Profil d'expression génique de microbes infectant utilisant une plateforme numérique de codage de bar
Summary
We developed a protocol that is fast, sensitive and reproducible for pathogen gene expression profiling during an infection.
Abstract
Pour la plupart des agents pathogènes de mammifères, profils d'expression génique études ont été limitées par des difficultés techniques de quantifier avec précision transcrits du gène pathogène à partir de tissus infectés. ARN pathogène constitue une infime partie de l'ARN total isolé à partir d'échantillons de tissus infectés. Les deux microréseaux et technologies RNAseq ont des difficultés à générer lit fiable pour les gènes pathogènes faiblement exprimés. Souches pathogènes mutants avec réduite dans la prolifération in vivo posent un défi encore plus grand. Nous décrivons ici une vivo l'expression du gène de protocole en ce que le profilage est très rapide, très sensible et hautement reproductible. Nous avons développé ce protocole au cours de notre enquête sur les champignons Candida albicans pathogène dans un modèle murin de candidose disséminée hématogène. En utilisant ce protocole, nous avons documenté les temps de régulée dynamiquement C. l'expression du gène albicans lors d'une infection rénale, et caractéristiques inattendues de découvertesRéponses d'expression de gène antifongique à un traitement médicamenteux in vivo.
Introduction
La dynamique d'expression génique est l'information essentielle sur la façon dont une cellule réagit aux changements environnementaux. Dans le cas d'un microbe infectant, les données d'expression génique pourraient fournir des indications sur la façon cliniquement pertinentes d'un agent pathogène adapte à l'environnement de l'infection et provoque des dommages à l'hôte. Dans les deux dernières décennies, les études d'expression du gène à la fois in vitro et in vivo ont généré grande quantité de données et jeté une base pour la compréhension de biologie de l'infection 1-3. Cependant, les technologies de profilage actuelles, y compris microarray et RNAseq, ne sont pas optimales pour le profilage de l'expression génique des agents pathogènes pendant l'infection. Hôte ARN constitue une portion écrasante (généralement> 99%) de l'ARN total isolé à partir des échantillons de tissus infectés. L'ARN hôte contribue à fond élevé sur les microréseaux, et domine séquence lit à partir RNAseq. L'isolement cellulaire des pathogènes à partir de tissus infectés, en théorie, peut contribuer à enrichir de l'ARN de l'agent pathogène, mais il pose plusproblèmes al: il nécessite de grandes quantités de tissus infectés; la procédure peut être fastidieux; et surtout, il est difficile de conserver l'état ou l'intégrité de l'ARN natif pendant le long processus. Afin de générer des données plus complètes et précises sur l'expression des gènes des pathogènes durant infections réelles, nous avons décidé de développer un protocole qui permet une quantification fiable et rentable d'espèces d'ARN minoritaire dans une population d'ARN mixte.
NanoString nCounter est une plate-forme élaborée récemment, qui rend la mesure multiplexée directe de l'expression des gènes en utilisant des paires de sondes de codes-barres numériques 4, 5. Cette plate-forme a un niveau comparable à celui de QRT-PCR sensibilité, mais ne nécessite pas d'amplification enzymatique. La technologie est pas l'échelle du génome, il permet de détecter jusqu'à 800 gènes différents dans chaque essai. Par conséquent, il est essentiel de sélectionner les gènes informatifs en tant que sondes pour le profilage. Ici, nous utilisons l'expression du gène de profilage étude d'un ronflement importantun agent pathogène, Candida albicans, lors d'une infection invasive à titre d'exemple, pour démontrer: 1) les détails techniques des procédures expérimentales (protocole), 2) La sensibilité, la reproductibilité et la gamme dynamique de cette méthode (résultats représentatifs), et 3) Important considérations pour la conception et la réalisation d'expériences basées sur ce protocole (de discussion). Ce protocole peut être facilement adapté pour divers agents pathogènes et a été appliquée avec succès dans un certain nombre de modèles d'infection 6-9.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ce protocole est développé pour optimiser profilage transcriptionnel d'infecter les microbes en utilisant une plate-forme nanoString nCounter. L'ensemble de la procédure, de la collection de tissus à des données d'expression, exige moins de 48 heures. Les mains sur le temps est environ 4 h pour 12 échantillons. Une variable clé dans ce protocole est la quantité de RLT tampon ajoutée au tissu à la toute première étape. Trop de tampon va diluer l'homogénat et conduire à abaisser la concentration d'ARN, tandis que trop peu de tampon peut conduire à la formation de gels visqueux après l'étape d'extraction au phénol chloroforme et de ne pas laisser de phase aqueuse pour la récupération de l'ARN. Les volumes déterminés empiriquement optimales de tampon RLT pour des tissus de souris (en supposant tailles typiques) sont les suivants: rein (1,2 ml), de la langue (1,0 ml) et du poumon (2,0 ml). Pour les agents pathogènes microbiens, en particulier ces cultivées en forme filamenteuse, l'étape de perles battant contribue à briser le mur de la cellule ouverte épais pour libérer entièrement contenu cellulaire. Dans l'étape d'élution, en vue d'accroître l'ARN finaleconcentration, le premier éluat ronde peut être ajouté à la colonne, et élue une deuxième fois. Environ 100 pg d'ARN total de tissu peut être récupéré d'une colonne de spin RNeasy (~ 2 pg / pl x 50 pi). Si plus grande quantité de l'ARN est nécessaire, une seconde préparation peut être faite à partir de l'homogénat de tissu restant. Ne jetez pas de l'homogénat restant jusqu'à la concentration d'ARN a été mesurée, juste au cas où.
Selon le modèle d'infection, la taille de l'inoculum et la souche pathogène, le pourcentage de l'ARN de l'agent pathogène dans l'ARN tissulaire totale varie de 0% -2%, et typiquement relève de la gamme de 0,05% -0,5%. Par exemple, 10 ug d'ARN total de tissus de C. albicans infecté rein pourrait générer des chiffres bruts égal à celui de 10 ng de pur C. albicans à partir de l'ARN in vitro d'une culture (10 ng / 10 ug = 0,1%). Parce que le pourcentage de l'ARN de l'agent pathogène dans l'ARN du tissu total varie dans une large gamme, il est difficile de connaître la quantité de pathogen ARN dans une quantité donnée de l'ARN total. Pour éviter de perdre le jeu de codes (pour 250 gènes x 192 réactions, le coût par réaction est d'environ 200 $) sur des échantillons d'ARN de l'agent pathogène en dessous du niveau de détection, une étape de contrôle de la qualité de l'ARN peut être effectuée pour déterminer le niveau de l'ARN de l'agent pathogène à l'intérieur de chaque échantillon. Cela peut être fait soit par Q-RT-PCR ou un petit jeu de codes contenant quelques gènes de ménage.
La normalisation en utilisant des gènes pathogènes est une étape critique avant les profils d'expression peuvent être comparées entre différents échantillons. Il existe trois méthodes couramment utilisées pour la normalisation. 1. Utiliser des chiffres totaux de tous les gènes dans le jeu de codes. 2. Utilisez un ou quelques gènes «ménagers». 3. Utilisation de la moyenne géométrique (N ième racine du produit des nombres N) de gènes fortement exprimés. Pour un grand jeu de codes (> 100 gènes) contenant des sondes choisies au hasard, en utilisant le compte total pour la normalisation peut être un bon choix, parce que les nombres totaux d'un grand nombre de gènes indépendants peuvent foirefléter pleinement le montant de l'entrée de l'ARN. Pour un petit jeu de codes (<100 gènes) contenant des sondes ont porté sur un processus spécifique (tels que la croissance des hyphes, étant donné que les gènes de croissance des hyphes ont tendance à être co-réglementé), choisissant l'un ou quelques gènes de ménage que le contrôle de la normalisation est essentielle. TDH3, un gène métabolique vigoureusement exprimé, a bien servi en tant que témoin pour de nombreuses expériences. La troisième méthode est un hybride de la méthode 1 et 2, avec un accent pour sa contribution égale de gènes fortement exprimés.
Bien que la plate-forme nCounter est pas l'échelle du génome, il permet de quantifier le niveau d'expression jusqu'à 800 gènes dans un seul essai. Par conséquent, le choix des gènes les plus informatives à analyser est essentiel pour le succès du profilage. Deux approches pour sélectionner pour les sondes ont été utilisées. La première approche est "fondée sur la connaissance". Informations expression données publiées et fonctionnelle est compilé à l'écran pour les gènes qui sont d'un intérêt potentiel pour le courantétudier, tels que les gènes de la réponse de l'environnement 6-9. Cette approche permet de comparer facilement les données de profilage in vivo à de nombreux jeux de données existants, donc fournir un contexte pour l'interprétation des données. La seconde approche est "exploration basée". Une catégorie de gènes dans un génome de microbes, tels que les gènes spécifiant des facteurs de transcription, des kinases ou des protéines de la paroi cellulaire sont choisis pour les sondes. Cette approche permet l'identification de nouveaux facteurs de virulence et la découverte de nouvelles relations de régulation basés sur le profilage des données in vivo 6.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été financé en partie par des subventions des NIH R21 DE023311 (APM), R56 AI111836 (APM & SGF), R01 AI054928 (SGF), et R01 DE017088 (SGF).
Materials
| gentleMACS Dissociator | Miltenyl Biotec | 130-093-235 | |
| gentelMACS M tube | Miltenyl Biotec | 130-093-236 | |
| RNeasy Mini Kit | QIAGEN | 74104 | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma | M-3148 | |
| Phenol:ChCl3:IAA | Sigma | P-2069 | |
| Zirconia beads | Biospec Products | 11079110zx | |
| Mini-Beadbeater-16 | Biospec Products | 607 | |
| nCounter Analysis system | nanoString Technologies | ||
| nCounter Gene Expression Codesets | nanoString Technologies | ||
| nSolver Analysis tool | nanoString Technologies |
References
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