ヒト免疫不全ウイルスの複製フィットネスを決定するためのペアごとの成長競合アッセイ

注：このプロトコルは、以下に説明するように、任意の患者を特定できる情報は含まれていないため、ワシントン大学の治験審査委員会によるヒトテーマ研究やヒト対象の部門とはみなされません。 キメラHIV-1 NL4-3分子クローンの1建設 1.1）を増幅挿入DNA断片キメラプライマーを設計します。 5 'の両方の半分フォワードおよびリバースプライマーは、断片が挿入される時にHIV-1ベクター配列を含みます。プライマーの3 '側半分は、挿入配列（ 図2）の端部を含む必要があります。キメラプライマー配列は、元のオープンリーディングフレームを保持していることを確認します。 以上、60℃に等しい融点、約50％のGC含量、及びプライマーダイマー、ヘテロおよび/またはヘアピン構造を形成する傾向が低いと、長さのプライマー、少なくとも20塩基を使用してください。これらの性質を評価OligoAnalyzer Webツールを使用して（ https://www.idtdna.com/analyzer/Applications/OligoAnalyzer/ ）。 使用するPCR 27及びキメラプライマーは、挿入DNA（ 図2）を増幅しました。各PCR反応は、1×高忠実度緩衝液、0.2mMのdNTPを、高忠実度DNAポリメラーゼの1 U、フォワードキメラプライマー0.5μM、逆キメラプライマー0.5μM、および挿入領域を有するDNAサンプルの1 PG0のNGを使用しています。 50μlの最終容量までのdH 2 Oを追加します。 次のように熱サイクリングステップを設定します。10秒間98℃での最初のDNA変性ステップを実行します。 20秒間の2つのプライマーの最低溶融温度より3℃で10秒、DNAアニーリング98℃のDNA変性の30サイクルで増幅します。 72℃で10分間の最終伸長を行います。 4°Cで保存したPCR産物。 からのPCR産物の5μLを取ります前のステップとアガロースゲル電気泳動28を実行します。 DNAサイズマーカーとしての0.7％アガロースゲル、1×TAE緩衝液（40mMのトリス – 酢酸、1mMのEDTA）、0.5 / mlのエチジウムブロマイド（EtBrを）最終濃度と1キロバイトラダーを使用します。電極間に5 V / cmの距離に電源電圧を設定します。ローディング色素が約2/3ゲル長の通って移動するときに電気泳動を停止します。ゲルドキュメンテーションシステム28を用いてゲルを可視化します。 注：EtBrをが疑われる発がん性物質であり、適切に金融機関の規制ごとに、廃棄しなければなりません。 EtBrを含有ゲルを取り扱う際の手袋を常に着用する必要があります。仕上げは材料を含有し、交差汚染を防止するために、他の材料や装置を取り扱う前にEtBrをを処理した後、新しい手袋に変更します。 所望のPCR産物に対応する大き​​さの唯一のDNAバンドが検出された場合、そのようなQIAクイックPCR精製キットアコードのような市販のキットを用いてPCR産物の残りを精製製造業者のプロトコルにる。 他の非特異的バンドも存在する場合、分取ゲル電気泳動を実行するためにPCR産物の残りを使用。ステップ1.1.4で指定された同じパラメータと条件を使用してください。ゲルウェルは〜PCR産物の45μLをロードするのに十分な大きさであることを確認してください。目的のバンドを切り出し、製造業者のプロトコルに従って、QIAquickゲル抽出キットを用いてゲルからDNAを抽出します。 1.2））（完全長感染性HIV-1サブタイプB VectorにpNL4-3を挿入断片を導入 PCRプライマーとしてステップ1.1.5から精製したPCR産物を使用してください。 1つのPCR反応において、鋳型DNAとしてpNL4-3VifA 20および他の反応（ 図2）において鋳型としてpNL4-3VifB 20を使用する使用。各PCR反応のために、1×高忠実度緩衝液、0.2mMのdNTPを、高忠実度DNAポリメラーゼの2 Uを使用し、プライマーDNAと鋳型DNA 50ngの500ngの最終体積で50μLの梅。 10分間72℃、続いて10分間、1分、72℃、30秒間、98℃、10秒間、98℃で35サイクル、48℃：熱サイクルにパラメータを設定します。 PCR反応の50μlにのDpn Iの10 Uを追加し、テンプレートDNAを消化し ​​、37℃で1時間インキュベートします。 例えば 、プラスミドDNAがメチル化コンピ細菌株から単離されていることを確認し、TOP10化学的にコンピテントな大腸菌 。 私は有能な細菌細胞を形質転換するために、製品を消化のDpnを使用してください。 TOP10化学的コンピテントE.と熱ショック変換を使用しますコリ 、製造業者のプロトコルに従って。組換えプラスミドを含む細菌細胞を選択するために、100 mg / Lのカルベニシリンを含むルリアブロス（LB）培養プレートを使用しています。 〜10十分に分離したコロニーを選択し、3ミリリットル100 mg / Lのカルベニシリンを含むLB液体培地で個別に成長し、30℃でインキュベートシェーカーO / N。 使用のQIAprepは、製造業者のプロトコルに従って、細菌の液体培養物からプラスミドDNAを単離するためにミニプレップキットをスピン。 プラスミドDNAは、適切な挿入物を含んでいるかどうかを決定するために、二重制限酵素消化を使用して29。制限部位の一つが唯一の挿入領域内に存在し、他の制限部位が挿入領域の外側に、HIV-1ベクター中に一度だけ存在することを確認します。 10μlの最終反応容量でプラスミドDNAのダイジェスト少なくとも300 ngの。選択した制限酵素の製造業者のプロトコールに従って、制限緩衝液、インキュベーション温度、インキュベーション時間を選択します。消化したDNAの9μLを取り、ステップ1.1.4で説明したようにゲル電気泳動を実行します。予想されるサイズのDNAバンドを持っている組換えプラスミドを選択します。 サンガー配列決定により、組換えプラスミドの配列完全性を確認してください。まれ、不要な一方、突然変異は、PCR反応中に導入することができます。 配列のプラスミドDNAの両方の鎖。配列決定プライマーを設計するために、ステップ1.1.1.1の手順に従ってください。また、その前方を確保し、それぞれ、組換えプラスミドの上流と下流の挿入領域の配列決定プライマーのアニーリング、少なくとも50塩基対を逆転。 市販のDNAシーケンシングサービスプロバイダにプラスミドDNAと配列決定プライマーを提出してください。サービスプロバイダによって指定されるようにDNAサンプルとプライマーを準備します。 製造業者のプロトコルに従ってエンドトキシンフリーのプラスミドDNAキットを用いて変異したプラスミドDNAのエンドトキシンフリーのストックを作ります。次のステップでトランスフェクションのためにエンドトキシンを含まないプラスミドDNAの少なくとも1μgのを準備します。 1.3）小規模変異経由部位特異的突然変異誘発を導入前方に重ねて変異プライマーを設計し、希望mutatを含むリバースプライマーイオン（複数可）。位置ベース（s）は、置換、挿入、またはプライマーの途中で削除された、10-15の相同な塩基によって隣接されます。ステップ1.1.1.1の指示に従ってください。 変異プラスミドを合成するために、PCRを使用します。各PCR反応は、1×高忠実度緩衝液を使用し、10mMのdNTPを、高忠実度DNAポリメラーゼの2 U、フォワード変異原プライマー0.5μM、逆変異原プライマー0.5μMおよびキメラpNL4-3VifB 50ngの、ステップ1.2.6から、50μlの最終容量中。 10分間72℃、続いて10分間、1分、72℃、30秒間、98℃、10秒間、98℃で25サイクル、48℃：熱サイクルにパラメータを設定します。 繰り返し手順1.2.6に1.2.2。 トランスフェクションを使用してウイルスストックの2世代必要なウイルスストック希望とプラスミドDNAの量を計算します。 10 4 IU / ml以上のウイルス力価を有するウイルスストック1.8mlの成長競争ASSA二組のために十分ですYS、monoinfections含め、それぞれが三連で行われ。 6ウェルプレート中で行われ、トランスフェクションのために、約1.8ミリリットルの上清をウェルあたり採取します。プラスミドDNA1μgの6ウェルプレートで行った各トランスフェクションのために必要とされます。 6ウェルプレートの各ウェルについては、 例えば 、トランスフェクション混合物100μlの準備をします。、1μlのX-tremeGENE 9トランスフェクション試薬（または同等の製品）からなる、プラスミドDNAおよび無血清DMEM1μgの。 ウェルあたり1μgのプラスミドDNAを使用して必要なプラスミドDNAの量を決定します。プラスミドDNAの最終濃度は、少なくとも50 ng /μLであることを確認してください。 よく式を用いごとに必要とされているどのくらいの無血清培地（DMEM）を決定しますμL= 100μlのDMEMの総容量 – μlのDNA量を。 6ウェルプレートに10 6 HEK 293T-17（ATCC）細胞/ウェルで増殖培地（DMEM + 10％ウシ胎児血清（FBS））を2mlを加えます。 37℃で1時間インキュベートします5％CO 2雰囲気 。必要に応じて（ステップ2.1で決定された）など、多くの井戸をシード。 トランスフェクション混合物を調製し、アリコート無血清DMEMの適切な量、上で計算したように、1.8ミリリットルのポリプロピレンマイクロ遠心チューブに、その後、トランスフェクション試薬を追加します。 ピペット試薬が直接培地溶液に、マイクロチューブのプラスチック表面にそれを追加しないでください。最後のプラスミドDNAを追加します。上下ピペットで静かに溶液を混合します。トランスフェクション複合体の形成を可能にするために、RT（25℃〜15℃）で15分間インキュベートします。 6ウェルプレートに播種した細胞に滴下様式で、混合物を追加します。ゆっくり振るまたはトランスフェクション複合体の均一な分布を確実にするために井戸を旋回。 プラスチックラップでシールプレート。 48時間、5％CO 2雰囲気中で37℃で培養物をインキュベートします。 慎重に15ミリリットルチューブthrouに上清を収集し、転送するためにピペットを使用して、0.22μmフィルタートップをGH。 蓋ゴムガスケットと1.8ミリリットルマイクロチューブに濾過した上清250μlの以上を転送するためにピペットを使用してください。 ストアは、使用するまで-80℃で上清を濾過しました。 3.末梢血単核細胞（PBMC）のウイルスストックの感染力価を決定しますフィトヘマグルチニン（PHA）でのPBMCを刺激します。つのウイルスストック、シード完全イスコフ改変ダルベッコ培地中で2×10 6のPBMC当たり（cIMDMを、ヒトインターロイキン2を20 U / mlを補充したIMDM（HIL-2）、10％ウシ胎児血清および1％ペニシリン/ストレプトマイシン）を補充しPHA（1.5μgの/ ml）で。 2×10 6細胞/ mlの種子のPBMC。 72時間、5％CO 2雰囲気中、37℃でのPBMCをインキュベートします。 収穫PHAはPBMCを刺激しました。 50mlコニカルチューブに非接着性のPHA-PBMCを転送します。 10分間、228×gでチューブをスピン。慎重disruptinずに上清を除去G細胞ペレット。 cIMDMで2×10 5個のPBMC / mlの最終濃度まで細胞ペレットを再懸濁します。 シード2×10 4 PHAは、丸底96ウェルプレートに100μl/ウェルcIMDMに/ウェルのPBMCを刺激しました。 ウイルスストックの1:10希釈液を作ります。そして、第1希釈したストックから、96ウェルマスタープレートに12 3倍連続希釈液を作ります。この希釈スキームは、1ml当たり4月 10 日から6月 10 日まで感染単位（IU）の範囲内でウイルス力価を検出することをお勧めします。 例えば、1.5mlチューブに180μlの培地にウイルスストックの20μLを加えます。慎重にピペットで希釈を混ぜます。そして、第一のウェル180μlの培地に希釈した株式の90μLを転送し、ピペッティングでよく混ぜます。 次のウェルに180μlのメディアに現在のウェルから11回以上90μLを転送することにより、希釈系列を続けます。 10 6 IU / mlの力価よりも高い場合には最初の希釈を増減またはより低い10 4 IU / mlのそれぞれ、期待されています。 四重に（ステップ3.3から）マスター希釈プレートから播種したPBMCプレートに段階希釈したウイルスストックの40μLを加えます。 16〜24時間、5％CO 2雰囲気中、37℃でプレートをインキュベートします。 慎重に、各ウェルから100μlの上清を除去し、200μl/ウェルの総体積に新鮮cIMDM160μlのと交換してください。 5％CO 2雰囲気（1日目）で37℃で培養します。 日4、7、10および13の転送上の各ウェルに100μlの破壊緩衝液（PBS中の2％トリトンX-100）からの上清100μl、新鮮なcIMDM100μlと交換してください。 -20℃で上清を保存します。 サンプリングし、力価が安定するまで3日ごとに新鮮なcIMDMを追加してください。 7日目と1を用いたp24 ELISAによってウイルスストックの50％組織培養感染量（TCID 50）を決定3つのサンプルは、ステップ4で説明しました。 13日目から得られたTCID 50は、7日目から力価よりも明らかに高い場合、ウイルスストックは拡大するより長い時間が必要な場合があります。 2つのサンプリングの時点からの感染力価が安定（または減少）になるまで、それ以降のサンプルを用いたp24 ELISAを繰り返します。最高の力価を有するサンプルから株式を選択します。 ウイルス感染力価を決定するためのHIV-1のp24 4. ELISA（酵素結合免疫吸着アッセイ）検出注：以下のプロトコルは、我々の研究室30で製造したp24抗原捕捉プレートを使用して開発されました。市販のHIV-1のp24 ELISAプレート/キットはまた、製造業者のプロトコールに従って使用することができます。 サンプルで作業をする前に、一次抗体（ウサギ抗HIV-1 SF2 p24を抗血清）の作業ストックを準備します。 室温で解凍のp24抗血清。 phosphat 10％FBS 2mlのグリセロール2.5mlのを混ぜますE緩衝生理食塩水（PBS）。 抗血清0.5 mlを加え、混合します。 ストア-20℃でアリコートの1ミリリットル。 37℃のインキュベーターのステップ3.7からの雪解けサンプル。 P24捕捉プレートを（0.05％のTween-20を有する1×PBS）洗浄緩衝液で5回洗浄します。 その後、適切なウェルに50μlのサンプルを追加し、（RPMI-1640で、1％ウシ血清アルブミン（BSA）が0.2％のTween-20）を50μl/ウェルの試料希釈剤のを追加します。唯一のモック/陰性対照としてサンプル希釈剤で少なくとも3つのウェルを含みます。 4℃で37°CまたはO / Nで2時間インキュベートします。 使用前に、新鮮な一次抗体溶液を準備します。一次抗体の希釈液（RPMI-1640中で12％FBS）を使用して株式を働いた一次抗体の2000倍希釈：1にします。 96ウェルプレート中のウェルの各サンプル/対照あたり100μlの溶液を使用するために十分に準備することを確認してください。 例えば、一次抗体workiの5μlを添加、1枚の96ウェルプレートのための十分な解決策を作るために10ミリリットルの最終容量のための一次抗体希釈液に株式をngの。 洗浄バッファーで捕獲プレートを5回洗浄します。 各ウェルに一次抗体溶液100μlを追加します。 5％CO 2雰囲気中、37℃で1時間インキュベートします。 使用前に、新鮮な二次抗体溶液を準備します。二次抗体希釈液（7％のFBS、RPMI-1640で0.01％のTween-20）を使用した二次抗体（1 mg / mlのヤギ抗ウサギHRP）の14,400倍希釈：1にします。ピペッティングの誤差を低減するために、二段階連続希釈を行います。 96ウェルプレート中のウェルの各サンプル/対照あたり100μlの溶液を使用するために十分に準備することを確認してください。 例えば、第1の2次抗体希釈液の99μlにした二次抗体の1μlを添加、1枚の96ウェルプレートのための十分な溶液を作製します。その後、10ミリリットルの最終容量二次抗体希釈液に最初の希釈液70μlを添加します。 ウォッシュ捕獲プレート5ティム洗浄緩衝液でES。 各ウェルに二次抗体溶液100μlを加えます。 5％CO 2雰囲気中、37℃で1時間インキュベートします。 洗浄緩衝液でプレートを5回洗浄します。 RT TMB基質100μlを追加します。光から保護するために密閉容器中、室温で30分間インキュベートします。 RT停止溶液100μl（1 NH 2 SO 4）を追加します。 各ウェルマイクロプレートリーダーを使用して450〜650 nmの吸光度を読みます。各だけでなく、感染または感染していないスコアに吸光度の値を使用してください。吸光度の値が負/モック対照ウェルから読み取った値よりも少なくとも3倍高い場合、感染性ウイルスを含むことをよく考えてみましょう。リードMeunch法31を使用してウイルスストックのTCID 50を計算します。 5.ウイルス増殖速度論を確立 5.1）単一菌感染シード3×10 5 PHA刺激PBMC /ウェルで48ウェルプレート中500μL/ウェルの全容量の。接種まで、5％CO 2雰囲気中で37℃で培養プレートを保管してください。 各ウイルスについて、cIMDM 2mlに6,000 IUを含む接種材料を準備します。 播種した細胞に接種物を500μl（1,500 IU）を追加することで、三連のウェルに接種。感染細胞培養物の最終容量は/ウェル1 mlであるとMOIが0.005です。 アリコートバックアップとして保存されて一方がRNA単離のための2つの96ウェルプレートのそれぞれの残りの接種材料を200μl。 16〜24時間、5％CO 2雰囲気中で37℃で培養物をインキュベートします。 洗浄培養接種後16〜24時間。 培養上清750μlのを削除して破棄します。 新鮮cIMDMの750μlを添加します。 300×gで10分間ラップとスピンでプレートをラップします。 750μlの上清を除去し、廃棄します。 新鮮cIMDMの750μlを添加します。 5％CO 2で37℃でインキュベートしますmosphere（1日目）。 毎日の2日目から7日目のサンプルの文化。 1.8ミリリットル遠心管に培養上清500μlのを転送します。 3,000×gで1分間スピン。 再びバックアップとして一つのプレートを保存し、RNA単離のための2つの96ウェルサンプルプレートに、無細胞上清200μlのを転送します。 RNAの単離まで-80℃で保存上清。 各培養物に500μlの新鮮なcIMDMを追加します。 5％CO 2雰囲気中、37℃でインキュベートします。 実験の終了時にWescodyneに文化を捨てます。 メーカーの標準プロトコルに従って（例えば、のQIAampウイルスRNAミニキットなどの市販のキットを使用）して上清を200μlからRNAを分離します。多数のサンプルについては、キアゲンQIAxtractorを使用します。 cDNA合成まで-80℃で保存したRNAサンプル。 5.2）cDNA合成（逆転写） 各RNAのための十分な、ウイルスRNAの10μlに（7995に5'-GTTGATCCTTTAGGTATCTTTCCACAGC-3 '、HXB2のヌクレオチド7968）のdNTP 1.2ナノモルおよびcDNA合成プライマーの1.2ピコモルを、追加します。 14μlの最終容量に水を追加します。混合し、チューブの底に液体を収集するために簡単にスピンし、チューブをフリック。 マスターミックスが調製されるまで4℃で保持し、65℃で5分間混合物をインキュベートします。 5X第一鎖緩衝液（250 mMトリス-塩酸、pHが8.3、375のKCl、15mMのMgCl 2を）、5mMのDTT、120 SuperScriptIIIのUと240 UのRNase阻害剤を使用してマスターミックスを調製します。 10μlの最終容量に水を追加します。 、RNA混合物に混合し、収集するためにスピンするフリックをマスターミックス10μlのを追加します。 cDNAの合成を可能にするために、50℃で90分間混合物をインキュベートします。逆転写酵素を不活性化するために70℃で15分間インキュベートします。必要に応じて、4℃で保持します。 混合するためにRNアーゼH、フリックの2 Uを追加し、収集するためにスピン。 20分間インキュベート37℃。 -20℃で保存するcDNA。 5.3）のcDNA定量は定量PCRシステムを使用しました標準希釈シリーズを準備します。 3×10から6コピーが/ pNL4-3VifAの30コピー/μL、までμlで、10倍連続希釈してください。希釈液を蒸留水を使用してください。使用前に新たな標準希釈系列を準備したり、小さなバッチを調製し、-20℃で維持します。凍結融解しないでください標準を3回を超えて。 96ウェルのqPCR反応プレートを設定します。各プレートは、少​​なくとも一つの陰性対照のウェル、標準希釈シリーズの三連、各cDNAサンプルの少なくとも重複が含まれていることを確認してください。 各定量PCR反応のために、定量PCRマスターミックス12.5μlの、0.2μMのプローブ、フォワードおよびリバースプライマーの0.8μMのそれぞれのcDNAの1μlあるいは（よく負の制御用）標準希釈系列または水/緩衝液を使用しています。 25μlの最終容量に水を追加します。定量PCRプローブは、光銭ですsitive。密閉容器に保管してください。 VifABフォワードプライマー（GGTCTGCATACAGGAGAAAGAGACT）、VifAリバースプライマー（5'-AGGGTCTACTTGTGTGCTATATCTCTTTT-3 '）とVifABプローブ（6FAM-5'-CTCCATTCTATGGAGACTC-3：pNL4-3VifA基づく分子クローンに由来するcDNAを検出するために、VifAプライマー·プローブを使用します「-MGBNFQ）。 VifABフォワードプライマー、VifABプローブとVIFBリバースプライマー（5'-CACCTGCGTGCTATACCTTTTCT-3 '）：pNL4-3VifBベースのクローン由来のcDNAについて、VIFBプライマー – プローブを使用しています。 2分間、10分間、95°C、15秒、1分、60°C、95°Cの40サイクル、50℃でPCRサイクリングパラメータを設定します。定量PCR機の動作については、メーカーのサポートドキュメントを参照してください。 三重標準希釈系列からのデータを使用して標準曲線を計算します。コピー数を決定するために、標準曲線をcDNAサンプルの増幅データを比較します。ダについては、製造元のサポートドキュメントを参照してくださいTA処理。 5.4）ウイルス指数増殖期を決定します X軸およびY軸に沿ってcDNAコピー数に沿ってサンプリング日とプロットウイルスの増殖速度と、すなわち 、ウイルスの対数増殖期を識別する。、ウイルスcDNAは指数進行の数の増加をコピーします。 GRC Webツール（使用http://indra.mullins.microbiol.washington.edu/grc/をウイルス増殖率（g）を計算します）。このアプリケーションでは、GRCツールは、cDNAは、入力として、少なくとも2つの時点から番号をコピーし、ウイルスの増殖速度（g）を出力する受け付けます。正確な成長率を得るために、（上記の手順5.4.1を参照）指数増殖期内でのみ時刻データを使用してください。 GRC Webツールで使用される数学的モデルの詳細については、20を参照してください。 6.成長競合アッセイシード3×10 5 </ SUP> PHA刺激PBMC（または1×10 5 CEMx174細胞）48ウェル平底プレート中のウェルあたり500μlの全容量。 接種まで、5％CO 2雰囲気中37℃でプレートを保管してください。 各ウイルスについて、6,000 IUを含む接種材料の3ミリリットルを準備します。 二重感染接種物を作成するために滅菌チューブに各ウイルス接種の1.5ミリリットルを転送します。 48ウェルプレートに3×10 5個の細胞に二重の接種材料（1,500 IU）の500μlを添加します。最終培養容積は十分に1 / mlです。アリコートをRNA単離のための2つの96ウェルプレートに接種物200μlの。バックアップのような1つのプレートを保存します。 16〜24時間、5％CO 2雰囲気で37℃で接種した細胞をインキュベートします。 洗浄培養接種後16〜24時間。 培養上清750μlのを削除して破棄します。 新鮮cIMDMの750μlを添加します。 300×gで10分間、ラップとスピンでプレートをラップします。 750を取り外し、廃棄81; L上清。 新鮮cIMDMの750μlを添加します。 5％CO 2雰囲気（1日目）で、37℃でインキュベートします。 選択サンプリング時間は、ステップ5.4.1において観察指数増殖期中に少なくとも3時間ポイントを含めます。 各サンプリングのために、ステップ5.1.7に従ってください。 5.2節で説明したようにcDNA合成を行います。 定量PCRを用いてウイルスの変異率を決定します。 30コピー/ pNL4-3VifAのμlにμlの3×10 6コピー/から各ステップで10倍に希釈し、三連で標準シリアル希釈系列を調製します。 96ウェルのqPCR反応プレートを設定します。各プレートは、少​​なくとも一つの陰性対照、三連での標準希釈系列、各cDNAサンプルの複製が含まれていることを確認してください。 各定量PCR反応のために、定量PCRマスターミックス12.5μlの、0.2μMのプローブ、0.8μMのフォワードのそれぞれを使用して、プライマーおよびcDNAまたは標準Dの1μLを逆転 ilutionシリーズまたは（陰性対照ウェル用）水/バッファ。 25μlの最終容量に水を追加します。定量PCRプローブは、密閉容器に保管し、光に敏感です。 陰性対照及び標準希釈系列およびcDNAサンプルの1重複して信号を検出するVifAプライマー – プローブを使用してください。 cDNA試料の他の重複とVIFBプライマー – プローブを使用してください。 10分間、次いで95℃、2分間50℃でPCRサイクリングパラメータを設定し、1分15秒、60℃、95℃、40サイクル。定量PCR機の動作については、メーカーのサポートドキュメントを参照してください。 標準希釈系列から増幅データを使用して標準曲線を計算します。コピー数を決定するために、標準曲線をcDNAサンプルの増幅データを比較します。データ処理のための製造元のサポートドキュメントを参照してください。 （GRC Webツールを使用して、ol.washington.edu/grc/">http://indra.mullins.microbiol.washington.edu/grc/）相対ウイルス適応度（D）を算出します。 NOTE：GRCツールは、cDNAは、入力として、少なくとも2つの時点から、番号またはクロマトグラムのピーク高さをコピーし、2つのウイルス間の正味の成長速度の差（d）を出力する受け付けます。ツールは、2つの時刻データからの正味の成長率を算出することができるが、それを強く3以上の時点からのデータを入力するために推奨されます。指数増殖期内の時点から得られたデータのみを使用して正確な成長速度を得る（ステップ5.4参照）。 GRC Webツールで使用される数学的モデルの詳細については、20を参照してください。 クロマトグラムのピーク高さを用いてウイルスの比率を決定します PCR HIV-1を増幅VIF VifFwd用いVifAB配列タグを含むフラグメント（5'-GAAAGAGACTGGCATTTGGGTCAGGG-3 '; HXB2の位置5266から5291）とVifRevプライマー（5'-GTCTTCT GGGGCTTGTTCCATCTGTCC-3 '; HXB2位置5579から5553）。 各PCR反応のために、1μlのcDNA、1×NH 4緩衝液、各プライマーの1.5のMgCl 2、0.2mMのdNTPを、UのTaqポリメラーゼの2.5、および0.45μMを使用します。最終体積50μlに水を追加します。 30秒間、15秒間、94℃で34サイクル、続いて1分間、1分間55°C、1分間70°C、94°Cで3サイクル58°CのPCRサイクリングパラメータを設定し、そしてその後、70℃1分間、C、および4℃で保持します。 製造業者のプロトコールに従ってキアクイックPCR精製キットを用いてPCR産物を精製します。 サンガー配列決定のためのDNAシークエンシングサービスプロバイダに精製したPCR産物を提出してください。 シークエンシングサービスによって提供されるべきである平均読み取り品質スコアを、確認してください。平均ベースコール精度が85％未満である場合に、6.10.3のステップ6.10.1をやり直します （ChromatQuan Webツールを使用して、f="http://indra.mullins.microbiol.washington.edu/cgi-bin/chromatquant.cgi">http://indra.mullins.microbiol.washington.edu/cgi-bin/chromatquant.cgi )各時点でのウイルスの比率を算出します。このツールは、配列トレースファイル（* .ab1）と目的のヌクレオチド部位に配列5 'を必要とします。ツールは、指定されたサイトでのピーク強度を測定します。ピーク強度の比は、2つのウイルス（ 図4B）の比に相当します。 GRC Webツール（使用http://indra.mullins.microbiol.washington.edu/grc/ウイルス相対適応度（D）を計算するための入力として）、記録ピーク強度を。ステップ6.10.6を参照してください。20