Genexpressie infecteren Microben Met behulp van een digitale Bar-codering Platform
Summary
We developed a protocol that is fast, sensitive and reproducible for pathogen gene expression profiling during an infection.
Abstract
Voor de meeste zoogdieren pathogenen, zijn gene expression profiling studies beperkt door technische moeilijkheden om nauwkeurig te kwantificeren pathogeen gentranscripten van geïnfecteerde weefsels. Pathogeen RNA vormt een klein deel van het totale RNA geïsoleerd van geïnfecteerde weefselmonsters. Zowel microarray en RNAseq technologieën hebben problemen bij het genereren van betrouwbare leest voor zwak uitgedrukt pathogeen genen. Gemuteerde ziekteverwekker stammen met verminderde in vivo proliferatie vormen een nog grotere uitdaging. Hier beschrijven we een in vivo gene expression profiling protocol dat is erg snel, zeer gevoelig en zeer reproduceerbaar. We ontwikkelden dit protocol tijdens ons onderzoek naar de schimmel pathogeen Candida albicans in een muizenmodel van hematogeen verspreid candidiasis. Met behulp van dit protocol, hebben we de tijd cursussen van dynamisch geregeld C. gedocumenteerd albicans genexpressie tijdens nierbesmetting en ontdekte onverwachte eigenschappen vangenexpressie reacties op de behandeling met geneesmiddelen antifungale in vivo.
Introduction
Genexpressie dynamiek houdt vitale informatie over hoe een cel reageert op veranderingen in het milieu. Bij een infecterende microbe kan genexpressiedata klinisch relevante inzichten over een pathogeen zich aanpast aan de infectie milieu en veroorzaakt schade aan de gastheer te verschaffen. In de afgelopen twee decennia hebben genexpressie studies zowel in vitro als in vivo grote hoeveelheid gegevens gegenereerd en legde de basis voor het begrijpen van de infectie biologie 1-3. Echter, de huidige profilering technologieën zoals microarray en RNAseq, zijn niet optimaal voor de profilering van pathogeen genexpressie tijdens infectie. Host RNA vormt overgrote deel (gewoonlijk> 99%) van het totale RNA geïsoleerd van geïnfecteerde weefselmonsters. De gastheer RNA draagt bij aan de hoge achtergrond op microarrays, en domineert volgorde leest van RNAseq. Pathogeen celisolatie uit geïnfecteerd weefsel, in theorie, kunnen helpen verrijken pathogeen RNA, maar het vormt aanvullingal problemen: het vereist grote hoeveelheden van geïnfecteerde weefsel; de procedure kan vervelend zijn; en het belangrijkst, is het moeilijk om de natieve toestand of integriteit van RNA behouden gedurende het langdurige proces. Om meer uitgebreide en nauwkeurige gegevens over pathogeen genexpressie tijdens echte infecties te genereren, we wilden een protocol dat betrouwbare en kosteneffectieve kwantificering van minderheden RNA soorten laat in een gemengde populatie RNA te ontwikkelen.
NanoString NCounter is een recent ontwikkelde platform dat rechtstreekse multiplex meting van genexpressie maakt gebruik van digitale barcode probeparen 4, 5. Dit platform heeft een gevoeligheid niveau dat vergelijkbaar is met dat van QRT-PCR maar niet enzymatische versterking nodig. De techniek is niet genoombrede, laat detectie van maximaal 800 verschillende genen in elke assay. Daarom is het essentieel om informatieve genen als probes voor profilering selecteren. Hier gebruiken we profilering van genexpressie studie van een belangrijke bromeen pathogeen, Candida albicans, gedurende een invasieve infectie als voorbeeld aan te tonen: 1) Technische details van de experimentele procedures (protocol), 2) de gevoeligheid, reproduceerbaarheid en dynamisch bereik van deze methode (representatieve resultaten), en 3) Belangrijke overwegingen voor het ontwerpen en uitvoeren van experimenten op basis van dit protocol (discussie). Dit protocol kan gemakkelijk worden aangepast voor verschillende pathogenen en is met succes in verschillende infectiemodellen 6-9 toegepast.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit protocol is ontwikkeld om transcriptionele profilering van infecterende microben met een NanoString Ncounter platform optimaliseren. De gehele procedure van weefselverzameltoestel expressie van gegevens, vereist minder dan 48 uur. De hands-on is ongeveer 4 uur voor 12 monsters. Een belangrijke variabele in dit protocol is de hoeveelheid buffer RLT toegevoegd aan het weefsel bij de eerste stap. Te veel buffer zal het homogenaat verdunnen en leiden tot RNA-concentratie te verlagen, terwijl er te weinig buffer kan leiden tot de vorming van viskeuze gels na de fenol chloroform extractiestap en laten geen waterfase voor RNA-herstel. De empirisch bepaalde optimale volumina buffer RLT voor muisweefsels (uitgaande gangbare afmetingen) zijn: nier (1,2 ml), tong (1,0 ml) en long (2,0 ml). Voor microbiële ziekteverwekkers, vooral deze geteeld in filamenteuze vorm, de kraal verslaan stap helpt om open te dikke celwand te breken om de cellulaire inhoud volledig vrij te geven. In de elutiestap, teneinde de uiteindelijke RNA vergrotenconcentratie, kan de eerste ronde eluaat opnieuw worden toegevoegd aan de kolom en elueer nogmaals. Ongeveer 100 ug totaal weefsel RNA kan worden teruggewonnen van de ene RNeasy spin-kolom (~ 2 ug / ul x 50 pi). Indien grotere hoeveelheid RNA nodig kan een tweede prep worden uit de overblijvende weefsel homogenaat. Gooi de resterende homogenaat tot RNA-concentratie is gemeten, voor het geval.
Afhankelijk van het infectiemodel, het inoculum en het pathogeen stam het percentage pathogeen RNA in totaal RNA weefsel varieert van 0% -2%, en typisch valt onder de 0,05% -0,5% bereik. Bijvoorbeeld, 10 pg totaal RNA uit weefsels C. albicans besmette nier ruwe tellingen gelijk aan die van 10 ng zuivere C. kunnen genereren albicans RNA van een in vitro kweek (10 ng / 10 g = 0,1%). Door het percentage pathogeen RNA in totaal weefsel RNA varieert in een groot, is het moeilijk om de hoeveelheid pathoge wetenn RNA in een bepaalde hoeveelheid van totaal RNA. Om verspilling codeset vermijden (250 x 192 genen reacties, de kosten per reactie ongeveer $ 200) op monsters met pathogeen RNA beneden het detectieniveau, kan een RNA kwaliteitscontrole stap worden uitgevoerd om het pathogeen RNA niveau in elk monster te bepalen. Dit kan door een Q-RTPCR of klein codeset met enkele housekeeping genen.
Normalisatie gebruik pathogeen genen is een belangrijke stap voor de expressie profielen te vergelijken tussen verschillende monsters. Er zijn drie gebruikelijke werkwijzen voor normalisatie. 1. Gebruik totaal telt van alle genen in de codeset. 2. Gebruik één of enkele 'housekeeping' genen. 3. Gebruik de geometrisch gemiddelde (Nde wortel van het product van de N getallen) van sterk tot expressie gebrachte genen. Voor een grote codeset (> 100 genen) die willekeurig gekozen probes, met behulp van totale tellingen voor normalisatie kan een goede keuze, omdat de totale tellingen van een groot aantal ongerelateerde genen geloofovereen met het aantal RNA-ingang. Voor een kleine codeset (<100 genen) probes gericht op een specifieke werkwijze (zoals hyfen groei, aangezien hyfen groeigenen vaak mede-gereguleerde), één of enkele housekeeping genen als controle voor de normalisatie van essentieel belang. TDH3, een robuust uitgedrukt metabole gen, heeft goed diende als controle voor vele experimenten. De derde methode is een hybride van werkwijze 1 en 2, met de nadruk op gelijke bijdrage uit sterk tot expressie gebrachte genen.
Hoewel de NCounter platform niet wordt genoom-brede, staat het kwantificeren van meningsuiting niveau tot 800 genen in een enkele test. Daarom is het kiezen van de meest informatieve genen te analyseren is essentieel voor het slagen van de profilering. Twee benaderingen te selecteren op probes werden gebruikt. De eerste benadering is "kenniseconomie". Informatie van gepubliceerde expressie en functionele gegevens zijn samengesteld voor het screenen op genen die van potentieel belang zijn voor de huidigebestuderen, zoals het milieu respons genen 6-9. Deze aanpak maakt een eenvoudige vergelijking van de in vivo data profiling te veel bestaande datasets, dus het verstrekken van context interpretatie van gegevens. De tweede benadering is "verkenning gebaseerd". Een categorie van genen in een microbe genoom, zoals alle genen die transcriptiefactoren, kinases of celwand eiwitten gekozen probes. Deze benadering maakt de identificatie van nieuwe virulentiefactoren en ontdekking van nieuwe regulerende relaties op basis van de in vivo profielgegevens 6.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd mede ondersteund door NIH subsidies R21 DE023311 (APM), R56 AI111836 (APM en SGF), R01 AI054928 (SGF) en R01 DE017088 (SGF).
Materials
| gentleMACS Dissociator | Miltenyl Biotec | 130-093-235 | |
| gentelMACS M tube | Miltenyl Biotec | 130-093-236 | |
| RNeasy Mini Kit | QIAGEN | 74104 | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma | M-3148 | |
| Phenol:ChCl3:IAA | Sigma | P-2069 | |
| Zirconia beads | Biospec Products | 11079110zx | |
| Mini-Beadbeater-16 | Biospec Products | 607 | |
| nCounter Analysis system | nanoString Technologies | ||
| nCounter Gene Expression Codesets | nanoString Technologies | ||
| nSolver Analysis tool | nanoString Technologies |
References
- Cairns, T., Minuzzi, F., Bignell, E. The host-infecting fungal transcriptome. FEMS Microbiol Lett. 307 (1), 1-11 (2010).
- Westermann, A. J., Gorski, S. A., Vogel, J. Dual RNA-seq of pathogen and host. Nat Rev Microbiol. 10 (9), 618-630 (2012).
- Creecy, J. P., Conway, T. Quantitative bacterial transcriptomics with RNA-seq. Curr Opin Microbiol. 23C, 133-140 (2015).
- Geiss, G. K., et al. Direct multiplexed measurement of gene expression with color-coded probe pairs. Nat Biotechnol. 26 (3), 317-325 (2008).
- Malkov, V. A., et al. Multiplexed measurements of gene signatures in different analytes using the Nanostring nCounter Assay System. BMC Res Notes. 2, 80 (2009).
- Xu, W., et al. Activation and Alliance of Regulatory Pathways in C. albicans during Mammalian Infection. PLoS Biology. 13, e1002076 (2015).
- O’Meara, T. R., et al. The Cryptococcus neoformans Rim101 Transcription Factor Directly Regulates Genes Required for Adaptation to the Host. Mol Cell Biol. 34 (4), 673-684 (2014).
- Cheng, S., et al. Profiling of Candida albicans Gene Expression During Intra-Abdominal Candidiasis Identifies Biologic Processes Involved in Pathogenesis. J Infect Dis. 208 (9), 1529-1537 (2013).
- Fanning, S., et al. Divergent Targets of Candida albicans Biofilm Regulator Bcr1 in Vitro and In Vivo. Eukaryot Cell. 11 (7), 896-904 (2012).
- Saeed, A. I., et al. TM4: a free, open-source system for microarray data management and analysis. Biotechniques. 34 (2), 374-378 (2003).
