التنميط التعبير الجيني اصابة الميكروبات باستخدام منصة رقمية من الترميز
Summary
We developed a protocol that is fast, sensitive and reproducible for pathogen gene expression profiling during an infection.
Abstract
بالنسبة لمعظم مسببات الأمراض الثدييات والتعبير الجيني التنميط الدراسات كانت محدودة بسبب الصعوبات التقنية لتحديد بدقة النصوص الممرض الجينات من الأنسجة المصابة. يشكل الممرض RNA جزء صغير جدا من الحمض النووي الريبي مجموع معزولة عن عينات الأنسجة المصابة. كلا ميكروأري والتكنولوجيات RNAseq صعوبات في توليد موثوقة يقرأ عن الجينات الممرض أعرب ضعيفة. سلالات الممرض متحولة مع انخفاض في انتشار فيفو تشكل تحديا أكبر. نحن هنا وصف في الجسم الحي التعبير الجيني بروتوكول التنميط هذا هو سريع جدا وحساسة للغاية وتكرار للغاية. وضعنا هذا البروتوكول خلال تحقيقنا للالفطرية البيض الممرض المبيضات في نموذج الفئران من داء المبيضات نشر hematogenously. استخدام هذا البروتوكول، ونحن قد وثقت الدورات وقت ينظم حيوي C. البيض التعبير الجيني خلال عدوى في الكلى، وميزات غير متوقعة اكتشف منردود التعبير الجيني للفطريات العلاج من تعاطي المخدرات في الجسم الحي.
Introduction
ديناميات التعبير الجيني يحمل معلومات حيوية عن كيفية استجابة الخلايا للتغيرات البيئية. في حالة وجود ميكروب إصابة، يمكن للبيانات التعبير الجيني تقديم رؤى ذات الصلة سريريا على كيف يتكيف الممرض للبيئة عدوى ويسبب ضررا لالمضيف. في العقدين الماضيين، وقد ولدت دراسات التعبير الجيني على حد سواء في التجارب المختبرية والحية كمية كبيرة من البيانات وضعت أساسا لفهم العدوى البيولوجيا 1-3. ومع ذلك، والتكنولوجيات التنميط الحالية بما في ذلك ميكروأري وRNAseq، ليست هي الأمثل لالتنميط التعبير الجيني الممرض خلال العدوى. استضافة يشكل RNA وهو جزء الساحقة (عادة> 99٪) من الحمض النووي الريبي مجموع معزولة عن عينات الأنسجة المصابة. يساهم RNA المضيف إلى خلفية عالية على المجهرية، ويهيمن تسلسل يقرأ من RNAseq. عزل الخلايا الممرض من الأنسجة المصابة، من الناحية النظرية، يمكن أن تساعد على إثراء لالممرض RNA، ولكنه يطرح بالإضافةمشاكل سورة: أنه يتطلب كميات كبيرة من الأنسجة المصابة. هذا الإجراء يمكن أن تكون مملة. والأهم من ذلك، فإنه من الصعب للحفاظ على الدولة الأم أو سلامة RNA خلال عملية طويلة. من أجل توليد المزيد من البيانات شاملة ودقيقة عن العوامل المسببة للأمراض التعبير الجيني خلال العدوى الحقيقية، شرعنا في وضع بروتوكول يسمح الكمي موثوقة وفعالة من حيث التكلفة لأنواع RNA أقلية في عدد السكان RNA مختلطة.
NanoString nCounter هو منصة وضعت مؤخرا أن يجعل قياس المضاعفة المباشر في التعبير الجيني باستخدام الرقمية أزواج التحقيق شريط مشفر 4، 5. هذه المنصة لديها مستوى حساسية مماثلة لتلك التي من QRT-PCR ولكن لا تتطلب التضخيم الأنزيمية. التكنولوجيا ليست واسعة الجينوم، لأنها تتيح الكشف عن ما يصل الى 800 جينات مختلفة في كل فحص. لذا، فمن الأهمية بمكان لتحديد الجينات بالمعلومات كما تحقيقات لتحديد ملامح. هنا نستخدم التعبير الجيني التنميط دراسة همهمة الرئيسيةالممرض، المبيضات البيض، أثناء وجود عدوى الغازية على سبيل المثال، لإثبات: 1) التفاصيل الفنية للإجراءات التجريبية (بروتوكول)، 2) الحساسية، واستنساخ والنطاق الديناميكي لهذه الطريقة (نتائج ممثل)، و 3) هام اعتبارات لتصميم وإجراء التجارب على أساس هذا البروتوكول (مناقشة). هذا البروتوكول يمكن تكييفها بسهولة لمختلف مسببات الأمراض وطبقت بنجاح في عدد من نماذج العدوى 6-9.
Protocol
Representative Results
Discussion
تم تطوير هذا البروتوكول لتحسين النسخي اصابة الميكروبات باستخدام منصة nanoString nCounter. الإجراء بأكمله، من جمع الأنسجة لبيانات التعبير، يتطلب أقل من 48 ساعة. التدريب العملي على الساعة حوالي 4 ساعات لمدة 12 عينات. واحد متغير رئيسي في هذا البروتوكول هو مقدار عازلة RLT تضاف إلى الأنسجة في الخطوة الأولى. والكثير من عازلة تمييع جناسة ويؤدي إلى خفض تركيز الحمض النووي الريبي، بينما عازلة القليل جدا قد يؤدي إلى تشكيل المواد الهلامية اللزجة بعد خطوة الاستخراج الفينول الكلوروفورم وترك أي المرحلة المائية لتحقيق الانتعاش RNA. وحدات التخزين المثلى تحدد تجريبيا من RLT العازلة للأنسجة الماوس (على افتراض أحجام نموذجية) هي: الكلى (1.2 مل)، واللسان (1.0 مل) والرئة (2.0 مل). بالنسبة لمسببات الأمراض الجرثومية، وخصوصا هذه التي تزرع في شكل الخيطية، وخطوة بفوزه على حبة يساعد على كسر فتح جدار الخلية سميكة لاطلاق سراح تماما محتويات الخلوية. في خطوة شطف، من أجل زيادة RNA النهائيالتركيز، أول شطافة مستديرة ويمكن أن يضاف إلى العمود، وأزل مرة ثانية. حوالي 100 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي مجموع الأنسجة يمكن استردادها من واحد العمود RNeasy تدور (~ 2 ميكروغرام / ميكرولتر × 50 ميكرولتر). إذا كانت هناك حاجة أكبر كمية من الحمض النووي الريبي، والإعدادية الثاني يمكن أن تكون مصنوعة من جناسة الأنسجة المتبقية. لا تتخلص من جناسة المتبقية حتى تم قياس تركيز الحمض النووي الريبي، فقط في حالة.
اعتمادا على نموذج العدوى، وحجم قيحة وسلالة الممرض، نسبة الممرض RNA في الحمض النووي الريبي مجموع الأنسجة يختلف من 0٪ -2٪، وعادة ما يندرج ضمن 0.05٪ -0.5٪ النطاق. على سبيل المثال، 10 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي مجموع الأنسجة من C. إصابة البيض الكلى يمكن أن تولد التهم الخام مساوية ل10 نانوغرام من الذهب الخالص C. البيض RNA من ثقافة في المختبر (10 نانوغرام / 10 ميكروغرام = 0.1٪). لأن نسبة الممرض RNA في الحمض النووي الريبي مجموع الأنسجة تختلف في نطاق واسع، فإنه من الصعب أن نعرف كمية pathogeن RNA في كمية معينة من مجموع RNA. لتجنب هدر codeset (250 جينات X 192 ردود الفعل، والتكلفة لكل رد فعل حوالي 200 $) على عينات الحمض النووي الريبي مع الممرض دون مستوى الكشف، قد يتم تنفيذ خطوة لمراقبة الجودة RNA لتحديد مستوى الممرض RNA داخل كل عينة. ويمكن القيام بذلك عن طريق إما Q-RTPCR أو codeset صغيرة تحتوي على عدد قليل من الجينات التدبير المنزلي.
التطبيع باستخدام الجينات الممرض هو خطوة حاسمة قبل ملامح التعبير يمكن مقارنة بين عينات مختلفة. هناك ثلاث طرق شائعة الاستخدام للتطبيع. 1. استخدام العد الكلي من جميع الجينات في codeset. 2. استخدام واحد أو عدد قليل من الجينات "التدبير المنزلي". 3. استخدام الوسط الهندسي (N عشر الجذرية للمنتج من الأرقام N) من الجينات التي أعرب عنها إلى حد كبير. لcodeset كبيرة (> 100 الجينات) التي تحتوي على تحقيقات تم اختيارها عشوائيا، وذلك باستخدام العدد الكلى للتطبيع يمكن أن يكون خيارا جيدا، لأن العد الكلي لعدد كبير من الجينات لا علاقة لها قد الإيمانيعكس تماما كمية المدخلات RNA. لcodeset صغيرة (<100 الجينات) التي تحتوي تركز على عملية معينة المسابير (مثل نمو خوطي، بالنظر إلى أن جينات النمو خوطي تميل إلى أن يشترك تنظيم)، واختيار واحد أو عدد قليل من الجينات التدبير المنزلي عن السيطرة لتطبيع أمر ضروري. TDH3، جين الأيض أعرب بقوة، وقد خدم كذلك التحكم في العديد من التجارب. الطريقة الثالثة هو مزيج من أسلوب 1 و 2، مع التركيز على مساهمة متساوية من الجينات التي أعرب عنها إلى حد كبير.
على الرغم من أن منصة nCounter لا الجينوم، فإنه يسمح الكمي لمستوى التعبير لمدة تصل إلى 800 الجينات في فحص واحد. لذلك، واختيار الجينات أكبر قدر من المعلومات لتحليل هو أمر حاسم لنجاح التنميط. وقد استخدمت نهجين لتحديد للتحقيقات. النهج الأول هو "قائم على المعرفة". يتم تصنيف المعلومات من التعبير المنشورة والبيانات الوظيفية للكشف عن الجينات التي تنطوي على أهمية محتملة للتياردراسة مثل جينات الاستجابة البيئية 6-9. هذا النهج يتيح المقارنة سهلة لفي الجسم الحي التنميط البيانات إلى العديد من قواعد البيانات الموجودة، وبالتالي توفير إطار لتفسير البيانات. النهج الثاني هو "استكشاف أساس". ويتم اختيار فئة من الجينات في الجينوم ميكروب، مثل كل الجينات تحديد عوامل النسخ، تحركات أو البروتينات جدار الخلية للتحقيقات. هذا النهج يتيح تحديد عوامل الفوعة جديدة واكتشاف علاقات تنظيمية جديدة على أساس المجراة التنميط البيانات 6.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل في جزء من المنح NIH R21 DE023311 (APM)، R56 AI111836 (APM وSGF)، R01 AI054928 (SGF)، وR01 DE017088 (SGF).
Materials
| gentleMACS Dissociator | Miltenyl Biotec | 130-093-235 | |
| gentelMACS M tube | Miltenyl Biotec | 130-093-236 | |
| RNeasy Mini Kit | QIAGEN | 74104 | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma | M-3148 | |
| Phenol:ChCl3:IAA | Sigma | P-2069 | |
| Zirconia beads | Biospec Products | 11079110zx | |
| Mini-Beadbeater-16 | Biospec Products | 607 | |
| nCounter Analysis system | nanoString Technologies | ||
| nCounter Gene Expression Codesets | nanoString Technologies | ||
| nSolver Analysis tool | nanoString Technologies |
References
- Cairns, T., Minuzzi, F., Bignell, E. The host-infecting fungal transcriptome. FEMS Microbiol Lett. 307 (1), 1-11 (2010).
- Westermann, A. J., Gorski, S. A., Vogel, J. Dual RNA-seq of pathogen and host. Nat Rev Microbiol. 10 (9), 618-630 (2012).
- Creecy, J. P., Conway, T. Quantitative bacterial transcriptomics with RNA-seq. Curr Opin Microbiol. 23C, 133-140 (2015).
- Geiss, G. K., et al. Direct multiplexed measurement of gene expression with color-coded probe pairs. Nat Biotechnol. 26 (3), 317-325 (2008).
- Malkov, V. A., et al. Multiplexed measurements of gene signatures in different analytes using the Nanostring nCounter Assay System. BMC Res Notes. 2, 80 (2009).
- Xu, W., et al. Activation and Alliance of Regulatory Pathways in C. albicans during Mammalian Infection. PLoS Biology. 13, e1002076 (2015).
- O’Meara, T. R., et al. The Cryptococcus neoformans Rim101 Transcription Factor Directly Regulates Genes Required for Adaptation to the Host. Mol Cell Biol. 34 (4), 673-684 (2014).
- Cheng, S., et al. Profiling of Candida albicans Gene Expression During Intra-Abdominal Candidiasis Identifies Biologic Processes Involved in Pathogenesis. J Infect Dis. 208 (9), 1529-1537 (2013).
- Fanning, S., et al. Divergent Targets of Candida albicans Biofilm Regulator Bcr1 in Vitro and In Vivo. Eukaryot Cell. 11 (7), 896-904 (2012).
- Saeed, A. I., et al. TM4: a free, open-source system for microarray data management and analysis. Biotechniques. 34 (2), 374-378 (2003).
