Profili di espressione genica di microbi che infettano utilizzare una piattaforma digitale di codificazione
Summary
We developed a protocol that is fast, sensitive and reproducible for pathogen gene expression profiling during an infection.
Abstract
Per la maggior parte dei patogeni mammiferi, profili di espressione genica studi sono stati limitati da difficoltà tecniche per quantificare con precisione trascrizioni gene patogeno da tessuti infetti. Patogeni RNA costituisce una piccola parte del RNA totale isolato da campioni di tessuto infetto. Sia microarray e tecnologie RNAseq hanno difficoltà nel generare affidabile legge per i geni patogeni debolmente espressi. Ceppi patogeni mutanti con ridotta proliferazione in vivo rappresentano una sfida ancora più grande. Qui si descrive un vivo dell'espressione genica protocollo profiling in quanto è molto veloce, estremamente sensibile e altamente riproducibile. Abbiamo sviluppato questo protocollo durante la nostra indagine sui funghi patogeni albicans Candida in un modello murino di candidosi disseminata ematogena. Usando questo protocollo, abbiamo documentato andamento nel tempo della C. regolata dinamicamente espressione genica albicans durante l'infezione ai reni, e caratteristiche inaspettate scoperte dirisposte di espressione genica per antimicotico trattamento farmacologico in vivo.
Introduction
Le dinamiche di espressione genica detiene informazioni vitali su come una cellula risponde ai cambiamenti ambientali. Nel caso di un microrganismo infettante, dati di espressione genica potrebbero fornire approfondimenti clinicamente rilevanti su come un agente patogeno si adatta all'ambiente infezione e provoca danni all'ospite. Negli ultimi due decenni, gli studi di espressione genica sia in vitro che in vivo hanno generato grande quantità di dati e gettato le basi per la comprensione della biologia infezione 1-3. Tuttavia, le tecnologie di profilazione attuali, compresa microarray e RNAseq, non sono ottimali per la profilazione dell'espressione genica patogeno durante l'infezione. Host RNA costituisce una porzione schiacciante (di solito> 99%) del RNA totale isolato da campioni di tessuto infetto. L'RNA ospite contribuisce ad alto background su microarray, e domina la sequenza legge da RNAseq. Isolamento cellulare patogeno dal tessuto infetto, in teoria, può contribuire ad arricchire per l'RNA patogeni, ma pone aggiuntaAl problemi: richiede grandi quantità di tessuti infetti; la procedura può essere noioso; e, soprattutto, è difficile conservare allo stato nativo o integrità dell'RNA durante il processo lungo. Al fine di generare dati più completi e precisi sull'espressione genica patogeni durante le infezioni reali, abbiamo deciso di sviluppare un protocollo che consente una quantificazione affidabile e conveniente delle specie di RNA di minoranza in una popolazione mista di RNA.
NanoString nCounter è una piattaforma recentemente sviluppato che rende la misurazione diretta multiplexed dell'espressione genica mediante coppie di sonde con codici a barre digitali 4, 5. Questa piattaforma ha un livello di sensibilità paragonabile a quella di QRT-PCR, ma non necessita di amplificazione enzimatica. La tecnologia non è Genome-wide, permette il rilevamento di fino a 800 geni differenti in ogni test. Pertanto, è fondamentale per selezionare geni informativi come sonde per profilatura. Qui usiamo profilo di espressione genica studio di un grande ronzioun patogeno, Candida albicans, durante un'infezione invasiva come esempio, per dimostrare: 1) dettagli tecnici delle procedure sperimentali (protocollo), 2) La sensibilità, riproducibilità e la gamma dinamica di questo metodo (risultati rappresentativi), e 3) Importante Considerazioni per la progettazione e l'esecuzione di esperimenti basati su questo protocollo (discussione). Questo protocollo può essere facilmente adattato per vari patogeni ed è stato applicato con successo in un certo numero di modelli di infezione 6-9.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo protocollo è stato sviluppato per ottimizzare il profilo trascrizionale di infettare microbi utilizzando una piattaforma nanoString nCounter. L'intera procedura, dalla raccolta di tessuto a dati di espressione, richiede meno di 48 ore. I hands-on tempo è di circa 4 h per 12 campioni. Una variabile fondamentale in questo protocollo è la quantità di tampone RLT aggiunto al tessuto al primo passo. Troppo buffer diluire l'omogeneizzato e portare ad abbassare la concentrazione di RNA, mentre troppo poco buffer può portare alla formazione di gel viscoso dopo la fase di estrazione del fenolo cloroformio e non lasciano fase acquosa per il recupero dell'RNA. I volumi ottimali empiricamente determinato di tampone RLT per tessuti di topo (assumendo dimensioni tipiche) sono: rene (1,2 ml), lingua (1,0 ml) e del polmone (2,0 ml). Per patogeni microbici, particolarmente questi coltivate in forma filamentosa, il passo tallone battendo aiuta a rompere parete cellulare spessa per far uscire completamente contenuto cellulare. Nella fase di eluizione, al fine di aumentare l'RNA finalela concentrazione, il primo eluato turno può essere aggiunto di nuovo alla colonna, ed eluire una seconda volta. Circa 100 mg di RNA totale del tessuto possono essere recuperati da una colonna RNeasy rotazione (~ 2 mg / mL x 50 ml). Se è necessaria maggiore quantità di RNA, un secondo preparazione può essere effettuata dal restante omogenato tissutale. Non smaltire dell'omogenato rimanente fino è stata misurata la concentrazione di RNA, per ogni evenienza.
A seconda del modello di infezione, le dimensioni dell'inoculo e il ceppo patogeno, la percentuale di patogeno RNA in RNA totale del tessuto varia da 0% -2%, e tipicamente rientra nella gamma 0,05% -0,5%. Ad esempio, 10 mg di RNA totale da tessuti C. albicans infettato rene potrebbe generare conteggi pari a quello di 10 ng di puro C. albicans RNA da una coltura in vitro (10 ng / mg 10 = 0,1%). Poiché la percentuale di patogeno RNA in RNA tissutale totale varia in un ampio intervallo, è difficile conoscere la quantità di pathogen RNA in una data quantità di RNA totale. Per evitare sprechi codeset (per 250 geni x 192 reazioni, il costo per reazione è di circa $ 200) su campioni con patogeno RNA al di sotto del livello di rilevamento, un passo di controllo di qualità dell'RNA può essere eseguita per determinare il livello patogeno RNA in ciascun campione. Questo può essere fatto o Q-rtPCR o un piccolo codeset contenente alcuni geni housekeeping.
Normalizzazione usando geni patogeni è un passaggio fondamentale prima che i profili di espressione può essere paragonato tra diversi campioni. Ci sono tre metodi comunemente usati per la normalizzazione. 1. Utilizzare i conteggi totali di tutti i geni nel codeset. 2. Utilizzare uno o pochi geni "housekeeping". 3. Utilizzare la media geometrica (N esima del prodotto di N numeri) di geni altamente espressi. Per una grande codeset (> 100 geni) contenente sonde selezionati casualmente, utilizzando conteggi totali per la normalizzazione può essere una buona scelta, perché i conteggi totali di un gran numero di geni indipendenti possono fedecorrispondere alla quantità di input RNA. Per un piccolo set di codici (geni) <100 contenenti sonde focalizzate su uno specifico processo (come la crescita ifale, dato che i geni di crescita ifale tendono ad essere co-regolata), la scelta di uno o pochi geni housekeeping come controllo per la normalizzazione è essenziale. TDH3, un gene metabolico robusta espresso, ha servito bene come controllo per molti esperimenti. Il terzo metodo è un ibrido del metodo 1 e 2, con particolare attenzione per la parità contributo geni altamente espressi.
Anche se la piattaforma non è nCounter genome wide-, permette la quantificazione del livello di espressione per un massimo di 800 geni in un singolo test. Pertanto, scegliendo i geni più informativi da analizzare è fondamentale per il successo della profilatura. Sono stati utilizzati due approcci per selezionare per le sonde. Il primo approccio è "basata sulla conoscenza". Informazioni dall'espressione pubblicata e sui dati funzionale è compilato allo schermo per i geni che sono di potenziale interesse per la correntestudiare, come i geni di risposta ambientali 6-9. Questo approccio consente un facile confronto di dati in vivo profilatura a molti set di dati già esistenti, fornendo in tal modo contesto l'interpretazione dei dati. Il secondo approccio è "esplorazione based". Una categoria di geni in un genoma microbo, come tutti i geni che specificano i fattori di trascrizione, chinasi o proteine della parete cellulare sono scelti per le sonde. Questo approccio permette di identificare nuovi fattori di virulenza e di scoperta di nuovi rapporti normativi basati sulla profilazione dei dati in vivo 6.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto in parte da sovvenzioni NIH R21 DE023311 (APM), R56 AI111836 (APM & SGF), R01 AI054928 (SGF) e R01 DE017088 (SGF).
Materials
| gentleMACS Dissociator | Miltenyl Biotec | 130-093-235 | |
| gentelMACS M tube | Miltenyl Biotec | 130-093-236 | |
| RNeasy Mini Kit | QIAGEN | 74104 | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma | M-3148 | |
| Phenol:ChCl3:IAA | Sigma | P-2069 | |
| Zirconia beads | Biospec Products | 11079110zx | |
| Mini-Beadbeater-16 | Biospec Products | 607 | |
| nCounter Analysis system | nanoString Technologies | ||
| nCounter Gene Expression Codesets | nanoString Technologies | ||
| nSolver Analysis tool | nanoString Technologies |
References
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