פרופיל ביטוי גנים של חיידקים הדבקה באמצעות פלטפורמה דיגיטלית ברקוד
Summary
We developed a protocol that is fast, sensitive and reproducible for pathogen gene expression profiling during an infection.
Abstract
עבור רוב פתוגנים יונקים, ביטוי גני פרופיל מחקרים היה מוגבל על ידי קשיים טכניים לכמת במדויק תעתיקי גני הפתוגן מרקמות נגועות. פתוגן RNA מהווה חלק זעיר של רנ"א הכל מבודד מדגימות רקמה נגועות. microarray וטכנולוגיות RNAseq לשניהם יש קשיים ביצירה קוראים אמינה לגנים הפתוגן הביעו בקול חלוש. זני הפתוגן מוטציה עם מופחת בהתפשטות vivo מהווים אתגר גדול עוד יותר. כאן אנו מתארים בפרוטוקול פרופיל ביטוי גני vivo שהוא מאוד מהיר, מאוד רגיש ומאוד לשחזור. פיתחנו פרוטוקול זה במהלך החקירה שלנו של אלביקנס הפתוגן קנדידה הפטרייה במודל עכברי של פטרת הופץ hematogenously. שימוש בפרוטוקול זה, יש לנו מתועד קורסים של ג המוסדר באופן דינמי בזמן ביטוי אלביקנס גן במהלך זיהום בכליות, ותכונות בלתי צפויות גילו שלתגובות ביטוי גנים לטיפול תרופתי נגד פטריות in vivo.
Introduction
דינמיקת ביטוי גנים מחזיקה מידע חיוני על איך תא מגיב לשינויים סביבתיים. במקרה של חיידק מדביק, נתונים ביטוי גנים יכולים לספק תובנות רלוונטיות מבחינה קלינית על איך הפתוגן מתאים את עצמו לסביבת הזיהום וגורם נזק למארח. בשני העשורים האחרונים, מחקרי ביטוי גנים הן במבחנה in vivo שנוצרו כמות גדולה של נתונים והניחו בסיס להבנת ביולוגיה זיהום 1-3. עם זאת, טכנולוגיות פרופיל הנוכחיות כוללים microarray וRNAseq, אינן אופטימליות לפרופיל של ביטוי גני הפתוגן בזיהום. לארח RNA מהווה חלק מכריע (בדרך כלל> 99%) של RNA הכולל מבודד מדגימות רקמה נגועות. RNA המארח תורם לרקע גבוה בmicroarrays, ושולט רצף קורא מRNAseq. בידוד תא הפתוגן מהרקמה נגועה, בתאוריה, יכול לעזור להעשרה לRNA הפתוגן, אבל זה מציב בנוסףבעיות אל: היא דורשת כמויות גדולות של רקמה נגועה; ההליך יכול להיות מייגע; והכי חשוב, שקשה לשמר את המדינה או שלמות של RNA ילידים בתהליך הארוך. על מנת להפיק נתונים יותר מקיפים ומדויקים על ביטוי גני הפתוגן בזיהומים אמיתיים, יצאנו לפתח פרוטוקול המאפשר כימות אמינה וחסכונית של מיני RNA המיעוט באוכלוסיית RNA מעורבת.
NanoString nCounter היא פלטפורמה שפותחה לאחרונה שעושה מדידה מרובבת ישירה של ביטוי גנים באמצעות זוגות בדיקה מקודד בר דיגיטלי 4, 5. יש פלטפורמה זו רמת רגישות דומה לזה של qRT-PCR אבל אינו דורשת הגברה האנזימטית. הטכנולוגיה אינה הגנום, היא מאפשרת זיהוי של עד 800 גנים שונים בכל assay. לכן, חשוב לבחור גנים אינפורמטיבי כמו בדיקות לפרופיל. כאן אנו משתמשים ביטוי גני פרופיל מחקר של זמזום גדולפתוגן, קנדידה אלביקנס, במהלך זיהום פולשני כדוגמא, כדי להדגים: 1) פרטים טכניים של הפרוצדורות (פרוטוקול), 2) רגישות, שחזור והטווח דינמי של שיטה זו (תוצאות נציג), ו -3) חשובה שיקולים לתכנון וביצוע ניסויים המבוססים על פרוטוקול זה (דיון). פרוטוקול זה ניתן להתאים בקלות לפתוגנים שונים ויושם בהצלחה במספר דגמי זיהום 6-9.
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטוקול זה פותח על מנת לייעל את פרופיל תעתיק של הדבקת חיידקים באמצעות פלטפורמת nanoString nCounter. ההליך כולו, מאוסף רקמות לנתונים ביטוי, דורש פחות מ 48 שעות. הידיים על הזמן היא סביב 4 שעות במשך 12 דגימות. משתנה אחד מפתח בפרוטוקול זה הוא הסכום של RLT חיץ נוסף לרקמה בצעד הראשון. יותר מדי חיץ יהיה לדלל את homogenate ולהוביל להורדת ריכוז RNA, ואילו מאגר קטן מדי עלול להוביל להיווצרות של ג'לי צמיג לאחר שלב חילוץ כלורופורם פנול ולא משאיר שלב המימי להתאוששות RNA. הכרכים אופטימליים באופן אמפירי שנקבעו של RLT חיץ לרקמות עכבר (בהנחת גדלים אופייניים) הם: כליות (1.2 מיליליטר), לשון (1.0 מיליליטר) וריאות (2.0 מיליליטר). לפתוגנים חיידקים, במיוחד אלה גדלו בצורת פילמנטיות, צעד מכות-חרוז עוזר לשבור קיר תא עבה פתוח לשחרר באופן מלא תוכן סלולארי. בשלב elution, על מנת להגדיל את RNA הסופיריכוז, eluate הסיבוב הראשון ניתן להוסיף לראש הטור, וelute בפעם שנייה. כ 100 מיקרוגרם של RNA הכולל רקמה ניתן לשחזר מעמודה אחת ספין RNeasy (~ 2 מיקרוגרם / μl x 50 μl). אם יש צורך בכמות גדולה יותר של רנ"א, הכנה שנייה יכולה להיות עשויה מhomogenate הרקמות שנותר. אין להשליך את homogenate שנותר עד ריכוז RNA כבר נמדד, רק במקרה.
בהתאם לדגם הזיהום, גודל הבידוד ומתח הפתוגן, אחוז RNA הפתוגן בסך RNA רקמה משתנים בין 0% -2%, ובדרך כלל נופלים בטווח של 0.05% -0.5%. לדוגמא, 10 מיקרוגרם של רנ"א רקמות המוחלט מג אלביקנס נגוע בכליות יכולות ליצור ספירת גלם שווה לזה של 10 ng של ג הטהור אלביקנס RNA מתרבות במבחנה (10 ng / 10 מיקרוגרם = 0.1%). בגלל אחוז RNA הפתוגן בסך RNA רקמה משתנה במגוון רחב, קשה לדעת את כמות pathogeRNA n בכמות נתונה של רנ"א הכל. כדי להימנע מבזבוז מערך התוים (250 x 192 תגובות גנים, העלות לכל תגובה היא סביב 200 $) על דגימות עם RNA הפתוגן מתחת לרמת זיהוי, צעד בקרת איכות RNA עשוי להתבצע כדי לקבוע את רמת RNA הפתוגן בתוך מדגם זה. ניתן לעשות זאת על ידי שני Q-RTPCR או מערך התוים קטן המכיל כמה גני משק בית.
נורמליזציה באמצעות גני הפתוגן היא שלב קריטי לפני פרופילי הביטוי ניתן להשוות בין מדגמים שונים. ישנן שלוש שיטות נפוצות לנורמליזציה. 1. ספירה כוללת שימוש מכל הגנים במערך התוים. 2. השתמש באחת או כמה גנים "משק בית". 3. השתמשו בממוצע הגיאומטרי (ה שורש של המוצר של מספרי N N) של גנים הביעו מאוד. למערך התוים גדול (> 100 גנים) המכיל בדיקות שנבחרו באקראי, תוך שימוש בספירה כוללת של נורמליזציה יכולה להיות בחירה טובה, כי הספירה הכוללת של מספר גדול של גנים שאינם קשורים רשאית אמונהלשקף באופן מלא את כמות קלט RNA. למערך התוים קטן (<100 גנים) המכילים בדיקות התמקדו בתהליך מסוים (כגון צמיחת hyphal, בהתחשב בכך שגנים של צמיחת hyphal נוטים להיות שותף מוסדר), בחירה אחת או כמה גני משק בית כשליטה לנורמליזציה היא חיונית. TDH3, גן חילוף חומרים הביע חסונה, שימש גם כשליטה לניסויים רבים. השיטה השלישית היא שיטה היברידית של 1 ו -2, בדגש על תרומה שווה מהגנים הביעו מאוד.
למרות שפלטפורמת nCounter לא הגנום, היא מאפשרת כימות של רמת ביטוי של עד 800 גנים בassay אחד. לכן, בחירת גנים אינפורמטיבי ביותר לנתח היא קריטית להצלחה של הפרופיל. שתי גישות כדי לבחור לבדיקות כבר בשימוש. הגישה הראשונה היא "ידע מבוסס". מידע מביטוי שפורסם ונתונים פונקציונליים נערך למסך לגנים שיש בם עניין הפוטנציאל הנוכחיללמוד, כגון גני התגובה הסביבתיים 6-9. גישה זו מאפשרת השוואה קלה של פרופיל in vivo נתונים למערכי נתונים קיימים רבים, ולכן מתן הקשר לפרשנות הנתונים. הגישה השנייה היא "חקר מבוסס". קטגוריה של גנים בגנום חיידק, כגון כל הגנים המפרטים גורמי שעתוק, קינאז או קיר תא חלבונים שנבחרו לבדיקות. גישה זו מאפשרת זיהוי של גורמי רומן אלימות וגילוי של יחסי רגולציה רומן המבוססים על in vivo פרופיל נתונים 6.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה בחלקו על ידי מענקי NIH R21 DE023311 (APM), R56 AI111836 (APM & SGF), R01 AI054928 (SGF), וR01 DE017088 (SGF).
Materials
| gentleMACS Dissociator | Miltenyl Biotec | 130-093-235 | |
| gentelMACS M tube | Miltenyl Biotec | 130-093-236 | |
| RNeasy Mini Kit | QIAGEN | 74104 | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma | M-3148 | |
| Phenol:ChCl3:IAA | Sigma | P-2069 | |
| Zirconia beads | Biospec Products | 11079110zx | |
| Mini-Beadbeater-16 | Biospec Products | 607 | |
| nCounter Analysis system | nanoString Technologies | ||
| nCounter Gene Expression Codesets | nanoString Technologies | ||
| nSolver Analysis tool | nanoString Technologies |
References
- Cairns, T., Minuzzi, F., Bignell, E. The host-infecting fungal transcriptome. FEMS Microbiol Lett. 307 (1), 1-11 (2010).
- Westermann, A. J., Gorski, S. A., Vogel, J. Dual RNA-seq of pathogen and host. Nat Rev Microbiol. 10 (9), 618-630 (2012).
- Creecy, J. P., Conway, T. Quantitative bacterial transcriptomics with RNA-seq. Curr Opin Microbiol. 23C, 133-140 (2015).
- Geiss, G. K., et al. Direct multiplexed measurement of gene expression with color-coded probe pairs. Nat Biotechnol. 26 (3), 317-325 (2008).
- Malkov, V. A., et al. Multiplexed measurements of gene signatures in different analytes using the Nanostring nCounter Assay System. BMC Res Notes. 2, 80 (2009).
- Xu, W., et al. Activation and Alliance of Regulatory Pathways in C. albicans during Mammalian Infection. PLoS Biology. 13, e1002076 (2015).
- O’Meara, T. R., et al. The Cryptococcus neoformans Rim101 Transcription Factor Directly Regulates Genes Required for Adaptation to the Host. Mol Cell Biol. 34 (4), 673-684 (2014).
- Cheng, S., et al. Profiling of Candida albicans Gene Expression During Intra-Abdominal Candidiasis Identifies Biologic Processes Involved in Pathogenesis. J Infect Dis. 208 (9), 1529-1537 (2013).
- Fanning, S., et al. Divergent Targets of Candida albicans Biofilm Regulator Bcr1 in Vitro and In Vivo. Eukaryot Cell. 11 (7), 896-904 (2012).
- Saeed, A. I., et al. TM4: a free, open-source system for microarray data management and analysis. Biotechniques. 34 (2), 374-378 (2003).
