Paarweise Wachstum Wettbewerb Assay zur Bestimmung der Replication Fitness von Human Immunodeficiency Viruses

HINWEIS: Das Protokoll, wie unten beschrieben, enthält keine Patienten Informationen und ist daher nicht als Human Subjects Forschung von der University of Washington Institutional Review Board oder Human Subjects Abteilung. 1. Konstruktion von chimären HIV-1 NL4-3 Molecular Clones 1.1) Amplify Insert DNA Fragment Gestalten Sie chimären Primer. Die 5'-Hälften Vorwärts- und Rückwärts-Primer enthalten eine HIV-1-Vektor-Sequenz, bei dem das Fragment eingefügt. Die 3'-Hälfte des Primers muß das Ende der Insertsequenz (Figur 2) enthalten. Stellen Sie sicher, dass die chimären Primer-Sequenz behält die ursprüngliche offene Leserahmen. Verwenden Primer mindestens 20 Basen in der Länge, mit einer Schmelztemperatur größer oder gleich 60 ° C, ca. 50% GC-Gehalt und einer geringen Neigung zur Primer-Dimere, Heterodimere und / oder Haarnadelstrukturen zu bilden. Beurteilen Sie diese EigenschaftenVerwendung des OligoAnalyzer Webtool ( https://www.idtdna.com/analyzer/Applications/OligoAnalyzer/ ). Verwenden PCR 27 und die chimären Primer an Insert-DNA (Abbildung 2) zu verstärken. Für jede PCR-Reaktion zu verwenden 1X High-Fidelity-Puffer, 0,2 mM dNTPs, 1 U der High Fidelity DNA-Polymerase, 0,5 & mgr; M von vorne chimären Primer, 0,5 & mgr; M von Reverse chimären Primer und 1 pg0 ng DNA Probentransporteinsatz Region. Hinzuzufügen dH 2 O auf ein Endvolumen von 50 ul. Eingestellt thermische Zyklusschritte wie folgt: Durchführen einer anfänglichen DNA-Denaturierungsschritt bei 98 ° C für 10 sec. Verstärken mit 30 Zyklen von Denaturierung der DNA bei 98 ° C für 10 sec und DNA Glühen bei 3 ° C über dem niedrigsten Schmelztemperatur der beiden Primer für 20 sec. Durchführen einer abschließenden Extension bei 72 ° C für 10 min. Speicher PCR-Produkte bei 4 ° C. Werden 5 & mgr; l der PCR-Produkte aus demvorherigen Schritt und führen Agarosegelelektrophorese 28. Verwenden einer 0,7% igen Agarosegel, 1x TAE-Puffer (40 mM Tris-Acetat, 1 mM EDTA), 0,5 ug / ml Ethidiumbromid (EtBr) Endkonzentration und 1 kb Leiter als DNA-Größenmarker. Set Energiequellenspannung 5 V / cm Abstand zwischen den Elektroden. Stoppen Sie die Elektrophorese, wenn der Ladepuffer wandert durch etwa 2/3 der Länge Gel. Visualisieren Sie das Gel mit einem Gel-Dokumentationssystem 28. HINWEIS: EtBr steht im Verdacht, krebserregend und müssen ordnungsgemäß entsorgt werden, pro Einrichtung Vorschriften. Handschuhe sollten immer beim Umgang mit Gelen, die EtBr getragen werden. Ändern Sie, um neue Handschuhe nach dem Fertig Handhabung EtBr Material und vor dem Umgang mit anderen Materialien oder Geräte, um Kreuzkontamination zu vermeiden. Wenn nur eine DNA-Bande mit einer Größe entsprechend dem gewünschten PCR-Produkt erkannt wird, zu reinigen, der Rest des PCR-Produkts unter Verwendung eines kommerziellen Kits, wie QIAquick PCR Purification Kit Einklanging Herstellerprotokolle. Wenn andere, unspezifische Banden sind ebenfalls vorhanden, verwenden Sie den Rest des PCR-Produkts zu präparative Gelelektrophorese laufen. Verwenden Sie die gleichen Parameter und Bedingungen in Schritt 1.1.4 angegeben. Sicherzustellen, daß das Gel auch groß genug, um 45 & mgr; l PCR-Produkte zu laden ~. Ausschneiden der Bande von Interesse und Extrahieren der DNA aus dem Gel mit dem QIAquick Gel Extraction Kit nach den Protokollen des Herstellers. 1.2) Führen Sie das Insert-Fragment in voller Länge Infectious HIV-1 Subtyp B Vector (pNL4-3) Verwenden gereinigten PCR-Produkte aus Schritt 1.1.5 als PCR-Primer. Verwenden pNL4-3VifA 20 als Matrizen-DNA in einer PCR-Reaktion verwendet pNL4-3VifB 20 als Matrize in der anderen Reaktion (Abbildung 2). Für jede PCR-Reaktion verwendet 1x High-Fidelity-Puffer, 0,2 mM dNTPs, 2 U High Fidelity DNA-Polymerase, 500 ng von Primer-DNA und 50 ng Matrizen-DNA in einem Endvolumenume von 50 ul. Setzen die thermischen Wechselparameter: 98 ° C für 30 sec, 35 Zyklen bei 98 ° C für 10 sec, 48 ° C für 1 min und 72 ° C für 10 min, gefolgt von 72 ° C für 10 min. Zugabe von 10 U Dpn I bis 50 & mgr; l der PCR-Reaktion und bei 37 ° C für 1 Stunde, um die Template-DNA zu verdauen. Sicherzustellen, daß die Plasmid-DNA wird aus einer Methylierung von kompetenten Bakterienstamm, zB isoliert., TOP10 chemisch kompetente Escherichia coli. Verwenden Dpn I verdaute Produkt zu kompetenten Bakterienzellen zu transformieren. Verwenden Hitzeschock-Transformation mit TOP10 chemisch kompetente E. coli, nach dem Protokoll des Herstellers. Um Bakterienzellen, die das rekombinante Plasmid auszuwählen, verwenden Luria Broth (LB) Kulturplatten, die 100 mg / l Carbenicillin. Wählen ~ 10 gut getrennte Kolonien wachsen und jeweils separat in 3 ml LB-Flüssigmedium, das 100 mg / l Carbenicillin und Inkubation bei 30 ° C in eineSchüttler O / N. Verwenden QIAprep Spin Miniprep Kit, um Plasmid-DNA aus dem Bakterienkulturflüssigkeit isoliert, entsprechend dem Protokoll des Herstellers. Verwenden Sie doppelte Restriktionsverdau 29, um festzustellen, ob die Plasmid-DNA die richtige Insert enthält. Sicherzustellen, daß eine der Restriktionsstellen nur innerhalb der Insertregion vorhanden ist, und das andere Restriktionsstelle ist nur einmal in der HIV-1-Vektor, außerhalb des Einsatzbereich. Digest mindestens 300 ng Plasmid-DNA in einer 10 ul Endreaktionsvolumen. Ausgewählte Restriktionspuffer, Inkubationstemperatur und Inkubationszeit nach dem Protokoll des Herstellers der ausgewählten Restriktionsenzyme. Nehmen 9 ul der verdauten DNA und führen Gelelektrophorese, wie in Schritt 1.1.4 beschrieben. Wählen rekombinanten Plasmide, die DNA-Bande der vorhergesagten Größen haben. Bestätigung eine Sequenzintegrität der rekombinanten Plasmide durch Sanger-Sequenzierung. Obwohl selten, unerwünschteMutation (en) kann in den PCR-Reaktionen eingeführt werden. Sequenz beide Stränge der Plasmid-DNA. Folgen Sie den Anweisungen in Schritt 1.1.1.1 zu Sequenzierprimer entwerfen. Außerdem ist sicherzustellen, dass die Vorwärts- und Rückwärts Sequenzierprimer Glühen mindestens 50 bp stromaufwärts und stromabwärts des Einsatzbereich in dem rekombinanten Plasmid verbunden. Absenden Plasmid-DNA und Sequenzierungsprimer an einen kommerziellen DNA-Sequenzierung Dienstleister. Bereiten DNA-Probe und Primer, wie die von der Behörde festgelegt. Machen Sie ein Endotoxin-Free Stock des mutierten Plasmid-DNA unter Verwendung eines Endotoxin frei Plasmid-DNA Kit gemäß Herstellerprotokoll. Vorbereitung mindestens 1 ug Endotoxin-freiem Plasmid-DNA zur Transfektion in der folgenden Stufe. 1.3) einführen Kleines Mutationen Via gerichtete Mutagenese Gestalten Sie mutagenen Primer mit überlappenden Vorwärts- und Rückwärtsprimer, die das gewünschte mutatIon (en). Stellen Sie die Basis (n) ausgewechselt werden, eingesetzt, oder in der Mitte der Primer, um 10-15 homologe Basen flankiert gelöscht. Folgen Sie den Anweisungen in Schritt 1.1.1.1. Verwenden PCR, um mutierte Plasmide zu synthetisieren. Für jede PCR-Reaktion verwendet 1x High-Fidelity-Puffer, 10 mM dNTPs, 2 U High Fidelity DNA-Polymerase, 0,5 & mgr; M Vorwärts mutagenen Primers, 0,5 & mgr; M Rückwärts mutagenen Primers und 50 ng chimären pNL4-3VifB von Schritt 1.2.6 in einem Endvolumen von 50 ul. Setzen die thermischen Wechselparameter: 98 ° C für 30 sec, 25 Zyklen bei 98 ° C für 10 sec, 48 ° C für 1 min und 72 ° C für 10 min, gefolgt von 72 ° C für 10 min. Wiederholen Sie die Schritte 1.2.2 bis 1.2.6. 2. Erzeugung von Viral Lizenz Mit Transfektion Berechnen Sie die Menge der benötigten Virusstamm gewünschten und Plasmid-DNA. Mit einem Virustiter von 10 4 IU / ml oder höher, 1,8 ml der Virusstammlösung ist ausreichend für zwei Sätze von Wachstums Wettbewerb assays, einschließlich Monoinfektionen, die jeweils dreifach durchgeführt. Für eine Transfektion in einer 6-Well-Platte durchgeführt wird etwa 1,8 ml Überstand pro Vertiefung geerntet. Ein ug Plasmid-DNA für jede Transfektion in 6-Well-Platte durchgeführt benötigt. Für jede Vertiefung einer Platte mit 6 Vertiefungen, bereiten 100 ul Transfektionsgemisch, z. B. bestehend aus 1 & mgr; l X-tremegene 9 Transfektionsreagenz (oder vergleichbares Produkt), 1 ug Plasmid-DNA und serumfreiem DMEM. Bestimmen Sie das Volumen der benötigten Plasmid-DNA unter Verwendung von 1 & mgr; g Plasmid-DNA pro Vertiefung. Sicherzustellen, dass die endgültige Konzentration der Plasmid-DNA von mindestens 50 ng / & mgr; l. Bestimmen, wie viel Serum-freiem Medium (DMEM) pro Vertiefung unter Verwendung der Formel erforderlich: Gesamtvolumen der DMEM in ul = 100 & mgr; l – DNA Volumen in ul. Werden 10 6 HEK293T-17 (ATCC) Zellen / Vertiefung in 2 ml Vermehrungsmedium (DMEM + 10% fötalem Rinderserum (FBS)) in eine Platte mit 6 Vertiefungen. Inkubieren für 1 h bei 37 ° C in einem5% CO 2 Atmosphäre. Samen machen wie viele Brunnen nach Bedarf (in Schritt 2.1 bestimmt). Um die Transfektion Mischung herzustellen, aliquotieren das entsprechende Volumen an Serum-freies DMEM, wie oben, berechnet in ein 1,8 ml-Polypropylen-Mikrozentrifugenröhrchen, und fügen Sie den Transfektionsreagenz. Pipette Reagenz direkt in den Media-Lösung, nicht an die Kunststoffoberfläche des Mikrozentrifugenröhrchen hinzuzufügen. In Plasmid-DNA letzten. Pipette nach oben und unten vorsichtig, um die Lösung zu mischen. Inkubieren für 15 Minuten bei RT (15 ° C bis 25 ° C), um die Bildung von Transfektionskomplexen ermöglichen. Fügen Sie die Mischung in einer tropfenweisen Weise auf Zellen in der Platte mit 6 Vertiefungen ausgesät. Schütteln oder schwenken die Brunnen auf gleichmäßige Verteilung der Transfektionskomplexe gewährleisten. Dichtungsplatten mit Plastikfolie. Kulturen, die bei 37 ° C inkubieren in einem 5% CO 2 -Atmosphäre für 48 Stunden. Mit einer Pipette sorgfältig zu sammeln und Überstand in ein 15-ml-Tube through einen 0,22 um Filter oben. Pipette bis 250 & mgr; l oder mehr des gefilterten Überstandes mit Gummidichtungen in den Deckel zu übertragen, um 1,8 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Speicher gefilterten Überstände bei -80ºC bis zur Verwendung. 3. Bestimmen Sie Infektionstiter von Viral Stocks auf peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs) Stimulieren PBMCs mit Phytohämagglutinin (PHA). Pro Virusstamm, Samen 2 x 10 6 PBMC in komplettem Iscove modifiziertem Dulbecco-Medium (cIMDM; IMDM mit 20 U / ml humanes Interleukin-2 ergänzt (hIL-2), 10% fötales Rinderserum und 1% Penicillin / Streptomycin) ergänzt mit PHA (1,5 ug / ml). Samen PBMCs bei 2 x 10 6 Zellen / ml. PBMCs bei 37 ° C in einem 5% CO 2 -Atmosphäre für 72 h. Ernte-PHA stimulierte PBMCs. Übertragen nichthaft PHA-PBMCs zu einer 50 ml konischen Röhrchen. Zentrifugenröhrchen bei 228 g für 10 min. Überstand vorsichtig entfernen, ohne disrupting das Zellpellet. Re-suspendieren des Zellpellets in einer Endkonzentration von 2 x 10 5 PBMC / ml in cIMDM. Seed 2 x 10 4 PHA stimuliert PBMC / Vertiefung in 100 ul / Vertiefung cIMDM in einem Rundboden-96-Well-Platte. Machen Sie eine 1:10 Verdünnung der viralen Stamm. Dann, von der ersten verdünnten Lager, machen zwölf 3-fach serielle Verdünnungen in einer 96-Loch Masterplatte. Dieser Verdünnungsschema zum Nachweis viraler Titer im Bereich von 10 4 bis 10 6 infektiöse Einheit (IU) pro ml empfohlen. Fügen Sie beispielsweise 20 & mgr; l der Virusstamm zu 180 & mgr; l Medium in der 1,5-ml-Tube. Mischen Sie die Verdünnung durch Pipettieren sorgfältig. Dann Transfer 90 ul der verdünnten Brühe in 180 ul Medium der ersten gut und gut mischen durch Pipettieren. Weiter Verdünnungsreihe durch die Übertragung von 90 & mgr; l aus der aktuellen und zu 180 & mgr; l Medium in den nächsten gut elf weitere Male. Erhöht oder verringert die Anfangsverdünnung, wenn Titer von mehr als 10 6 IU / mloder niedriger ist als 10 4 IU / ml zu erwarten sind. In 40 ul der seriell verdünnten Virusstamm von der Master-Verdünnungsplatte auf die gesetzten PBMCs Platte (aus Schritt 3.3) in vierfacher Ausfertigung. Inkubation erfolgt bei 37 ° C in einem 5% CO 2 -Atmosphäre für 16-24 Std. Entfernen Sie vorsichtig 100 ul Überstand aus jeder Vertiefung, und ersetzen Sie sie durch 160 ml frisches cIMDM zu einem Gesamtvolumen von 200 ul / Vertiefung. Inkubation erfolgt bei 37 ° C mit 5% CO 2 -Atmosphäre (Tag 1). An den Tagen 4, 7, 10 und 13 Transfer 100 ul Überstand aus jeder Vertiefung 100 & mgr; l Aufschlußpuffer (2% Triton X-100 in PBS), und ersetzen mit 100 ul frisch cIMDM. Bewahren Sie die Überstände bei -20 ° C. Halten Probenahme und Zugabe von frischem cIMDM alle drei Tage, bis der Titer stabilisiert. Bestimmen Sie den 50% Gewebekulturinfektionsdosis (TCID 50) der viralen Stamm von p24-ELISA unter Verwendung der Tag, 7 und 13 Proben wie in Schritt 4 beschrieben. Wenn die TCID 50 von Tag 13 erhalten, ist deutlich höher als der Titer von Tag 7, kann das Virus Lager müssen eine längere Zeit zu erweitern. Wiederholen Sie den p24-ELISA unter Verwendung späteren Proben, bis die infektiösen Titer von zwei Abtastzeitpunkten stabil (oder Verringerung). Wählen Sie die Titel aus Proben mit den höchsten Titer. 4. ELISA (Enzyme-linked Immunabsorptions-Assay) Der Nachweis von HIV-1 p24 zur Bestimmung Viral Infektionstiter HINWEIS: Das folgende Protokoll wurde mit p24-Antigen-Capture-Platten in unserem Labor 30 vorbereitet entwickelt. Kommerziellen HIV-1-p24-ELISA-Platte / Kits können auch verwendet werden, nach dem Protokoll des Herstellers. Vor der Arbeit mit Samples, bereiten Arbeitsvorräte an primären Antikörper (Kaninchen-Anti-HIV-1 SF2 p24-Antiserum). Thaw p24-Antiserum bei RT. Mischungs 2,5 ml Glycerin mit 2 ml 10% FBS in phosphate-gepufferter Saline (PBS). In 0,5 ml Antiserum und mischen. Speicher 1 ml Aliquots bei -20 ° C. Tau-Proben aus Schritt 3.7 in einem 37 ° C Inkubator. 5 mal mit Waschpuffer (1x PBS mit 0,05% Tween-20) Waschen Sie die p24-Capture-Platte. In 50 ul / Vertiefung Probenverdünnungsmittel (1% Rinderserumalbumin (BSA), 0,2% Tween-20 in RPMI-1640), dann fügen Sie 50 ul der Probe, um die entsprechenden Wells. Mindestens drei Vertiefungen mit Probenverdünnungsmittel nur als Mock / Negativkontrollen. Inkubieren für 2 Stunden bei 37 ° C oder O / N bei 4 ° C. Bereiten Sie den primären Antikörperlösung frisch vor Gebrauch. Machen Sie eine 1: 2000-fachen Verdünnung des primären Antikörpers Arbeits Aktien mit der primären Antikörperverdünnung (12% FBS in RPMI-1640). Sorgen für die Verwendung von 100 ul Lösung pro jeder Probe / Kontrollvertiefung in einer 96-Well-Platte genug herzustellen. Zum Beispiel, um genug Lösung für eine 96-Well-Platte zu machen, fügen Sie 5 ul des primären Antikörpers working Bestände an den primären Antikörper Verdünnungsmittel für ein Endvolumen von 10 ml. Waschen Sie Capture-Platte 5 mal mit Waschpuffer. 100 ul des primären Antikörperlösung in jede Vertiefung. Inkubation für 1 h bei 37 ° C in einem 5% CO 2 Atmosphäre. Bereiten Sie die Sekundärantikörperlösung frisch vor Gebrauch. Stellen eine 1: 14.400-fachen Verdünnung des sekundären Antikörpers (1 mg / ml Ziegen-Anti-Kaninchen-HRP) unter Verwendung der sekundären Antikörperverdünnung (7% FBS, 0,01% Tween-20 in RPMI-1640). Um Pipettierfehler zu reduzieren, führen Sie einen zweistufigen Reihenverdünnung. Sorgen für die Verwendung von 100 ul Lösung pro jeder Probe / Kontrollvertiefung in einer 96-Well-Platte genug herzustellen. Zum Beispiel, um genug Lösung für eine 96-Well-Platte zu machen, zuerst hinzufügen 1 ul des sekundären Antikörpers zu 99 & mgr; l des sekundären Antikörperverdünnung. Dann fügen 70 ul der ersten Verdünnung an den sekundären Antikörper Verdünnungsmittel für ein Endvolumen von 10 ml. Wash-Capture-Platte 5 times mit Waschpuffer. Füge 100 & mgr; l des sekundären Antikörperlösung in jede Vertiefung. Inkubation für 1 h bei 37 ° C in einem 5% CO 2 Atmosphäre. Waschplatte 5 mal mit Waschpuffer. 100 l RT TMB-Substrat. Inkubieren 30 min bei RT in einem geschlossenen Behälter vor Licht zu schützen. 100 l RT-Stop-Lösung (1 NH 2 SO 4). Lesen Sie die Absorption bei 450-650 nm in jeder Vertiefung mit Hilfe eines Mikroplatten-Reader. Verwenden Sie den Extinktionswert zu punkten jeweils auch infizierten oder nicht infizierten. Betrachten wir eine wohl infektiösen Virus enthalten, wenn der Extinktionswert mindestens dreimal höher als der Wert von Mock / negativen Kontrollvertiefungen zu lesen. Berechnen TCID 50 der viralen Stamm mit dem Reed-Meunch Verfahren 31. 5. Stellen Sie das virale Wachstum Kinetics 5.1) Monoinfektion Saatgut 3 x 10 5 PHA-stimulierte PBMC / Vertiefung in 48-Well-Plattes in einem Gesamtvolumen von 500 ul / Vertiefung. Danach wird die Kultur-Platten bei 37 ° C in einem 5% CO 2 Atmosphäre bis Inokulation. Für jedes Virus, bereiten ein Inokulum enthält 6.000 IE in 2 ml cIMDM. Inokulieren Wells in dreifacher Ausführung durch Zugabe von 500 ul des Inokulums (1500 IU) in die angesiedelten Zellen. Das endgültige Volumen der infizierten Zellkultur ist 1 ml / Vertiefung und der MOI 0,005. 200 ul Aliquot des verbliebenen Impfkultur zu jedem der zwei 96-Well-Platten für die RNA-Isolierung, von denen eines als ein Backup gespeichert. Kulturen, die bei 37 ° C inkubieren in einem 5% CO 2 -Atmosphäre für 16-24 Std. Wash Kulturen 16-24 h nach der Inokulation. Entfernen und entsorgen Sie 750 ul Kulturüberstand. In 750 ml frisches cIMDM. Wickeln Sie Platten in Plastikfolie und Spin für 10 Minuten bei 300 x g. Entfernen und entsorgen Sie 750 ul Überstand. In 750 ml frisches cIMDM. Inkubieren bei 37 ° C mit 5% CO 2 beimosphäre (Tag 1). Proben Kulturen täglich von Tag 2 bis Tag 7. Übertragen 500 ul Kulturüberstand in ein 1,8 ml-Zentrifugenröhrchen. Spin für 1 min bei 3.000 x g. Transfer 200 ul des zellfreien Überstand an den beiden 96-Loch-Probenplatten für RNA-Isolierung, wiederum spart eine Platte als Backup. Shopüberstände bei -80 ° C, bis die RNA-Isolierung. Fügen Sie 500 ul frisch cIMDM zu jeder Kultur. Inkubieren bei 37 ° C in einem 5% CO 2 Atmosphäre. Verwerfen Kulturen in Wescodyne am Ende des Experiments. Isolieren von RNA aus 200 ul Überstand (Nutzung von kommerziellen Kits wie QIAamp Viral RNA Mini Kit) nach Standardprotokoll des Herstellers. Für eine große Anzahl von Proben, verwenden Sie die Qiagen QIAxtractor. Speicher-RNA-Proben bei -80 ° C bis zur cDNA-Synthese. 5.2) cDNA-Synthese (Reverse Transkription) Für jede RNA sweise mit 1,2 nmol dNTP und 1,2 pmol des cDNA-Synthese-Primer (5'-GTTGATCCTTTAGGTATCTTTCCACAGC-3 ', HXB2 Nukleotid 7968-7995) und 10 ul der viralen RNA. Fügen Sie Wasser bis zu einem Endvolumen von 14 & mgr; l. Flick das Rohr zu mischen und Spin kurz auf Flüssigkeit am Boden des Röhrchens zu sammeln. Inkubieren Mischung für 5 min bei 65 ° C, dann bei 4 ° C zu halten, bis die Hauptmischung wird hergestellt. Vorbereitung Master Mix mit 5x Erststrang-Puffer (250 mM Tris-HCl, pH 8,3, 375 mM KCl, 15 mM MgCl 2), 5 mM DTT, 120 U SuperScriptIII und 240 U RNase-Inhibitor. Wasser In den Endvolumen von 10 & mgr; l. In 10 ul der Master-Mix, um RNA-Mischung, Flick, zu mischen und zu drehen, um zu sammeln. Inkubieren Mischung für 90 min bei 50 ° C, um die Synthese von cDNA zu ermöglichen. Proben für 15 min bei 70 ° C bis reverse Transkriptase zu inaktivieren. Halten bei 4 ° C nach Bedarf. In 2 U von RNase H, Flick zu mischen, und dann drehen, um zu sammeln. Inkubieren Sie 20 Minutenbei 37 ° C. Speicher cDNA bei -20 ° C. 5.3) cDNA Quantifizierung Mit qPCR-System Bereiten Sie eine Standardverdünnungsreihen. Do 10-fache serielle Verdünnung von 3 x 10 6 Kopien / pl bis zu 30 Kopien / pl, der pNL4-3VifA. Verwenden Sie destilliertes Wasser für Verdünnungen. Bereiten Sie die Standardverdünnungsreihen frisch vor Gebrauch oder bereiten Kleinserien und behalten bei -20 ° C. Nicht Einfrieren und Auftauen der Standards mehr als dreimal. Ein 96-Loch-qPCR Reaktionsplatte gesetzt. Sicherzustellen, dass jede Platte ein Duplikat jeder cDNA-Probe enthält mindestens ein Bohrloch von negativen Kontrollen, einer dreifachen der Standardverdünnungsreihe und wenigstens. Für jede qPCR Reaktion verwenden 12,5 ul qPCR Mastermix, 0,2 & mgr; M Sonde jeweils 0,8 uM der Vorwärts- und Rückwärts-Primer und 1 & mgr; l cDNA oder der Standardverdünnungsreihe oder Wasser / Puffer (für die Negativkontrolle). Fügen Sie Wasser bis zu einem Endvolumen von 25 ul. Der qPCR-Sonde ist leicht senempfindlichen. Halten Sie es in geschlossenen Behälter. Um cDNA aus pNL4-3VifA basierte molekulare Klon abgeleitet erfassen, verwenden Sie den Vifa Primer-Sonde: VifAB Vorwärtsprimer (GGTCTGCATACAGGAGAAAGAGACT), Vifa Rückwärts-Primer (5'-AGGGTCTACTTGTGTGCTATATCTCTTTT-3 ') und VifAB Sonde (6FAM-5'-CTCCATTCTATGGAGACTC-3 '-MGBNFQ). Für cDNA aus pNL4-3VifB basierend Klon abgeleitet, verwenden Sie die VIFB Primer-Sonde: VifAB Vorwärtsprimer, VifAB Sonde und VIFB Rückwärts-Primer (5'-CACCTGCGTGCTATACCTTTTCT-3 '). Eingestellt PCR Zyklusparameter auf 50 ° C für 2 min, 95 ° C für 10 min und 40 Zyklen von 95 ° C für 15 sec und 60 ° C für 1 min. Wenden Sie sich im Support-Dokument für den Betrieb der qPCR Maschine des Herstellers. Berechnen einer Standardkurve unter Verwendung von Daten aus der dreifachen Standardverdünnungsreihen. Vergleichen Verstärkungsdaten der cDNA-Probe mit der Standardkurve, um die Kopienzahl zu bestimmen. Wenden Sie sich im Support-Dokument des Herstellers für data Verarbeitung. 5.4) Bestimmen Sie Viral exponentiellen Wachstumsphase Plotten viralen Wachstumskinetik der Beprobungstag entlang der X-Achse und der cDNA-Kopienzahl in der Y-Achse und die Identifizierung der viralen exponentiellen Wachstumsphase, dh., Wenn die virale cDNA-Kopienzahlen in einer exponentiellen Zunahme Progression. Verwenden Sie die GRC Web-Tool ( http://indra.mullins.microbiol.washington.edu/grc/ ), virale Wachstumsrate (g) zu berechnen. In dieser Anmeldung wird der GRC Werkzeug akzeptiert cDNA-Kopienzahlen von mindestens zwei Zeitpunkte als Eingabe und gibt das Viruswachstum (g). Nur Zeitpunkt Daten innerhalb der exponentiellen Wachstumsphase (siehe Schritt 5.4.1 oben), um eine genaue Wachstumsraten zu erzielen. Für eine detaillierte Beschreibung des mathematischen Modells in der GRC Web-Tool verwendet werden, siehe 20. 6. Growth Competition Assay Saatgut 3 x 10 5 </ Sup> PHA-stimulierten PBMCs (oder 1 x 10 5 CEM × 174-Zellen) in 500 ul Gesamtvolumen pro Vertiefung einer 48-Loch-Flachbodenplatte. Halteplatte in 37 ° C in einem 5% CO 2 Atmosphäre bis Inokulation. Für jedes Virus, vorbereiten 3 ml Inokulum enthält 6.000 IE. Übertragen 1,5 ml jeder viralen Inokulum in ein steriles Röhrchen, das Doppelinfektion Inokulum zu schaffen. Gib 500 & mgr; l des Dual-Inokulum (1500 IU) bis 3 x 10 5 Zellen in einer 48-Well-Platte. Das endgültige Kulturvolumen beträgt 1 ml / Vertiefung. 200 ul Aliquot der Impfkultur auf zwei 96-Well-Platten für die RNA-Isolierung; speichern Sie eine Platte als Backup. Inokulierten Zellen bei 37 ° C mit 5% CO 2 -Atmosphäre für 16-24 Std. Wash Kulturen 16-24 h nach der Inokulation. Entfernen und entsorgen Sie 750 ul Kulturüberstand. In 750 ml frisches cIMDM. Wickeln Sie Platten in Plastikfolie und Spin für 10 Minuten bei 300 x g. Entfernen und entsorgen Sie 75081; l Überstand. In 750 ml frisches cIMDM. Inkubieren bei 37 ° C mit 5% CO 2 -Atmosphäre (Tag 1). Auswahl Abtastzeiten mindestens 3 Zeitpunkte innerhalb der in Schritt 5.4.1 beobachtet exponentiellen Wachstumsphase enthalten. Für jede Probenahme, folgen Sie Schritt 5.1.7. CDNA-Synthese durchzuführen, wie in Abschnitt 5.2 beschrieben. Bestimmen Sie die Virusvariante Verhältnis mit qPCR. Bereiten Sie einen standardmäßigen seriellen Verdünnungsreihe in dreifacher Ausfertigung, Verdünnung 10-fache in jedem Schritt von 3 x 10 6 Kopien / pl bis 30 Kopien / ul pNL4-3VifA. Ein 96-Loch-qPCR Reaktionsplatte gesetzt. Sicherzustellen, dass jede Platte mindestens eine negative Kontrolle, die Standardverdünnungsreihen in dreifacher Ausführung und Duplikate von jeder cDNA-Probe. Für jede qPCR Reaktion verwenden 12,5 ul qPCR Master Mix, 0,2 & mgr; M Sonde jeweils 0,8 uM der Vorwärts- und Rückwärtsprimer und 1 ul cDNA oder der Standard d ilution Serie oder Wasser / Puffer (für die negativen Kontrollvertiefungen). Fügen Sie Wasser bis zu einem Endvolumen von 25 ul. Der qPCR-Sonde ist lichtempfindlich, halten Sie es in geschlossenen Behälter. Verwenden die VIFA Primer-Sonde, um Signale in den Negativ-Kontrollen und der Standardverdünnungsreihe und mit einem Duplikat der cDNA-Probe zu detektieren. Verwenden Sie die VIFB Primer-Sonde mit der anderen Duplikat der cDNA-Probe. Eingestellt PCR Zyklusparameter auf 50 ° C für 2 min, dann 95 ° C für 10 min und dann 40 Zyklen von 95 ° C für 15 sec und 60 ° C für 1 min. Wenden Sie sich im Support-Dokument für den Betrieb der qPCR Maschine des Herstellers. Berechnen Sie die Standardkurve unter Verwendung Verstärkung Daten aus dem Standard-Verdünnungsreihe. Vergleichen Verstärkungsdaten der cDNA-Proben mit der Standardkurve zu Kopienzahl zu bestimmen. Wenden Sie sich im Support-Dokument für die Datenverarbeitung des Herstellers. Verwenden Sie die GRC Web-Tool (ol.washington.edu/grc/">http://indra.mullins.microbiol.washington.edu/grc/), um die relative virale Fitness (d) zu berechnen. ANMERKUNG: Das GRC Werkzeug akzeptiert cDNA Kopienzahl vorliegen oder Chromatogramm Peakhöhen von mindestens zwei Zeitpunkte als Eingabe und gibt die Netto-Wachstumsrate Differenz (d) zwischen den beiden Viren. Während das Werkzeug können die Netto-Wachstumsrate von zwei Zeitpunktdaten zu berechnen, ist es dringend, um Eingangsdaten von drei oder mehr Zeitpunkten empfohlen. Verwenden nur aus Zeitpunkten innerhalb der exponentiellen Wachstumsphase erhaltenen Daten (siehe Schritt 5.4), um genaue Wachstumsraten zu erhalten. Für eine detaillierte Beschreibung des mathematischen Modells in der GRC Web-Tool verwendet werden, siehe 20. Bestimmen Sie mit Hilfe viraler Verhältnisse Chromatogramm Spitzenhöhen PCR Amplifikation HIV-1 vif Fragmente, die die VifAB Sequenz-Tag mit VifFwd (5'-GAAAGAGACTGGCATTTGGGTCAGGG-3 '; HXB2 Positionen 5266 bis 5291) und VifRev Primer (5'-GTCTTCT GGGGCTTGTTCCATCTGTCC-3 '; HXB2 Positionen 5579 bis 5553). Für jede PCR-Reaktion verwendet 1 ul cDNA, 1x NH 4 Puffer, 1,5 mM MgCl 2, 0,2 mM dNTP, 2,5 U Taq-Polymerase und 0,45 & mgr; M von jedem Primer. Fügen Sie Wasser bis zu einem Endvolumen von 50 ul. Eingestellt PCR Zyklusparameter zu 3 Zyklen bei 94 ° C für 1 min, 55ºC für 1 min und 70ºC für 1 min, gefolgt von 34 Zyklen bei 94 ° C für 15 sec, 58 ° C für 30 sec, und 70 ° C für 1 min, und anschließend Halten bei 4 ° C. Reinige PCR-Produkte unter Verwendung des QIAquick PCR-Purification-Kit nach Vorschrift des Herstellers. Absenden gereinigten PCR-Produkte auf eine DNA-Sequenzierung Dienstleister für Sanger-Sequenzierung. Überprüfen Sie die durchschnittliche Lesequalitätsfaktor, der durch die Sequenzierung Service zur Verfügung gestellt werden sollen. Wenn die durchschnittliche Basis Anruf Genauigkeit von weniger als 85%, Redo-Schritt 6.10.1 bis 6.10.3 Verwenden Sie das Web-Tool ChromatQuan (f="http://indra.mullins.microbiol.washington.edu/cgi-bin/chromatquant.cgi">http://indra.mullins.microbiol.washington.edu/cgi-bin/chromatquant.cgi ) um virale Verhältnis zu jedem Zeitpunkt zu berechnen. Das Werkzeug erfordert die Sequenz Trace-Datei (* .ab1) und die Sequenz 5 'zu der Nukleotidposition von Interesse. Das Instrument misst eine Peak-Intensität bei dem angegebenen Ort. Das Verhältnis der Peakintensität entspricht dem Verhältnis der beiden Viren (4B). Verwenden Sie die GRC Web-Tool ( http://indra.mullins.microbiol.washington.edu/grc/ ) und die aufgezeichneten Spitzenintensitäten als Eingabe für virale relativen Fitness (d) zu berechnen. 20 Siehe Schritt 6.10.6.