Pairwise crescita Concorso test per la determinazione della Fitness replica del virus dell'immunodeficienza umana

NOTA: Il protocollo, come descritto di seguito, non comprende le informazioni che ti identificano pazienti e non è quindi considerata soggetti umani di ricerca presso l'Università di Washington Institutional Review Board o soggetti umani Division. 1. Costruzione di chimerico HIV-1 NL4-3 cloni molecolari 1.1) Amplify Inserisci DNA Fragment Progettare primer chimerici. Il 5 'metà di entrambi avanti e invertire primer contengono una sequenza di HIV-1 vettore, al quale verrà inserito il frammento. La 'metà dei primers 3 deve contenere la fine della sequenza dell'inserto (Figura 2). Verificare che la sequenza di innesco chimerico conserva le originali quadri di lettura aperti. Utilizzare primers almeno 20 basi di lunghezza, con una temperatura di fusione superiore o uguale a 60 ° C, ~ 50% di contenuto di GC, e una bassa tendenza a formare dimeri di primer, eterodimeri e / o strutture forcella. Valutare queste proprietàutilizzando lo strumento web OligoAnalyzer ( https://www.idtdna.com/analyzer/Applications/OligoAnalyzer/ ). Uso PCR 27 ei primer chimerici per amplificare DNA inserito (figura 2). Per ogni reazione di PCR, utilizzare 1X buffer di alta fedeltà, 0.2 dNTP mm, 1 U di alta fedeltà DNA polimerasi, 0,5 micron di primer forward chimerico, 0,5 micron di primer chimerico inverso, e 1 pg0 ng di campione di DNA trasportano regione inserita. Aggiungere dH 2 O ad un volume finale di 50 pl. Impostare passi cicli termici come segue: Eseguire un passo iniziale denaturazione del DNA a 98 ° C per 10 sec. Amplificare con 30 cicli di denaturazione del DNA a 98 ° C per 10 sec e DNA ricottura a 3 ° C superiore alla temperatura di fusione più bassa delle due primers per 20 sec. Eseguire una estensione finale a 72 ° C per 10 min. Conservare prodotti di PCR a 4 ° C. Prendere 5 ml di prodotti di PCR dallapasso precedente ed eseguire l'elettroforesi su gel di agarosio 28. Utilizzare un gel allo 0,7% di agarosio, tampone 1x TAE (40 mM Tris-acetato, 1 mM EDTA), 0,5 mg / ml di etidio bromuro (EtBr) concentrazione finale e 1 kb scala come il marcatore dimensioni del DNA. Set tensione di alimentazione di 5 V / cm di distanza tra gli elettrodi. Arrestare il elettroforesi quando il carico colorante migra attraverso circa 2/3 della lunghezza del gel. Visualizzare il gel utilizzando un sistema di documentazione gel 28. NOTA: EtBr è un sospetto cancerogeno e deve essere correttamente smaltiti, da regolamento dell'istituzione. I guanti devono essere sempre indossati quando si maneggia gel contenenti EtBr. Cambiare per nuovi guanti dopo EtBr movimentazione finitura contenenti materiale e prima di manipolare altri materiali o attrezzature per evitare la contaminazione incrociata. Se viene rilevata una sola banda di DNA di dimensioni corrispondenti al prodotto di PCR desiderato, purificare il resto del prodotto PCR utilizzando un kit commerciale come QIAquick PCR Purification Kit accordozione ai protocolli del produttore. Se altri, bande non specifici sono presenti anche, utilizzare il resto del prodotto della PCR per eseguire elettroforesi su gel preparativo. Utilizzare gli stessi parametri e le condizioni di cui al punto 1.1.4. Assicurarsi che il pozzo gel è abbastanza grande da caricare ~ 45 ml di prodotti di PCR. Tagliare la banda di interesse ed estrarre il DNA dal gel utilizzando QIAquick kit estrazione gel secondo protocolli del produttore. 1.2) introdurre l'inserto Frammento in tutta lunghezza infettiva dell'HIV-1 sottotipo B Vector (pNL4-3) Utilizzare prodotti di PCR purificati dal punto 1.1.5 come primer PCR. Utilizzare pNL4-3VifA 20 come stampo di DNA in una reazione PCR e utilizzare pNL4-3VifB 20 come modello nella altra reazione (Figura 2). Per ciascuna reazione di PCR, utilizzare 1x tampone alta fedeltà, 0.2 mM dNTPs, 2 U di alta fedeltà polimerasi DNA, 500 ng di DNA primer e 50 ng di DNA stampo in un volume finaleume di 50 ml. Impostare i parametri del ciclo termico a: 98 ° C per 30 sec, 35 cicli a 98 ° C per 10 sec, 48 ° C per 1 min e 72 ° C per 10 minuti, seguito da 72 ° C per 10 min. Aggiungere 10 U di Dpn I a 50 microlitri della reazione PCR e incubare a 37 ° C per 1 ora per digerire il DNA stampo. Assicurarsi che il DNA plasmide è isolato da un ceppo batterico metilazione competente, ad es., TOP10 chimicamente competente Escherichia coli. Uso Dpn I digerito prodotto per trasformare cellule batteriche competenti. Utilizzare trasformazione heat-shock con TOP10 chimicamente competente E. coli, secondo il protocollo del produttore. Per selezionare, per cellule batteriche contenenti il ​​plasmide ricombinante, utilizzare Luria Broth (LB) piastre di coltura contenente 100 mg / L carbenicillina. Raccogliere ~ 10 colonie ben separate e crescere ogni separatamente in 3 ml di terreno LB liquido contenente 100 mg / L carbenicillina e incubare a 30 ° C in unshaker O / N. Utilizzare QIAprep Spin kit Miniprep per isolare DNA plasmidico dalla coltura liquida batterica, secondo il protocollo del produttore. Utilizzare doppia digestione di restrizione 29 per determinare se il DNA plasmide contiene il corretto inserimento. Assicurarsi che uno dei siti di restrizione esiste soltanto all'interno della regione inserita e l'altro sito di restrizione esiste solo una volta nel vettore HIV-1, al di fuori della regione inserita. Digest almeno 300 ng di DNA plasmidico in un volume finale di reazione di 10 microlitri. Selezione buffer di restrizione, temperatura di incubazione e tempo di incubazione secondo protocollo degli enzimi di restrizione selezionate del produttore. Prendete 9 ml di elettroforesi del DNA e gel run digerito come descritto al punto 1.1.4. Selezionare plasmidi ricombinanti che hanno bande di DNA delle dimensioni previste. Confermare l'integrità sequenza dei plasmidi ricombinanti di sequenziamento Sanger. Mentre rari, indesideratimutazione (s) può essere introdotto durante le reazioni PCR. Sequenza entrambi i filamenti del DNA plasmide. Seguire le istruzioni riportate al punto 1.1.1.1 per progettare primer di sequenziamento. Inoltre, affinché il forward e reverse primer di sequenziamento ricottura almeno 50 bp a monte ea valle della regione inserita nel plasmide ricombinante, rispettivamente. Invia plasmide DNA e primer di sequenziamento di un fornitore di servizi di sequenziamento del DNA commerciale. Preparare campione di DNA e primer come specificato dal fornitore del servizio. Fare un magazzino privo di endotossine del DNA plasmide mutato utilizzando un kit di DNA plasmide gratuito Endotoxin secondo il protocollo del produttore. Preparare almeno 1 mg di privo di endotossine DNA plasmidico per trasfezione nel passaggio seguente. 1.3) Introdurre in piccola scala mutazioni Via mutagenesi sito-specifica Progettare primer mutageni con sovrapposizione in avanti e reverse primer contenenti la mutat desiderataion (s). Posizionare la base (s) da sostituire, inserito o eliminato a metà del primer, affiancato da 10-15 basi omologhe. Seguire le istruzioni riportate al punto 1.1.1.1. Utilizzare PCR per sintetizzare plasmidi mutanti. Per ogni reazione di PCR, utilizzare 1x tampone alta fedeltà, dNTP 10 mm, 2 U di alta fedeltà DNA polimerasi, 0,5 micron di primer forward mutageno, 0,5 micron di primer mutageno inversa e 50 ng di pNL4-3VifB chimerico, dal punto 1.2.6 , in un volume finale di 50 pl. Impostare i parametri del ciclo termico a: 98 ° C per 30 sec, 25 cicli a 98 ° C per 10 sec, 48 ° C per 1 min e 72 ° C per 10 minuti, seguito da 72 ° C per 10 min. Ripetere il punto 1.2.2 a 1.2.6. 2. Generazione di Viral Archivio Utilizzando Trasfezione Calcolare la quantità di virus azione desiderata e plasmide DNA richiesto. Con un titolo virale di 10 4 IU / ml o superiore, 1,8 ml di virus è sufficiente per due serie di concorso crescita assays, compresi monoinfections, ogni fatto in triplice copia. Per una trasfezione fatto in un 6-pozzetti, circa 1,8 ml surnatante viene raccolto per pozzetto. Occorre Uno pg di DNA plasmidico per ogni trasfezione fatto in una piastra da 6 pozzetti. Per ciascun pozzetto di una piastra da 6 pozzetti, preparare 100 ml di miscela di trasfezione, ad es., Consistente in 1 ml X-tremeGENE 9 reagente di trasfezione (o prodotto analogo), 1 pg di DNA plasmidico e DMEM senza siero. Determinare il volume di DNA plasmidico necessario, utilizzando 1 mg di DNA plasmidico per pozzetto. Assicurare che la concentrazione finale del DNA plasmidico è almeno 50 ng / ml. Determinare quanto è necessario mezzo privo di siero (DMEM) per pozzetto utilizzando la formula: Volume totale di DMEM a pl = 100 l – Volume DNA microlitri. Aggiungere 10 6 HEK 293T-17 (ATCC) cellule / pozzetto in 2 ml di mezzo di propagazione (siero fetale bovino DMEM + 10% (FBS)) in una piastra da 6 pozzetti. Incubare per 1 ora a 37 ° C in un5% di CO 2 nell'atmosfera. Seed come molti pozzi, se necessario (determinati nella fase 2.1). Per preparare la miscela di trasfezione, aliquote il volume appropriato di DMEM senza siero, come sopra determinato, in una provetta da 1,8 ml in polipropilene, e quindi aggiungere il reagente di trasfezione. Reattivo Pipettare direttamente nella soluzione dei media, non aggiungere alla superficie in plastica del provetta. Aggiungere plasmide DNA scorso. Pipettare su e giù delicatamente per mescolare la soluzione. Incubare per 15 minuti a RT (15 ° C a 25 ° C) per consentire la formazione di complessi trasfezione. Aggiungere la miscela in maniera goccia a goccia a cellule seminate nella piastra da 6 pozzetti. Scuotere o agitare i pozzi per garantire una distribuzione uniforme dei complessi trasfezione delicatamente. Piastre di tenuta di involucro di plastica. Incubare culture a 37 ° C in atmosfera di CO 2 5% per 48 ore. Utilizzare una pipetta per raccogliere attenzione e trasferire il surnatante in una provetta da 15 ml through un top 0,22 micron filtro. Utilizzare pipetta di trasferire 250 microlitri o più del surnatante filtrato a 1,8 ml provette per microcentrifuga con guarnizioni in gomma nei coperchi. Conservare surnatanti filtrato a -80 ° C fino al momento dell'uso. 3. Determinare infettiva Titer degli stock virale su cellule periferiche mononucleate del sangue (PBMC) Stimolare PBMC con fitoemoagglutinina (PHA). Per una azione virale, seme 2 x 10 6 PBMCs in Modified medio completo di Iscove Dulbecco (cIMDM; IMDM integrata con 20 U / ml di interleuchina umano 2 (HIL-2), il 10% del feto siero bovino e 1% di penicillina / streptomicina) integrato con PHA (1,5 mcg / ml). PBMC Seed a 2 x 10 6 cellule / ml. Incubare PBMC a 37 ° C in atmosfera di CO 2 5% per 72 ore. Harvest PHA stimolato PBMCs. Trasferimento non aderente PHA-PBMC in una provetta da 50 ml. Spin provetta a 228 xg per 10 min. Rimuovere con attenzione il surnatante senza disrupting il pellet di cellule. Risospendere il pellet di cellule ad una concentrazione finale di 2 x 10 5 PBMC / ml in cIMDM. Seed 2 x 10 4 PHA stimolate PBMC / bene in 100 l / pozzetto cIMDM in fondo piastra da 96 pozzetti turno. Effettuare una diluizione 1:10 del titolo virale. Poi, a partire dal primo magazzino diluita, fare dodici diluizioni seriali 3-fold in un piatto principale a 96 pozzetti. Questo schema di diluizione è raccomandato per rilevare titoli virali nell'intervallo 4 Ottobre-6 Ottobre unità infettiva (UI) per ml. Ad esempio, aggiungere 20 ml di virus stock da 180 microlitri mezzi nella provetta da 1,5 ml. Mescolare la diluizione pipettando con cautela. Poi il trasferimento di 90 l di brodo diluito in 180 ml supporto del primo pozzo e mescolare bene pipettando. Continuare serie di diluizioni trasferendo 90 microlitri dal pozzo di corrente a 180 microlitri supporti nel pozzo successivo undici più volte. Aumentare o diminuire la diluizione iniziale se titoli superiori a 10 6 IU / mlo inferiore a 10 UI / ml a 4 sono previsti rispettivamente. Aggiungere 40 ml di magazzino virale in serie diluito dalla piastra di diluizione maestro alla piastra PBMC testa di serie (dal punto 3.3) in quadruplicato. Incubare le piastre a 37 ° C in atmosfera di CO 2 5% per 16-24 ore. Rimuovere con cautela 100 ml di surnatante da ciascun pozzetto, e sostituirlo con 160 ml di cIMDM fresca per un volume totale di 200 microlitri / pozzetto. Incubare le piastre a 37 ° C con 5% di CO 2 nell'atmosfera (giorno 1). Nei giorni 4, 7, 10 e 13 di trasferimento 100 ml di surnatante da ogni pozzetto a 100 buffer di rottura microlitri (2% TritonX-100 in PBS), e sostituire con 100 ml di cIMDM fresco. Conservare il surnatante a -20 ° C. Mantenere il campionamento e l'aggiunta di cIMDM fresco ogni tre giorni fino a quando il titolo si stabilizza. Determinare la dose del 50% coltura tissutale infettiva (TCID 50) del titolo virale p24 ELISA utilizzando il giorno 7 e 13 campioni come descritto al punto 4. Se il TCID 50 ottenuto dal giorno 13 è nettamente superiore al titolo di giorno 7, il titolo del virus può avere bisogno di più tempo per espandersi. Ripetere il p24 ELISA utilizzando campioni successivi fino a quando i titoli infettive provenienti da due punti di tempo di campionamento diventano stabili (o diminuzione). Selezionare i titoli di campioni con i più alti titoli. 4. ELISA (Enzyme Linked Immunoabsorbant Assay) Individuazione del virus HIV-1 p24 per la determinazione virale contagiosa Titer NOTA: Il seguente protocollo è stato sviluppato utilizzando piastre di cattura dell'antigene p24 preparati nel nostro laboratorio 30. Commercial HIV-1 p24 ELISA piastra / kit può essere utilizzato anche, seguendo il protocollo del produttore. Prima di lavorare con i campioni, preparare scorte di lavoro di anticorpo primario (coniglio anti-HIV-1 SF2 p24 antisiero). Scongelare antisiero p24 a temperatura ambiente. Mescolare 2,5 ml di glicerolo con 2 ml di 10% FBS in phosphatsalina e tampone (PBS). Aggiungere 0,5 ml di antisiero e mescolare. Conservare 1 ml di aliquote a -20 ° C. Scongelare i campioni dal punto 3.7 in un incubatore a 37 °. Lavare la piastra di cattura p24 5 volte con tampone di lavaggio (1x PBS con 0.05% di Tween-20). Aggiungere 50 ml / pozzetto di diluente campione (1% di albumina sierica bovina (BSA), 0.2% di Tween-20 in RPMI-1640), poi aggiungere 50 ml di campione pozzetti. Includere almeno tre pozzi con diluente per campioni solo come controlli finte / negativi. Incubare per 2 ore a 37 ° C o O / N a 4 ° C. Preparare la soluzione anticorpo primario fresco prima dell'uso. Fare un 1: 2.000 volte la diluizione dell'anticorpo primario scorte di lavoro utilizzando il diluente anticorpo primario (12% FBS in RPMI-1640). Assicurare preparare sufficiente per l'uso della soluzione 100 pl per ciascun campione / controllo pozzetto in una piastra a 96 pozzetti. Ad esempio, per fare una soluzione sufficiente per un piastra a 96 pozzetti, aggiungere 5 ml di worki anticorpo primariong scorte al diluente anticorpo primario per un volume finale di 10 ml. Lavare piastra di cattura per 5 volte con tampone di lavaggio. Aggiungere 100 microlitri della soluzione di anticorpo primario in ciascun pozzetto. Incubare per 1 ora a 37 ° C in atmosfera di CO 2 5%. Preparare la soluzione di anticorpo secondario fresco prima dell'uso. Fare un 1: 14.400 volte diluizione anticorpo secondario (1 mg / ml di capra anti-coniglio HRP) utilizzando il diluente anticorpo secondario (7% FBS, 0,01% Tween-20 in RPMI-1640). Per ridurre gli errori di pipettamento, eseguire una diluizione seriale in due fasi. Assicurare preparare sufficiente per l'uso della soluzione 100 pl per ciascun campione / controllo pozzetto in una piastra a 96 pozzetti. Ad esempio, per fare una soluzione abbastanza per una piastra a 96 pozzetti, aggiungere prima 1 ml di anticorpo secondario a 99 ml di diluente anticorpo secondario. Aggiungere quindi 70 ml di prima diluizione al diluente anticorpo secondario per un volume finale di 10 ml. Lavare la piastra cattura 5 times con tampone di lavaggio. Aggiungere 100 microlitri della soluzione di anticorpo secondario in ciascun pozzetto. Incubare per 1 ora a 37 ° C in atmosfera di CO 2 5%. Lavare la piastra 5 volte con tampone di lavaggio. Aggiungere 100 ml di substrato RT TMB. Incubare 30 minuti a temperatura ambiente in un contenitore chiuso per proteggere dalla luce. Aggiungere 100 ml di soluzione di arresto RT (1 NH 2 SO 4). Leggere l'assorbanza a 450-650 nm in ogni pozzetto usando un lettore di micropiastre. Utilizzare il valore di assorbanza di segnare ogni bene come infetto o non infetto. Si consideri un pozzo per contenere virus infettivo se l'assorbanza è almeno tre volte superiore al valore letto da pozzetti di controllo finte / negative. Calcola TCID 50 del titolo virale utilizzando il metodo di Reed-Meunch 31. 5. Stabilire Viral crescita Cinetica 5.1) monoinfezione Seed 3 x 10 5 PHA-stimolata PBMC / bene in 48 pozzettis in un volume totale di 500 microlitri / pozzetto. Conservare le piastre di coltura a 37 ° C in atmosfera di CO 2 5% fino inoculazione. Per ogni virus, preparare un inoculo contenente 6.000 UI in 2 ml di cIMDM. Seminare pozzi in triplice copia, con l'aggiunta di 500 ml di inoculo (1.500 UI) alle cellule seminate. Il volume finale della coltura cellulare infettata è di 1 ml / pozzetto e la MOI è 0.005. Aliquotare 200 ml di inoculo rimanente in ciascuna delle due piastre a 96 pozzetti per l'isolamento di RNA, una delle quali viene salvato come backup. Incubare culture a 37 ° C in atmosfera di CO 2 5% per 16-24 ore. Culture Lavare 16-24 ore dopo l'inoculazione. Rimuovere e gettare 750 ml di cultura surnatante. Aggiungere 750 ml di cIMDM fresco. Avvolgere piastre in pellicola e di plastica di rotazione per 10 minuti a 300 x g. Rimuovere e gettare 750 microlitri surnatante. Aggiungere 750 ml di cIMDM fresco. Incubare a 37 ° C con 5% di CO 2 amosfera (giorno 1). Culture Esempi quotidiani dal giorno 2 al giorno 7. Trasferire 500 ml di cultura surnatante in una provetta 1,8 ml centrifuga. Spin per 1 min a 3000 x g. Trasferire 200 ml di supernatante privo di cellule alle due piastre di esempio 96 pozzetti per l'isolamento di RNA, risparmiando così una piastra come backup. Conservare supernatanti a -80 ° C fino isolamento dell'RNA. Aggiungere cIMDM 500 microlitri fresca ogni cultura. Incubare a 37 ° C in atmosfera di CO 2 5%. Eliminare le culture in Wescodyne alla fine dell'esperimento. Isolare RNA da 200 ml di surnatante (utilizzare i kit commerciali come QIAamp Viral RNA Mini Kit) in seguito il protocollo standard del produttore. Per un gran numero di campioni, utilizzare la Qiagen QIAxtractor. Conservare i campioni di RNA a -80 ° C fino a sintesi del DNA. 5.2) cDNA Synthesis (trascrizione inversa) Per ogni RNA sampio, aggiungere 1.2 nmol di dNTP e 1,2 pmol di sintesi del DNA primer (5'-GTTGATCCTTTAGGTATCTTTCCACAGC-3 ', HXB2 nucleotide 7968-7995) a 10 ml di RNA virale. Aggiungere acqua ad un volume finale di 14 microlitri. Flick la provetta per miscelare e spin brevemente per raccogliere il liquido sul fondo della provetta. Incubare la miscela per 5 minuti a 65 ° C, poi mantenere a 4 ° C fino alla preparazione della miscela master. Preparare master mix utilizzando 5x primo filamento tampone (250 mm Tris-HCl, pH 8.3, 375 mM KCl, 15 mM MgCl 2), 5 mM DTT, 120 U di SuperScriptIII e 240 U di RNase Inhibitor. Aggiungere acqua al volume finale di 10 pl. Aggiungere 10 ml di master mix di miscela di RNA, sfiorare per mescolare e girare per la raccolta. Incubare la miscela per 90 min a 50 ° C per permettere la sintesi di cDNA. Incubare per 15 minuti a 70 ° C per inattivare la trascrittasi inversa. Mantenere a 4 ° C, se necessario. Aggiungere 2 U di RNasi H, sfiorare per mescolare, e poi girare a raccogliere. Incubare 20 mina 37 ° C. Conservare cDNA a -20 ° C. 5.3) cDNA Quantificazione Uso qPCR Sistema Preparare una serie di diluizioni standard. Do 10 volte diluizione seriale, da 3 x 10 6 copie / ml fino a 30 copie / ml, di pNL4-3VifA. Utilizzare acqua distillata per diluizioni. Preparare la serie di diluizioni standard fresco prima dell'uso o preparare piccoli lotti e conservare a -20 ° C. Non congelare-scongelare gli standard più di tre volte. Impostare una piastra di reazione qPCR 96 pozzetti. Assicurarsi che ciascuna piastra contiene almeno un pozzetto di controllo negativo, un triplice copia della serie di diluizioni standard, e almeno un duplicato di ciascun campione di cDNA. Per ogni reazione qPCR, utilizzare 12,5 ml di qPCR master mix, 0,2 micron sonda, 0,8 mM ognuno dei primer in avanti e all'indietro e 1 ml di cDNA o la serie di diluizioni standard o acqua / tampone (per il controllo negativo). Aggiungere acqua fino ad un volume finale di 25 microlitri. La sonda qPCR è luce sensitive. Tenerlo in un contenitore chiuso. Per rilevare cDNA derivato dal clone molecolare basato pNL4-3VifA, utilizzare il VIFA primer sonda: VifAB primer forward (GGTCTGCATACAGGAGAAAGAGACT), VIFA primer reverse (5'-AGGGTCTACTTGTGTGCTATATCTCTTTT-3 ') e sonda VifAB (6FAM-5'-CTCCATTCTATGGAGACTC-3 '-MGBNFQ). Per cDNA derivato da clone basato pNL4-3VifB, utilizzare il VifB primer sonda: VifAB primer forward, sonda VifAB e VifB primer reverse (5'-CACCTGCGTGCTATACCTTTTCT-3 '). Impostare parametri ciclismo PCR a 50 ° C per 2 min, 95 ° C per 10 minuti, e 40 cicli di 95 ° C per 15 sec e 60 ° C per 1 min. Consultare documento di supporto del produttore per il funzionamento della macchina qPCR. Calcolare una curva standard utilizzando i dati della serie di diluizioni standard triplicato. Confrontare i dati di amplificazione del campione cDNA alla curva standard per determinare il numero di copie. Consultare documento di supporto del produttore per daelaborazione ta. 5.4) Determinare Viral crescita esponenziale di fase Tracciare cinetica di crescita virale con il giorno di campionamento lungo l'asse X e il numero di copie cDNA lungo l'asse Y e identificare la fase di crescita esponenziale virale, cioè., Quando cDNA virali copiare numeri aumento in una progressione esponenziale. Utilizzare lo strumento web GRC ( http://indra.mullins.microbiol.washington.edu/grc/ ) per calcolare il tasso di crescita virale (g). In questa applicazione, l'utensile GRC accetta cDNA copia numeri da almeno due punti di tempo in ingresso, ed emette il tasso di crescita virale (g). Utilizzare solo i dati dei punti entro la fase di crescita esponenziale (vedi sopra punto 5.4.1) per ottenere tassi di crescita accurati. Per una descrizione dettagliata del modello matematico utilizzato nello strumento Web GRC, vedi 20. 6. La crescita della concorrenza Assay Seed 3 x 10 5 </ Sup> PBMCs PHA-stimolata (o 1 x 10 5 CEMx174 celle) in 500 ml di volume totale per bene in un piatto ben 48 a fondo piatto. Tenere piastra in 37 ° C in una atmosfera di CO 2 5% fino inoculazione. Per ogni virus, preparare 3 ml di inoculo contenente 6.000 UI. Trasferire 1,5 ml di ciascuna inoculo virale in una provetta sterile per creare l'inoculo dual infezione. Aggiungere 500 ml di inoculo duale (1.500 UI) di 3 x 10 5 cellule in una piastra a 48 pozzetti. Il volume di coltura, è di 1 ml / pozzetto. Aliquota 200 ml di inoculo a due piastre da 96 pozzetti per l'isolamento dell'RNA; salvare una piastra come back up. Incubare le cellule inoculate a 37 ° C con una atmosfera di CO 2 5% per 16-24 ore. Culture Lavare 16-24 ore dopo l'inoculazione. Rimuovere e gettare 750 ml di cultura surnatante. Aggiungere 750 ml di cIMDM fresco. Avvolgere piastre in pellicola e girare in plastica per 10 min a 300 x g. Rimuovere e smaltire 75081; l surnatante. Aggiungere 750 ml di cIMDM fresco. Incubare a 37 ° C con una atmosfera di CO 2 5% (giorno 1). Selezionare i tempi di campionamento di includere almeno 3 punti di tempo all'interno della fase di crescita esponenziale osservata nel passaggio 5.4.1. Per ogni campione, seguire passo 5.1.7. Eseguire cDNA sintesi come descritto nel paragrafo 5.2. Determinare il rapporto variante virale con qPCR. Preparare una serie di diluizioni seriale standard in triplice copia, diluendo 10 volte in ogni passaggio da 3 x 10 6 copie / ml a 30 copie / ml di pNL4-3VifA. Impostare una piastra di reazione qPCR 96 pozzetti. Assicurarsi che ciascuna piastra contiene almeno un controllo negativo, la serie di diluizioni standard in triplice copia, e duplicati di ogni campione di cDNA. Per ogni reazione qPCR, utilizzare 12,5 ml di qPCR Master Mix, sonda 0,2 micron, 0,8 mM ciascuno dei forward e reverse primer e 1 ml di cDNA o d norma serie ilution o acqua / tampone (per i pozzetti di controllo negativo). Aggiungere acqua fino ad un volume finale di 25 microlitri. La sonda qPCR è sensibile alla luce, tenerlo in un contenitore chiuso. Utilizzare il primer sonda VIFA per rilevare i segnali nei controlli negativi e la serie di diluizioni standard e con uno duplicato del campione di cDNA. Utilizzare il primer sonda VifB con l'altro duplicato del campione di cDNA. Impostare parametri ciclismo PCR a 50 ° C per 2 min, quindi 95 ° C per 10 minuti, e poi 40 cicli di 95 ° C per 15 sec e 60 ° C per 1 min. Consultare documento di supporto del produttore per il funzionamento della macchina qPCR. Calcolare la curva standard utilizzando i dati di amplificazione della serie di diluizioni standard. Confrontare i dati di amplificazione dei campioni di cDNA con la curva standard per determinare il numero di copie. Consultare documento di supporto del produttore per l'elaborazione dei dati. Utilizzare lo strumento web GRC (ol.washington.edu/grc/">http://indra.mullins.microbiol.washington.edu/grc/) per calcolare fitness virale relativa (d). NOTA: Lo strumento GRC accetta cDNA copiare i numeri o le altezze dei picchi cromatogramma da almeno due punti di tempo come ingresso, ed emette la differenza tasso di crescita netto (d) tra i due virus. Mentre lo strumento in grado di calcolare il tasso di crescita netto da due dati di punti temporali, si consiglia vivamente di dati di input da tre o più punti di tempo. Utilizzare solo i dati ottenuti da punti di tempo all'interno della fase di crescita esponenziale (vedi punto 5.4) per ottenere tassi di crescita accurati. Per una descrizione dettagliata del modello matematico utilizzato nello strumento Web GRC, vedi 20. Determinare i rapporti virali usando cromatogramma picchi-heights PCR amplificare HIV-1 vif frammenti contenenti il tag sequenza VifAB utilizzando VifFwd (5'-GAAAGAGACTGGCATTTGGGTCAGGG-3 '; HXB2 posiziona 5266-5291) e VifRev primer (5'-GTCTTCT GGGGCTTGTTCCATCTGTCC-3 '; Posizioni HXB2 5579-5553). Per ogni reazione di PCR, utilizzare 1 ml di cDNA, 1x NH 4 tampone, 1,5 mM MgCl 2, 0.2 mM dNTP, 2.5 U di Taq polimerasi, e 0,45 micron di ogni primer. Aggiungere acqua fino ad un volume finale di 50 microlitri. Impostare parametri ciclismo PCR a 3 cicli a 94 ° C per 1 min, 55 ° C per 1 minuto, e 70 ° C per 1 min, seguiti da 34 cicli a 94 ° C per 15 sec, 58 ° C per 30 sec, e 70 ° C per 1 minuto, e quindi tenere a 4 ° C. Purificare prodotti PCR utilizzando il kit di purificazione QIAquick PCR secondo il protocollo del produttore. Invia prodotti purificati PCR per un sequenziamento del DNA fornitore di servizi per sequenziamento Sanger. Controllare il punteggio medio qualità di lettura, che dovrebbe essere fornito dal servizio di sequenziamento. Se la precisione media delle chiamate di base è inferiore al 85%, ripetere passo 6.10.1 a 6.10.3 Utilizzare lo strumento web ChromatQuan (f="http://indra.mullins.microbiol.washington.edu/cgi-bin/chromatquant.cgi">http://indra.mullins.microbiol.washington.edu/cgi-bin/chromatquant.cgi ) per calcolare il rapporto virale in ogni punto. Lo strumento richiede il file di traccia di sequenza (* .ab1) e la sequenza 5 'al sito nucleotide di interesse. Lo strumento misura l'intensità di picco al sito specificato. Il rapporto tra l'intensità di picco corrispondente al rapporto delle due virus (Figura 4B). Utilizzare lo strumento GRC web ( http://indra.mullins.microbiol.washington.edu/grc/ ) e l'intensità dei picchi registrati come ingresso per il calcolo idoneità relativa virale (d). Vedere il passaggio 6.10.6. 20