebe erfordert; das Verfahren kann langwierig sein; und was am wichtigsten ist, ist es schwierig, den nativen Zustand oder Integrität der RNA während der langwierigen Prozess zu sparen. Um umfassendere und genaue Daten über Krankheitserreger Genexpression während der reale Infektionen erzeugen, machten wir uns auf ein Protokoll, zuverlässige und kosteneffektive Quantifizierung von Minderheits RNA-Spezies in einer gemischten RNA-Population ermöglicht zu entwickeln.
Nano nCounter ist eine kürzlich entwickelte Plattform, die eine direkte Messung von gemultiplexten Genexpression macht Verwendung digitaler barcodierten Sondenpaare 4, 5. Diese Plattform hat eine Empfindlichkeit vergleichbar mit der qRT-PCR, aber nicht enzymatische Amplifikation erforderlich. Die Technologie nicht genomweite es Detektion von bis zu 800 verschiedene Gene in jedem Assay ermöglicht. Daher ist es entscheidend, informativen Genen als Sonden für die Profilierung aus. Hier verwenden wir Genexpressionsstudie einer großen humein Pathogen Candida albicans, während eine invasive Infektion als ein Beispiel, um zu zeigen: 1) Technische Einzelheiten der experimentellen Verfahren (Protokoll), 2) die Empfindlichkeit, Reproduzierbarkeit und der dynamische Bereich dieser Methode (repräsentative Ergebnisse) und 3) Wichtig Überlegungen für die Gestaltung und Durchführung von Experimenten auf der Grundlage dieses Protokolls (Diskussion). Dieses Protokoll kann leicht für verschiedene Krankheitserreger angepasst werden und wurde erfolgreich in einer Reihe von Infektionsmodellen 6-9 angewendet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieses Protokoll wurde entwickelt, um Transkriptionsprofilierung infizieren Mikroben mit einem nano nCounter Plattform zu optimieren. Das gesamte Verfahren, vom Gewebesammel um Expressionsdaten, benötigt weniger als 48 Stunden. Die Hands-on-Zeit beträgt etwa 4 Stunden für 12 Proben. Eine Schlüsselvariable in diesem Protokoll ist die Menge an Puffer RLT auf das Gewebe bei der ersten Stufe zugegeben. Zu viel Puffer das Homogenat zu verdünnen und zu einer RNA-Konzentration zu senken, während zu wenig Puffer kann zur Bildung von viskosen Gele nach dem Phenol-Chloroform-Extraktionsschritt zu führen und keinen Wasserphase für die RNA-Wiederherstellung. Die empirisch ermittelt optimale Volumen Puffer RLT für Mausgeweben (vorausgesetzt typischen Größen) sind: Nieren (1,2 ml), die Zunge (1,0 ml) und Lungenkrebs (2,0 ml). Für mikrobielle Krankheitserreger, vor allem in Fadenform davon gewachsen, der Wulst-zu schlagen Schritt hilft, offene dicke Zellwand zu brechen, um Zellinhalt vollständig freizugeben. In der Elutionsschritt, um die endgültige RNA zu erhöhenKonzentration kann die erste Runde Eluates wieder auf die Säule gegeben werden und ein zweites Mal eluiert. Etwa 100 ug Gesamt-RNA Gewebe kann von einem RNeasy Spinsäule (~ 2 ug / ul x 50 & mgr; l) wiederhergestellt werden. Wenn größere Menge an RNA benötigt wird, kann eine zweite prep vom verbleibenden Gewebehomogenat erfolgen. Haben der verbleibenden Homogenat nicht weg, bis RNA-Konzentration gemessen wurde, nur für den Fall.
Je nach Infektionsmodell, das Inokulum Größe und der Erreger-Stamm, der Anteil der Pathogen-RNA insgesamt Gewebe RNA im Bereich von 0% bis 2%, und fällt in den 0,05% -0,5% Reichweite in der Regel. Beispielsweise 10 ug Gesamt-RNA aus Gewebe C. albicans infiziert Nieren könnten rohes zählt gleich derjenigen der 10 ng reiner C erzeugen albicans RNA aus einer in vitro-Kultur (10 ng / 10 & mgr; = 0,1%). Weil der Anteil der Pathogen-RNA insgesamt Gewebe RNA variiert in einem weiten Bereich, ist es schwierig, die Menge des pathoge wissenn -RNA in einer gegebenen Menge an Gesamt-RNA. Um Verschwendung zu vermeiden Codesatz (für 250 Gene x 192 Reaktionen, die Kosten pro Reaktion liegt bei etwa $ 200) an Proben mit Pathogen-RNA unter der Nachweisgrenze kann ein RNA Qualitätskontrollschritt durchgeführt, um den Erreger RNA-Ebene in jeder Probe zu bestimmen. Dies kann entweder durch Q-RTPCR oder eine kleine Codesatz mit ein paar Haushaltsgenen durchgeführt werden.
Die Normalisierung mit pathogen-Gene ist ein kritischer Schritt, bevor die Expressionsprofile können unter den verschiedenen Proben verglichen werden. Es gibt drei allgemein verwendeten Verfahren zur Normalisierung. 1. Verwenden Sie die Gesamtaktivität von allen Genen im Codesatz. 2. Verwenden Sie eine oder wenige "Housekeeping" Genen. 3. Mit dem geometrischen Mittelwert (N-te Wurzel des Produkts der Anzahl N) von hoch exprimierten Genen. Für eine große Codesatz (> 100 Genen), die nach dem Zufallsprinzip ausgewählten Sonden unter Verwendung von Gesamtaktivität für die Normierung kann eine gute Wahl sein, weil die Gesamtaktivität von einer großen Anzahl von nicht verwandten Gene Glaubevollständig widerspiegeln die Menge an RNA-Eingang. Für ein kleines codeset (<100 Gene) enthalten Sonden, die auf einen bestimmten Prozess konzentriert (wie Hyphenwachstum, da Hyphenwachstums Genen zusammen reguliert werden tendieren), die Auswahl einer oder wenigen Haushaltsgenen als Kontrolle zur Normalisierung ist wesentlich. TDH3 ein robust ausgedrückt Stoffwechselgens hat auch die Kontrolle für viele Experimente serviert. Das dritte Verfahren ist ein Hybrid aus Verfahren 1 und 2, mit einem Schwerpunkt für gleiche Beitrag hoch exprimierten Genen.
Obwohl die nCounter Plattform nicht genomweiten ermöglicht sie die Quantifizierung der Expressionsniveau für bis zu 800 Gene in einem einzigen Assay. Deshalb ist die Wahl der informativsten Gene zu analysieren, ist entscheidend für den Erfolg der Profilierung. Zwei Ansätze für Sonden ausgewählt wurden verwendet. Der erste Ansatz ist "Kenntnisse". Informationen aus veröffentlichten Expression und funktionelle Daten an Bildschirm nach Genen, die von potenziellem Interesse an den aktuellen zusammengestelltzu untersuchen, wie die Umweltantwortgene 6-9. Dieser Ansatz ermöglicht den einfachen Vergleich von in-vivo-Profiling-Daten in viele bestehende Datensätze, also die Bereitstellung Zusammenhang auf die Interpretation der Daten. Der zweite Ansatz ist "Exploration basiert". Eine Kategorie von Genen im Genom eines Mikroorganismus, wie beispielsweise alle Gene spezifiziert Transkriptionsfaktoren, Kinasen oder Zellwand-Proteine für Sonden ausgewählt. Dieser Ansatz ermöglicht die Identifizierung neuer Virulenzfaktoren und Identifizierung neuartiger Regulierungs Beziehungen auf der Grundlage der in vivo Profildaten 6.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde teilweise durch Zuschüsse NIH R21 DE023311 (APM), R56 AI111836 (APM & SGF), R01 AI054928 (SGF) und R01 DE017088 (SGF) unterstützt.
Materials
| gentleMACS Dissociator | Miltenyl Biotec | 130-093-235 | |
| gentelMACS M tube | Miltenyl Biotec | 130-093-236 | |
| RNeasy Mini Kit | QIAGEN | 74104 | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma | M-3148 | |
| Phenol:ChCl3:IAA | Sigma | P-2069 | |
| Zirconia beads | Biospec Products | 11079110zx | |
| Mini-Beadbeater-16 | Biospec Products | 607 | |
| nCounter Analysis system | nanoString Technologies | ||
| nCounter Gene Expression Codesets | nanoString Technologies | ||
| nSolver Analysis tool | nanoString Technologies |
References
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