İnsan İmmün Yetmezlik Virüs çoğaltma Fitness belirlenmesi için İkili Büyüme Rekabet Analizi

NOT: protokol, aşağıda tarif edildiği gibi, herhangi bir hasta tanımlayıcı bilgiler içermez ve bu nedenle Washington Üniversitesi Kurumsal Değerlendirme Kurulu tarafından İnsan Konular Araştırma veya İnsan Konular Bölümü kabul edilmez. Kimerik HIV-1 NL4-3 Moleküler Klonların 1. İnşaat 1.1) büyütmek yerleştirin DNA fragmanını Kimerik primerler tasarlayın. 5 'hem de yarım ileri ve geri primerler parçası eklenir hangi bir HIV-1 vektör dizisini içerir. Primerlerin 3 'yarısı uç sekansı (Şekil 2) ucunu içermelidir. Kimerik primer sekans, özgün açık okuma çerçeveleri muhafaza emin olun. Ya da daha büyük 60 ° C'ye eşit olan bir erime sıcaklığı, ~ 50% GC içeriği ve astar dimerler, heterodimerler ve / veya firkete yapı oluşturmak için düşük bir eğilimi olan, uzunluğu primerler, en az 20 baz kullanın. Bu özellikleri değerlendirmekOligoAnalyzer web aracını kullanarak ( https://www.idtdna.com/analyzer/Applications/OligoAnalyzer/ ). Kullanım PCR 27 ve kimerik primerler giriş DNA '(Şekil 2) çoğaltmak için. Her bir PCR reaksiyonu için 1X yüksek doğrulukta tampon, 0.2 mM dNTP, yüksek doğrulukta bir DNA polimerazı 1 U ileri kimerik primeri, 0.5 uM, ters kimerik primerin 0.5 uM, ve uç bölgesi taşıyan DNA numunesinin 1 PG0 ng kullanımı. 50 ul'lik nihai bir hacme kadar dH 2 O ekleyin. Aşağıdaki gibi termal döngü aşamaları ayarlayın: 10 saniye boyunca 98 ° C'de bir ilk denatürasyon adımı bir DNA gerçekleştirin. 20 sn için iki primerin düşük erime sıcaklığının en az 3 ° C 'de 10 saniye ve DNA tavlama için 98 ° C' de bir DNA denaturasyon 30 devir ile yükseltin. 10 dakika boyunca 72 ° C'de son uzatma gerçekleştirin. 4 ° C'de saklayın PCR ürünleri. PCR ürünleri 5 ul alınBir önceki adım ve agaroz jel elektroforezi 28 çalıştırın. DNA büyüklüğü işaretleyici olarak, bir% 0.7 agaroz jeli, 1x TAE tamponu (40 mM Tris-asetat, 1 mM EDTA), 0.5 ug / ml etidyum bromür (EtBr) nihai konsantrasyon ve 1kb merdiven kullanın. Elektrotlar arasında 5 V / cm mesafeye ayarlayın güç kaynağı gerilimi. Yükleme boya yaklaşık 2/3 jel uzunluğu boyunca göç zaman elektroforez durdurun. Bir jel dokümantasyon sistemi 28 kullanılarak jel gözünüzde canlandırın. NOT: EtBr şüphelenilen kanserojen ve düzgün kurum düzenlemeleri uyarınca, atılmalıdır. EtBr içeren jeller tutarken eldiven daima giyilmelidir. Malzemeyi içeren bitiş taşıma EtBr sonra yeni eldiven ve çapraz bulaşmayı önlemek için diğer malzemeleri veya işleme ekipmanı önce değiştirin. Arzu edilen PCR ürününe tekabül eden bir ebada sahip olan tek bir DNA bandı tespit edilirse, bu QIAquick PCR Saflaştırma Kiti uyum gibi bir ticari kit kullanılarak PCR ürününün geri kalanı saflaştırmaküreticinin protokollerine ing. Diğer spesifik olmayan bantlar da mevcutsa, preparatif jel elektroforezi çalıştırmak için PCR ürününün geri kalanı kullanın. Adım 1.1.4 belirtilen aynı parametreler ve koşullar kullanın. Jel kuyu ~ PCR ürünlerinin 45 ul yüklemek için yeterince büyük olduğundan emin olun. Ilgi bandı kesilmiştir ve üretici protokollerine göre QIAquick jel ekstre etme kiti kullanılarak jelden DNA ekstrakte edin. 1.2)) (Tam boy Enfeksiyonlu HIV-1 alt tip B Vektörü içine pNL4-3 insert fragmanı tanıtmak PCR primerleri olarak aşama 1.1.5 saflaştırılmış PCR ürünleri kullanın. Bir PCR reaksiyonunda şablon DNA olarak pNL4-3VifA 20 kullanımı ve diğer reaksiyon (Şekil 2) şablon olarak pNL4-3VifB 20 kullanımı. Her bir PCR reaksiyonu için, 1 x yüksek doğrulukta tampon kullanarak, 0.2 mM dNTP, yüksek doğrulukta bir DNA polimerazı 2 U, primer DNA 500 ng ve nihai hacim içinde şablon DNA 50 ng50 ul ume. 10 dakika boyunca 72 ° C'de, ardından 10 saniye, 1 dakika ve 10 dakika boyunca 72 ° C, 48 ° C, 98 ° C 'de, 30 saniye için 98 ° C 35 döngü: termal döngü parametrelerinin ayarlayın. PCR reaksiyonu, 10 U DPN I 50 ul ekle ve şablon DNA sindirmek, 1 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edin. Plazmid DNA bir metilasyon yetkili bakteri suşu, örneğin izole olduğundan emin olun., TOP10 kimyasal yetkili Escherichia coli. Kullanım Dpn Ben yetkili bakteri hücrelerini dönüştürmek için ürünü sindirilmiş. Top10 kimyasal yetkili E. ile ısı-şok dönüşümü kullanın E. coli, imalatçının protokolüne göre yöntem. Yeniden birleştirici plazmit ihtiva eden bakteriyel hücreleri seçmek için, 100 mg / L karbenisilin içeren Luria Broth (LB) kültür plakaları kullanılır. ~ 10 iyi ayrılmış koloniler ve 100 mg / L karbenisilin içeren 3 ml LB sıvı ortam içinde ayrı ayrı büyümek ve 30 ° C'de inkübe edinShaker O / N. Üreticinin protokolüne göre, bakteriyel sıvı kültürden plazmid DNA izole etmek için, QIAprep Spin Miniprep kiti kullanılarak. Plazmid DNA düzgün insert içerip içermediğini belirlemek için çift kısıtlama sindirimi 29 kullanın. Kısıtlama sahası yalnızca tek bir uç bölgesi içinde bulunmaktadır ve diğer kısıtlama alanı uç bölgenin dışında, HİV-1 vektörü içinde sadece bir kez bulunur olduğundan emin olun. 10 | il son reaksiyon hacmi içinde plazmid DNA Digest en az 300 ng. Seçilen restriksiyon enzimleri arasında, üreticinin protokolüne uygun olarak seçin kısıtlama tamponlar, inkübasyon sıcaklığı ve inkübasyon süresi. Adım 1.1.4 açıklandığı gibi sindirilmiş DNA ve çalıştırmak jel elektroforezi 9 ul alın. Tahmin boyutlarda DNA bantları var rekombinant plazmidler seçin. Sanger dizileme ile rekombinant plazmid dizisi bütünlüğünü onaylayın. Nadir, istenmeyen ikenmutasyon (lar), PCR reaksiyonları sırasında sokulabilir. Sekans plasmid DNA, her iki ip kolları. Sıralama primerleri dizayn etmek için adım 1.1.1.1 yönergeleri izleyin. Buna ek olarak, ileri sağlar ve sırasıyla rekombinant plasmid yukarı akış ve uç bölgesinin alt baş dizileme primerleri tavlama, en az 50 bp ters. Ticari bir DNA dizileme servis sağlayıcıya plazmid DNA ve sıralama primerleri gönderin. Servis sağlayıcı tarafından belirtilen DNA örneği ve primerler hazırlayın. Üreticinin protokolüne göre bir Endotoksin olmayan Plazmid DNA kit'i kullanılarak mutasyona uğramış plazmid DNA'nın bir endotoksin içermeyen stok yapmak. Takip eden aşamada transfeksiyonu için endotoksin içermeyen plazmid DNA, en az 1 ug hazırlayın. 1.3) tanıtmak Küçük Ölçekli Mutasyonları Via Mutajenezi Sitesi yönettiği İleri örtüşen ile mutajenik primerler tasarlayın ve istenen mutat içeren primerler tersiyon (lar). Taban (ler), ikame eklenen veya 10-15 homolog üsleri çevrili primerlerin ortasında silinecek yerleştirin. Adım 1.1.1.1 yönergeleri izleyin. Mutant plazmitleri sentezlenmesi için PCR kullanarak. Her bir PCR reaksiyonu için, 1 x yüksek doğrulukta tampon kullanarak, 10 mM dNTP, yüksek doğrulukta bir DNA polimerazı 2 U ileri mutajenik primerin 0.5 uM, ters mutajenik primerin 0.5 uM ve kimerik pNL4-3VifB 50 ng, aşamada 1.2.6 gelen 50 ul nihai hacim içinde. 10 dakika boyunca 72 ° C'de, ardından 10 saniye, 1 dakika ve 10 dakika boyunca 72 ° C, 48 ° C, 98 ° C 'de, 30 saniye için 98 ° C 25 çevrim: termal döngü parametrelerinin ayarlayın. Adımı yineleyin 1.2.6 ile 1.2.2. Viral Stokta 2. Nesil Transfeksiyon kullanma Gerekli viral stok istenen ve plazmid DNA miktarını hesaplayın. 10 4 IU / ml ya da daha yüksek, bir viral titresi ile viral stok 1.8 ml büyüme rekabet assa iki set için yeterlidirys, monoinfections dahil olmak üzere her üç nüsha olarak yapılır. 6-çukurlu plaka içinde yapılan bir transfeksiyon için, yaklaşık 1.8 mi süpernatan oyuk başına hasat edilir. Plazmid DNA, bir ug 6-çukurlu plaka içinde yapılan her bir transfeksiyon için gereklidir. 6 gözlü bir plakanın her bir oyuk için transfeksiyon karışımı, örneğin, 100 ul hazırlar., Plazmid DNA ve serum içermeyen DMEM içinde 1 ug, 1 ul X-tremeGENE 9 transfeksiyon reaktifi (ya da benzer ürün) 'den oluşan. Oyuk başına 1 | ig plazmid DNA kullanılarak gerekli plazmid DNA hacmini belirler. Plazmid DNA 'nın nihai konsantrasyonu, en az 50 ng / | il olduğundan emin olun. Serum-barındırmayan ortam (DMEM) de aşağıdaki formüle göre gerekli ne kadar belirler: ul = 100 ul DMEM toplam hacmi – ul DNA hacmi. 6-çukurlu plaka 10 6 HEK 293T-17 (ATCC) hücresi / yuva yayılma ortamı (DMEM +% 10 cenin sığır serumu (FBS)) 2 ml ilave edilir. Bir 37 ° C 'de 1 saat süre ile inkübe% 5 CO 2 atmosfer. Gerektiğinde (adım 2.1 belirlenen) gibi çok sayıda çukur tohumu. Transfeksiyon karışımı hazırlandı 1.8 ml polipropilen mikrosantrifüj tüpü içine, yukarıda hesaplanan, serumsuz DMEM uygun hacimde bir sıvı bölüntü, ve daha sonra transfeksiyon reaktifi ekleyin. Pipet reaktif doğrudan medya çözüm içine, mikrosantrifüj tüp plastik yüzeye eklemeyin. Geçen plazmid DNA ekleyin. Pipet yukarı ve aşağı yavaşça çözüm karıştırmak için. Transfeksiyon komplekslerinin oluşmasını sağlamak için 15 dakika oda sıcaklığında (25 ° C, 15 ° C) inkübe edin. 6-kuyucuklu plakaya döllenmiş hücrelere damla damla bir tarzda karışımı ekleyin. Hafifçe çalkalayın veya transfeksiyon komplekslerinden eşit dağılımını sağlamak için kuyu girdap. Naylon ile Seal plakalar. 48 saat boyunca bir% 5 CO2 atmosferinde 37 ° C 'de kültürleri inkübe edin. Dikkatli bir şekilde toplamak ve bir 15 ml tüp Throu süpernatantı aktarmak için bir pipet kullanın0.22 um'lik bir filtre üst gh. Kapaklarında lastik conta ile 1.8 mi mikrofüj tüplere süzüldü süpernatan 250 ul veya daha fazla transfer pipet kullanın. Mağaza kullanılana kadar -80 ° C 'de süpernatanların süzüldü. 3. Periferik Kan Mononükleer Hücreleri üzerinde Viral Stoklar Enfeksiyon titresi (PBMCler) belirleyin Fitohemaglütininle (PHA) ile PBMC'leri Canlandıracak. Bir viral stok, tohum tamamlandı Iscove Modifiye Dulbecco Ortamı 2 x 10 6 PBMC'ler başına (cIMDM insan interlökin 2 20 U / ml ile takviye edilmiş IMDM (hIL-2),% 10 fetal büyükbaş hayvan serumu ve% 1 penisilin / streptomisin) desteklenmiş PHA (1.5 ug / ml) ile. 2 x 10 6 hücre / ml'de Tohum PBMC'ler. 72 saat boyunca bir% 5 CO2 atmosferinde 37 ° C'de inkübe edin PBMC'ler. Hasat PHA PBMC'leri uyarılmış. 50 ml konik bir tüp yapışmayan PHA PBMC aktarın. 10 dakika boyunca 228 xg'de tüp Spin. Dikkatle disruptin olmadan süpernatant kaldırmakg hücre topağı. CIMDM 2 x 10 5 PBMC / ml lik bir nihai konsantrasyonda, hücre topağı yeniden askıya. Tohum, 2 x 10 4 PHA yuvarlak tabanlı 96-kuyulu bir levhadaki PBMC / oyuk 100 ul / kuyucuk cIMDM uyarmıştır. Viral stoklar 1:10 seyreltme olun. Daha sonra, önce seyreltilmiş stok, 96 çukurlu bir ana levha, on iki 3-kat seri seyreltiler. Bu seyreltme şeması, ml başına 10 Nisan – 10 Haziran enfeksiyöz ünite (IU) aralığında viral titreleri tespit etmek için önerilmektedir. Örneğin, 1.5 ml bir tüp içinde 180 ul ortama virüs stokunun 20 ul ekle. Dikkatle pipetleme seyreltme karıştırın. Sonra ilk kuyunun 180 ul ortama seyreltilmiş hisse 90 ul transferi ve Pipetleme tarafından iyice karıştırın. Bir sonraki oyuk 180 ul ortama mevcut kuyudan on kez daha 90 ul aktarma ile seyreltme serisi devam edin. Artış veya ilk seyreltme azaltmak durumunda 10 6 IU / ml daha yüksek titreleriveya daha düşük bir 10 4 lU / ml, sırasıyla beklenmektedir. Dört nüsha olarak (adım 3,3) numaralı seribaşı PBMC'leri plakasına ana seyreltme plaka seri seyreltilmiş viral stokunun 40 ul ekleyin. 16-24 saat boyunca bir% 5 CO2 atmosferinde 37 ° C'de inkübe edin. Dikkatle her gözden üst fazın 100 ul kaldırmak ve / oyuk 200 ul toplam hacimde taze cIMDM 160 ul ile değiştirin. CO2 atmosferinde% 5 (gün 1), 37 ° C'de inkübe edin. Günde 4, 7, 10 ve 13 aktarma her bir oyuğa 100 ul bozulması tamponu (PBS içinde% 2 Triton X-100), üstte yüzen madde 100 ul ve taze cIMDM 100 ul ile değiştirin üzerinde. -20 ° C'de süpernatantlar saklayın. Örnekleme ve titre stabilize kadar her üç günde bir, taze cIMDM eklemeye devam edin. Gün 7 ve 1 ile p24 ELISA ile, viral stoklar% 50 doku kültürü enfeksiyon dozu (TCID50) belirlemek3 örnek olarak aşama 4'te tarif edilen. Gün 13 elde TCID 50 günden 7 den titre açıkça daha yüksek ise, virüs stok genişletmek için daha uzun bir zamana ihtiyacı olabilir. İki örnekleme zaman noktalarında bulaşıcı titreleri istikrarlı (veya düşüş) olmak kadar daha sonraki örnekler kullanılarak p24 ELISA tekrarlayın. En yüksek titreleri ile örneklerinden seçin stokları. 4. ELISA Viral Enfeksiyon titresinin belirlenmesi için, HIV-1 p24 tespiti (immünoabsorban tahlil enzim-bağlı) Not: Aşağıdaki protokol laboratuarımızda 30'da hazırlanan p24 antijen yakalama plakaları kullanılarak geliştirilmiştir. Ticari HİV-1 p24 ELISA plaka / kitleri, aynı zamanda, imalatçının protokolü takip kullanılabilir. Örnekleri ile çalışmaya başlamadan önce, çalışma stokları birincil antikor (tavşan anti-HIV-1 p24 SF2 antiserum) hazırlanması. Oda sıcaklığında çözülme p24 antiserumu. Fosfata içinde% 10 FBS, 2 ml gliserol, 2.5 ml karıştırıne tamponlu serum fizyolojik (PBS). Antiserumun 0.5 ml ilave edilir ve karıştırılır. Mağaza -20 ° C 'de parçalar 1 mi. 37 ° C kuluçka makinesi içinde aşama 3,7 çözülme örnekleri. P24 yakalama plakasının (% 0.05 Tween-20 ile 1 x PBS) yıkama tamponu ile 5 kez yıkayın. 50 | il / göz numune seyreltici (% 1 sığır serum albümini (BSA),% 0.2 Tween-20, RPMI-1640 içinde), daha sonra uygun oyuklara örnek 50 ul ekle. Yalnızca alay / negatif kontroller olarak numune seyreltici ile en az üç kuyu ekleyin. 4 ° C 'de 37 ° C ya da O / N C'de 2 saat süreyle inkübe edin. Kullanmadan önce taze birincil antikor çözüm hazırlayın. Birincil antikor, bir seyreltici (RPMI-1640 içinde% 12 FBS) ile stok çalışan birincil antikorun 2000 kat seyreltme: 1 olun. 96 oyuklu bir plaka içerisinde her bir örnek / kontrol başına 100 ul çözeltisi kullanılmak için yeterli hazırlamak için emin olun. Örneğin, birincil antikor worki 5 ul, tek bir 96-çukurlu plaka için yeterli solüsyon yapmak için10 ml değerindeki bir son hacim için birincil antikor seyreltici stokları ng. Yıkama tamponu ile yakalama plaka 5 kez yıkayın. Her bir oyuğa birincil antikor solüsyonu, 100 ul ekle. % 5 CO2 atmosferinde 37 ° C'de 1 saat süreyle inkübe edin. Kullanmadan önce taze ikincil antikor çözüm hazırlayın. İkincil antikor, bir seyreltici (% 7 FBS RPMI-1640 içinde% 0.01 Tween-20) ile ikincil antikor (1 mg / ml Keçi anti-tavşan HRP) ve 14,400 kat seyreltme: 1 olun. Pipetleme hataları azaltmak için, iki aşamalı bir seri seyreltme gerçekleştirin. 96 oyuklu bir plaka içerisinde her bir örnek / kontrol başına 100 ul çözeltisi kullanılmak için yeterli hazırlamak için emin olun. Örneğin, birinci ikincil antikor seyreltici 99 ul ikincil antikor 1 ul, tek bir 96-çukurlu plaka için yeterli solüsyon yapmak için. Daha sonra 10 ml değerindeki bir son hacim için ikincil antikor seyreltici ilk seyreltme 70 ul ekle. Yıkama yakalama levhası 5 timyıkama tamponu ile es. Her bir oyuğa, ikincil antikor çözeltisinin 100 ul ekle. % 5 CO2 atmosferinde 37 ° C 'de 1 saat süreyle inkübe edin. Plakayı yıkama tamponu ile 5 kez. RT TMB alt-tabaka 100 ul ekle. Işıktan korumak için kapalı bir kapta, oda sıcaklığında 30 dakika kuluçkalayın. RT durdurma çözeltisi (1 NH2 SO 4), 100 ul ekle. Her bir göze, bir mikrolevha okuyucusu kullanarak 450-650 nm'de absorbans okuyun. Her sıra enfekte veya bulaşmamış puan absorbans değerini kullanın. Absorbans değeri negatif / sahte kontrol kuyulardan okunan değerden en az üç kat daha fazladır ise bulaşıcı virüs içeren bir kuyu düşünün. Reed-Meunch yöntemi 31 kullanılarak viral stokunun TCID 50 hesaplayın. 5. Viral Büyüme Kinetiği kurulması 5.1) Monoinfection Tohum 3 x 10 5 PHA ile uyarılan PBMC / oyuk, 48 oyuklu bir plaka içerisinde/ oyuk 500 ul toplam hacim içinde s. Aşılama kadar,% 5 CO2 atmosferinde 37 ° C 'de kültür plakaları tutun. Her bir virüs için, cIMDM 2 ml 6000 IU ihtiva eden bir aşı hazırlanması. Numaralı seribaşı hücreleri inokulum (1,500 IU) 500 ul ekleyerek üç nüsha olarak kuyu aşılamak. Enfekte hücre kültürünün nihai hacim de, 1 ml / ve MOI 0.005. Kısım yedek olarak kaydedilir biri RNA izolasyonu için, iki 96-yuvalı plakalar, her kalan inokulum 200 ul. 16-24 saat boyunca bir% 5 CO2 atmosferinde 37 ° C 'de kültürleri inkübe edin. Yıkama kültürleri aşılamadan sonra 16-24 saat. Çıkarın ve kültür yüzer 750 ul atın. Taze cIMDM 750 ul ekleyin. 300 x g 'de 10 dakika süre ile plastik örtü ve spin plakaları sarın. Çıkarın ve 750 ul süpernatant atın. Taze cIMDM 750 ul ekleyin. % 5 CO2 seviyesinde 37 ° C'de inkübe edinmosphere (gün 1). Günlük günden 2 güne 7 örnek kültürleri. 1.8 ml'lik bir santrifüj tüpüne kültür yüzey 500 ul aktarın. 3,000 x g'de 1 dakika için spin. Aktarım RNA izolasyonu için 96 oyuklu iki örnek plakalara hücresiz süpernatan 200 ul, daha yedek olarak tek bir plaka tasarrufu sağlar. RNA izolasyonu kadar -80 ° C'de saklayın supernatantlar. Her kültürün 500 ul taze cIMDM ekleyin. % 5 CO2 atmosferinde 37 ° C'de inkübe edilir. Deneyin sonunda Wescodyne içine kültürleri atın. Üreticinin standart bir protokol, aşağıdaki yüzer 200 ul (örneğin, QIAamp viral RNA Mini Kit olarak kullanımı, ticari kitler) RNA izole edin. Numunelerin büyük bir sayısı için, Qiagen QIAxtractor kullanın. CDNA sentezi kadar -80 ° C'de saklayın RNA örnekleri. 5.2) cDNA Sentezi (Ters Transkripsiyon) Her RNA s içinGeniş, viral RNA'nın 10 ul (7995 5'-GTTGATCCTTTAGGTATCTTTCCACAGC-3 ', HXB2 nükleotid 7968) dNTP 1.2 nmol ve cDNA sentezi primerin 1.2 pmol ekleyin. 14 ul'lik nihai bir hacme kadar su ilave edilir. Mix ve tüpün alt kısmında sıvı toplamak için kısaca dönmeye tüp Flick. Ana karışımı hazırlanana kadar daha sonra 4 ° C'de tutun, 65 ° C'de 5 dakika süreyle inkübe karışımı. 5x birinci zincir tamponu (250 mM Tris-HCI, pH 8.3, 375 mM KCI, 15 mM MgCI2), 5 mM DTT, 120 SuperScriptIII U ve 240 U RNaz inhibitörü kullanılarak ana karışımı hazırlayın. 10 ul nihai hacme kadar su ilave edilir. Mix ve toplamak için dönmeye RNA karışımı, fiske ana karışımı 10 ul ekleyin. CDNA sentezine izin vermek üzere, 50 ° C'de 90 dakika süreyle inkübe karışımı. Ters transkriptazı inaktive edilmesi için 70 ° C'de 15 dakika boyunca inkübe edin. Gerektiğinde 4 ° C'de tutun. Karıştırmak Rnase H, fiske 2 U ekleyin ve sonra toplamak için dönerler. 20 dakika kuluçkalayın37 ° C'de ilave edildi. -20 ° C'de saklayın cDNA. 5.3) cDNA kantitasyonu qPCR Sisteminin Kullanılması Standart bir seyreltme serisi hazırlayın. / 3 x 10 6 kopyaları, seri seyreltme 10 kat pNL4-3VifA 30 kopya / ul, aşağı ul arasında yapın. Dilüsyonları için distile su kullanın. Kullanmadan önce taze standart dilüsyon serisi hazırlayın ya da küçük gruplar hazırlamak ve -20 ° C'de tutmak. Do not standartları en fazla üç kez dondurma-çözülme. 96 oyuklu bir plaka qPCR Reaksiyon ayarlayın. Her bir plaka en azından her bir cDNA örnek bir kopyasını negatif kontroller arasında, en az bir kuyu, standart bir seyreltme serisi bir üç kopya içerir ve emin olun. Her qPCR reaksiyon için, qPCR ana karışımı 12.5 ul, 0.2 uM probu, ileri ve geri primerler, 0.8 uM, her ve cDNA, 1 ul ya da (de negatif kontrol için), standart seyreltme serisi ya da su / tampon kullanır. 25 ul'lik nihai bir hacme kadar su ilave edilir. qPCR prob ışık sen olduğunusas. Kapalı bir kapta tutun. VifAB ileri primer (GGTCTGCATACAGGAGAAAGAGACT), Vifa ters primeri (5'-AGGGTCTACTTGTGTGCTATATCTCTTTT-3 ') ve VifAB probu (6FAM-5'-CTCCATTCTATGGAGACTC-3: pNL4-3VifA dayalı moleküler klonundan türetilen cDNA'nın tespit etmek için, Vifa primer sondası kullanımı '-MGBNFQ). VifAB ileri primer, prob ve VifAB VifB ters primeri (5'-CACCTGCGTGCTATACCTTTTCT-3 '): pNL4-3VifB göre klondan türetilen cDNA için, VifB primer sondası kullanılır. 2 dakika, 10 dakika boyunca 95 ° C, 15 saniye, 1 dakika için 60 ° C, 95 ° C, 40 döngü için 50 ° C'ye kadar PCR çevrim parametreleri ayarlayın. QPCR makinenin çalışması için üreticinin destek belgesini danışın. Üç nüsha standart dilüsyon serisi verileri kullanılarak standart bir eğri hesaplayın. Kopya sayısını belirlemek için, standart eğrisine cDNA örnek amplifikasyonu verilerini karşılaştırın. Dekar için üreticinin destek belgesini danışınta işleme. 5.4) Viral Üstel Büyüme Faz belirleyin X-ekseni ve Y ekseni boyunca cDNA kopya sayısı boyunca örnekleme gün viral büyüme kinetiği arsa ve viral üstel büyüme fazı tespit yani. Viral cDNA üstel ilerlemesinde numaraları artış kopyaladığınız zaman. GRC web aracı (kullanın http://indra.mullins.microbiol.washington.edu/grc/ viral büyüme oranı (g) hesaplamak için). Bu uygulamada, GRC aracı cDNA girdi olarak en az iki zaman noktasında numaraları kopyalama kabul eder ve viral büyüme oranını (g) verir. Doğru büyüme oranlarını elde etmek için (yukarıda adım 5.4.1 bakınız) üstel büyüme fazında içinde sadece zaman noktası verilerini kullanın. GRC web aracında kullanılan matematiksel modelin bir ayrıntılı bilgi için, 20 bkz. 6. Büyüme Rekabet Tahlili Tohum 3 x 10 5 </ Sup> PHA uyarımlı PBMC (veya 1 x 10 5 CEMx174 hücreleri), bir 48 oyuklu düz tabanlı plaka içinde çukur başına 500 ul toplam hacim içinde. Aşılama kadar,% 5 CO2 atmosferinde 37 ° C plaka tutun. Her virüs için, 6.000 IU içeren inokulum 3 ml hazırlamak. Çift enfeksiyonu inokulum oluşturmak için steril bir tüpe, her viral inokülüm 1.5 ml aktarın. Bir 48-yuvalı plaka içinde 3 x 10 5 hücre İkili inokulum (1,500 IU) 500 ul ekle. Son kültür hacmi de / 1 ml'dir. Kısım RNA izolasyonu için, iki 96-yuvalı plakalara inokulum 200 ul; Bir yedekleme olarak bir tabak kaydedin. 16-24 saat boyunca bir% 5 CO2 atmosferinde 37 ° C 'de İnoküle hücreleri inkübe edin. Yıkama kültürleri aşılamadan sonra 16-24 saat. Çıkarın ve kültür yüzer 750 ul atın. Taze cIMDM 750 ul ekleyin. 300 x g de 10 dakika süre ile plastik örtü ve spin plakaları sarın. Çıkarın ve 750 atın81 l yüzer madde. Taze cIMDM 750 ul ekleyin. % 5 CO2 atmosferi (gün 1), 37 ° C'de inkübe edilir. Seçim örnekleme katı aşama 5.4.1 gözlenen üslü büyüme fazında içinde en az 3 zaman noktasını dahil etmek. Her numune için, adım 5.1.7 izleyin. Bölüm 5.2 de tarif edildiği gibi cDNA sentez gerçekleştirir. QPCR kullanılarak viral varyant oranını belirler. 3 x 10 6 kopya her adımda 10 kat seyreltilmesi, üçlü olarak standart bir seri seyreltme serisi hazırlayın / 30 kopya / pNL4-3VifA ul ul. 96 oyuklu bir plaka qPCR Reaksiyon ayarlayın. Her bir levha, en az bir negatif kontrol, üç kopya halinde, standart bir seyreltme serisi, her bir cDNA numunesinin çiftleri içerdiğinden emin olun. Her qPCR reaksiyonu için, qPCR Master Mix 12.5 ul, 0.2 uM prob, 0.8 ileri uM her ve primerler ters ve cDNA 1 ul ya da standart d kullanın ilution serisi veya (negatif kontrol kuyuları için) su / tampon eklendi. 25 ul'lik nihai bir hacme kadar su ilave edilir. qPCR prob kapalı bir kapta saklayın, ışığa karşı hassastır. Negatif kontroller ve standart seyreltme serisinde ve cDNA numunesinin bir kopyası ile sinyalleri algılamak için Vifa primer-prob kullanın. CDNA numunesinin diğer kopyası ile VifB primer-prob kullanın. 15 saniye ve 1 dakika için 60 ° C, sonra 95 ° C 40 döngü, 10 dakika boyunca, daha sonra 2 dakika süre ile 50 ° C arasında 95 ° C PCR çevrim parametreleri ayarlayın ve. QPCR makinenin çalışması için üreticinin destek belgesini danışın. Standart seyreltme serisi büyütme verilerini kullanarak standart eğri hesaplayın. Kopya sayısını belirlemek için, standart eğrisine cDNA örneklerinin yükseltme verilerini karşılaştırın. Veri işleme için üreticinin destek belgesini danışın. (GRC web aracını kullanınol.washington.edu/grc/">http://indra.mullins.microbiol.washington.edu/grc/) göreceli viral uygunluğu (d) hesaplamak için. NOT: GRC aracı cDNA girdi olarak en az iki kez noktasından numaraları veya kromatogram tepe yükseklikleri kopyalama kabul eder ve iki virüs arasındaki net büyüme oranı farkı (d) verir. Aracı iki zaman noktası verileri net büyüme oranını hesaplamak mümkün olmakla birlikte, bu güçlü üç veya daha fazla zaman noktasında giriş verileri için tavsiye edilir. Üstel büyüme fazında içinde zaman noktalarında elde edilen tek verileri kullanın doğru büyüme oranları elde etmek için (adım 5.4). GRC web aracında kullanılan matematiksel modelin bir ayrıntılı bilgi için, 20 bkz. Kromatogram tepe-yükseklikleri kullanılarak viral oranlarını belirleme PCR HIV-1 VifFwd kullanılarak VifAB dizi etiketi ihtiva eden vif fragmanları amplifiye (5'-GAAAGAGACTGGCATTTGGGTCAGGG-3 '; HXB2 5266-5291 pozisyonlar) ve VifRev primerler (5'-GTCTTCT GGGGCTTGTTCCATCTGTCC-3 '; HXB2 pozisyonları 5579-5553). Her bir PCR reaksiyonu için cDNA 1 ul, 1 x NH4 tamponu, her bir primerden 1.5 mM MgCl2, 0.2 mM dNTP, U Taq Polimeraz 2.5, ve 0.45 um kullanımı. 50 ul'lik nihai bir hacme kadar su ilave edilir. 30 sn için, 15 sn için 94 ° C 'de 34 döngü izledi 1 dakikada, 1 dakika boyunca 55 ° C ve 1 dakika için 70 ° C, 94 ° C' de 3 kez 58 ° C, PCR çevrim parametreleri ayarlayın ve daha sonra 70 °, 1 dakika boyunca C ve 4 ° C'de tutun. Üreticinin protokolüne göre QIAquick PCR saflaştırma kiti kullanılarak PCR ürünleri saflaştırılır. Sanger sekanslanması için bir DNA dizileme servis sağlayıcıya saflaştırılmış PCR ürünleri gönder. Sıralama servisi tarafından sağlanmalıdır ortalama okuma kalite puanı, kontrol edin. Ortalama taban çağrı doğruluğu% 85'inden az ise, 6.10.3 için adım 6.10.1 kokan (ChromatQuan web aracını kullanınf="http://indra.mullins.microbiol.washington.edu/cgi-bin/chromatquant.cgi">http://indra.mullins.microbiol.washington.edu/cgi-bin/chromatquant.cgi ) Her zaman noktasında viral oranını hesaplamak için. aracı dizisi izleme dosyası (* .ab1) ve ilgi nükleotid sitesine dizisi 5 'gerektirir. aracı belirtilen yerinde tepe yoğunluğunu ölçer. tepe yoğunluğuna oranı, iki virüs (Şekil 4B) rasyon karşılık gelir. GRC web aracı (kullanın http://indra.mullins.microbiol.washington.edu/grc/ viral göreli uygunluğu (d) hesaplamak için girdi olarak) ve kaydedilmiş pik şiddetlerini. Adım 6.10.6 Bkz. 20