デジタルバーコードプラットフォームを使用して感染する微生物の遺伝子発現プロファイリング

全ての動物手順はロサンゼルス生物医学研究所（プロトコル011000）で施設内動物管理使用委員会によって承認され、動物の倫理的な治療のための国立衛生研究所（NIH）のガイドラインに従って実施しました。マウスは、ハーバーUCLA研究教育院のキャンパス内にありAAALAC認定施設でケージに入れました。実験動物医学を専門にフルタイムの獣医師は、彼らの世話を監督。監禁と畜産は、米国公衆衛生局の出版物「実験動物の管理と使用に関する指針」のガイドラインに従って提供されました。すべての試みは人道的にマウスを治療することとしました。マウスの生存と健康は、毎日3回モニターしました。明らかに病気、無気力マウスをグループから分離し、苦痛を最小にするために安楽死させました。 Euthanas上のパネルが推奨するようにマウスを、ペントバルビタールの過剰投与（210 mgの/ kg）をすることにより安楽死させましたアメリカ獣医師会のIA。 1.組織の調製、試薬および楽器すべての研究20〜22グラム重み付けオスのBalb / cマウスを使用してください。静脈内に1×10 6酵母相Cで実験群あたり3匹のマウスに接種アルビカンス細胞 。特定の時点感染後に動物や収穫腎臓を生け贄に捧げます。スクリューキャップチューブに各腎臓を置き、後にRNA抽出6のために-80℃の液体窒素中で凍結し、店をスナップ。 注：Xuらに詳細に記載されるように動物実験を行った6。 -80℃の冷凍庫から腎臓を削除する前に、以下の試薬および器具を準備します。 全RNA抽出キットを開きます。 （1％v / v）のRLTをバッファリングし、（各サンプルの2ミリリットルを用意）よく混合するの2-メルカプトエタノールを追加します。 フェノールの調製：クロロホルム：イソアミルアルコール25：24：1（各サンプルの600μlのを必要とします）。 ラベルM型均質化チューブ（M-チューブ）、氷上で冷やします。 ラベル2 mlのキャップチューブをネジし、各チューブに約300μlのジルコニアビーズを追加します。 チェック機器を使用することができます。組織解離、beadbeater、50mlチューブおよび96ウェルプレート、光度計用のアダプタと卓上遠心機。 感染組織から2. RNA抽出 -80℃の冷凍庫から腎臓を含むチューブを外して、氷の上に置きます。各腎臓への2-メルカプトエタノールとをBuffer RLT 1.2ミリリットルを追加します。 M型均質化チューブに緩衝液を用いて腎臓をデカント。 事前ロードされた設定RNA_02.01上の組織解離を使用して腎臓をホモジナイズします。 RTで卓上遠心機で1分間、1000×gで遠心分離します。 ジルコニアビーズを含むスクリューキャップチューブに600μlのホモジネートを転送します。氷の上の残りのホモジネートを保存します。 600μlのフェノールを追加：クロロホルム：イソアミルアルコール25：24：1前のステップからのチューブ。 4℃の低温室で3分間beadbeaterにしっかりと蓋を閉め、ボルテックス。 4℃の低温室で5分間15,000×gでチューブを遠心。 慎重にスピンカラム（2回ロード）にロード、その後、70％エタノールの等量よく混ぜ、新しい1.5mlマイクロチューブに水相を転送します。 二回と500μlのバッファーRPE、続いて700μlのバッファーRWで一度スピンカラムを洗浄します。スピンカラムに残っている液体を除去するためのドライコレクションチューブに遠心分離1つの余分分。 8,000×gですべての遠心操作を実行します。 50μlのH 2 Oで溶出RNA分光光度計を用いてOD 260で RNA濃度を測定します。 デジタルバーコードを使用してプロファイリング3.遺伝子発現氷上で解凍レポーターコードセット（緑キャップチューブ）とキャプチャコードセット（グレーのキャップチューブ）。 130μlのハイブリダイゼーション緩衝液は、再に追加ポーターのコードセットは、混合し、スピンダウンする反転します。 12反応管のそれぞれにミックス20μlのを追加します。 各チューブに（5μLの容量で）全組織RNAの10μgのを追加します。ピペッティングにより混和します。 各チューブに5μlのキャプチャコードセットを追加します。クイックスピンダウンに続いてチューブを反転することによって混合します。 加熱蓋O / N（〜18時間）でのサーマルサイクラーで65℃で反応をインキュベートします。 -20℃から1サンプルカートリッジを取り外し、室温にそれを温め。 卓上遠心機で2分間670×gで4℃、遠心分離機から2試薬プレートを取り外します。 画面上のステップバイステップの指示に従って準備ステーションを設定し、高感度オプションを選択します。 サーマルサイクラーからの反応を削除し、すぐに準備ステーションにロードします。高感度プログラム（3時間）を実行する場合に選択します。 プレップステーションプログラムが完了したら、カートリッジを除去し、透明なテープでレーンをシール。 APカートリッジの下にプライミネラルオイル（1世代のみnCounterため、後の世代には、このステップを必要としない）、その後、デジタルアナライザにカートリッジをロードします。 高解像度スキャンオプションを選択し、画面上のステップバイステップの指示に従ってデジタルアナライザを設定します。 スキャンプログラム（〜4.5時間）、高解像度（600フィールド）オプションを選択して実行します。 スキャンプログラムが完了すると、結果をダウンロード（または電子メールで結果を受け取ることを選択）、およびメーカーのソフトウェアに生データをインポートします。ソフトウェアは自動的にデータの品質をチェックし、データの品質が正常範囲から外れた場合にフラグを発生させます。 （オプション、ソフトウェアの指示に従ってください）​​組み込み関数を使用して技術的な調整を行い、その後、Excelファイルとしてデータをエクスポートします。 次のいずれかの方法を使用してデータを正規化：コードセット内のすべての遺伝子の合計数を、 1つまたは少数の内部コントロール遺伝子;幾何平均高発現遺伝子（説明を参照してください）​​。 （実験は複製または三重に行われた場合）は、異なる実験群間の発現レベルの比を計算した後、各遺伝子の平均発現値を計算します。 （オプション）nSolverソフトウェアまたはそのようなMultiExperimentビューア10としてクラスタリングプログラムに組み込み関数によってプロファイリング結果を分析し、可視化することができます。