Парные Рост конкуренции Анализ для определения репликации Фитнес человека вируса иммунодефицита

ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол, как описано ниже, не включает в себя пациента информацию, и, таким образом, не рассматривается человека Субъекты Исследования Университета Вашингтона институциональной наблюдательного совета или Отдел людях. 1. Строительство химерных ВИЧ-1 NL4-3 молекулярных клонов 1.1) Усиление Вставить Фрагмент ДНК Дизайн химерных праймеров. 5'половинки и прямого и обратного праймеров содержать вектор последовательность ВИЧ-1, при котором фрагмент будет вставлен. 3 'половину из праймеров должен содержать конец последовательности вставки (рисунок 2). Убедитесь, что химерные праймера сохраняет оригинальные открытые рамки считывания. Использование праймеров по крайней мере 20 оснований в длину, с температурой плавления, большей или равной 60 ° С, ~ 50% содержанием GC и низкой тенденцией к образованию димеров праймеров, гетеродимеры и / или шпильки структуры. Оценить эти свойствас помощью веб-инструмента OligoAnalyzer ( https://www.idtdna.com/analyzer/Applications/OligoAnalyzer/ ). Использование ПЦР 27 и химерные праймеры для амплификации ДНК-вставки (рисунок 2). Для каждой реакции ПЦР, используйте 1X высокой точностью буфер, 0,2 мм дНТФ, 1 U высокой верности ДНК-полимеразы, 0,5 мкМ вперед химерного праймера, 0,5 мкМ обратного праймера химерных и 1 pg0 нг образца ДНК, несущего вставки региона. Добавить дН 2 O до конечного объема 50 мкл. Установите тепловые действия велосипедные следующим образом: Выполните начальную стадию денатурации ДНК при 98 ° С в течение 10 сек. Amplify 30 циклов денатурации ДНК при 98 ° С в течение 10 сек и ДНК отжига при температуре 3 ° С выше самой низкой температуры плавления двух праймеров для 20 сек. Выполнение конечным удлинением при 72 ° С в течение 10 мин. Хранить продукты ПЦР при 4 ° С. Возьмите 5 мкл ПЦР-продуктов изпредыдущий шаг и запустить агарозном геле 28. Использование 0,7% агарозном геле, 1x TAE буфер (40 мМ Трис-ацетат, 1 мМ ЭДТА), 0,5 мкг / мл этидий бромид (EtBr) конечной концентрации и 1 кб лестнице в качестве размера ДНК маркера. Набор напряжения источника питания до 5 В / см расстояния между электродами. Остановка электрофореза, когда загрузка краситель мигрирует через примерно 2/3 длины геля. Представьте себе гель, используя систему документации геля 28. ПРИМЕЧАНИЕ: EtBr является канцерогеном и должны быть утилизированы неправильно, за правилами учреждения. Перчатки должны всегда носить при работе с гелями, содержащие EtBr. Замените их на новые перчатки после обработки закончить EtBr материала, содержащего и до обработки других материалов или оборудования для предотвращения перекрестного загрязнения. Если только одна полоса ДНК с размером, соответствующим желаемому продукту ПЦР обнаружено, очистить остальную часть продукта ПЦР с использованием коммерческого набора, такие как ПЦР QIAquick набора для очистки соответствииING с протоколами производителя. Если другие, неспецифические полосы также присутствуют, использовать остальную часть продукта ПЦР для запуска препаративного гель-электрофореза. Используйте те же параметры и условия, указанные в пункте 1.1.4. Убедитесь, что также гель является достаточно большим, чтобы загрузить ~ 45 мкл ПЦР-продуктов. Вырежьте полосу интерес и извлечь ДНК из геля с использованием набора для экстракции QIAquick гель в соответствии с протоколами производителя. 1.2) Введем Вставить фрагмент в полной длины инфекционных ВИЧ-1 подтипа B Vector (pNL4-3) Используйте очищенные продукты ПЦР с шага 1.1.5 как ПЦР-праймеров. Используйте pNL4-3VifA 20 в матричной ДНК в одном ПЦР и использовать pNL4-3VifB 20 в качестве шаблона в другой реакции (рис 2). Для каждой реакции ПЦР, использовать буфер 1x высокой точностью, 0,2 мМ дНТФ, 2 ед High Fidelity ДНК-полимеразы, 500 нг праймера ДНК и 50 нг ДНК-матрицы в конечном обумэ 50 мкл. Установка тепловых параметров велосипедные чтобы: 98 ° С в течение 30 сек, 35 циклов при 98 ° С в течение 10 сек, 48 ° С в течение 1 мин и 72 ° С в течение 10 мин, затем 72 ° С в течение 10 мин. Добавить 10 U ДПН я к 50 мкл ПЦР-реакции и инкубировать при 37 ° С в течение 1 часа, чтобы переварить матричной ДНК. Убедитесь, что плазмидную ДНК выделяли из метилирования компетентным бактериального штамма, например., TOP10 химически компетентным кишечной палочки. Использование Dpn переваренного продукта, чтобы трансформировать компетентные клетки бактерий. Используйте теплового шока трансформацию TOP10 химически компетентную E. палочка, в соответствии с протоколом производителя. Чтобы выбрать для бактериальных клеток, содержащих рекомбинантную плазмиду, используют бульон Лурии (LB) культуральные планшеты, содержащие 100 мг / л карбенициллина. Pick ~ 10 хорошо разделенных колонии растут и каждый в отдельности в 3 мл LB жидкой среде, содержащей 100 мг / л карбенициллина и инкубируют при 30 ° С вШейкер O / N. Использование QIAprep Spin Miniprep набор для выделения плазмидной ДНК из бактериальной культуральной жидкости, в соответствии с протоколом производителя. Используйте двойной рестрикции пищеварение 29, чтобы определить, содержит ли ДНК плазмиды надлежащего вставки. Убедитесь, что один из сайтов рестрикции существует только в области вставки, а другой сайт рестрикции существует только один раз в векторе ВИЧ-1, за пределами области вставки. Дайджест по крайней мере, 300 нг плазмидной ДНК в 10 мкл конечного объема реакционной смеси. Выберите буферы ограничения, температура инкубации и времени инкубации по протоколу производителя выбранных ферментов рестрикции. Возьмите 9 мкл переваренной ДНК и запустить гель-электрофореза, как описано в шаге 1.1.4. Выберите рекомбинантные плазмиды, которые имеют группы ДНК прогнозируемых размеров. Подтверждение целостности последовательности рекомбинантных плазмид Sanger секвенирования. В то время как редкий, нежелательныемутации (ы) может быть введен во ПЦР-реакций. Последовательность обе нити ДНК плазмиды. Следуйте инструкциям в шаге 1.1.1.1 дизайн праймеры для секвенирования. Кроме того, убедитесь, что прямого и обратного праймеров секвенирования отжиг по меньшей мере 50 п.н. выше и ниже области вставки в рекомбинантной плазмиде, соответственно. Отправить плазмиды ДНК и праймеры для секвенирования с коммерческим провайдером услуг секвенирования ДНК. Подготовка образца ДНК и праймеров, как указано поставщиком услуг. Сделать эндотоксина фри мутантного ДНК плазмиды с использованием набора бесплатно плазмидной ДНК эндотоксина в соответствии с протоколом производителя. Подготовьте по крайней мере, 1 мкг эндотоксина свободной ДНК плазмиды для трансфекции на следующей стадии. 1.3) Представьте Малый Мутации через сайт-направленного мутагенеза Дизайн мутагенных праймеров с перекрытием прямого и обратного праймеров, содержащих требуемую Mutatион (ы). Расположите базу (ы) должны быть заменены, встроены или удален в середине праймеров, в окружении 10-15 гомологичных оснований. Следуйте инструкциям в шаге 1.1.1.1. Используйте ПЦР для синтеза мутантных плазмид. Для каждой реакции ПЦР, использовать буфер 1x высокой точностью, 10 мМ дНТФ, 2 ед High Fidelity ДНК-полимеразы, 0,5 мкМ вперед мутагенного праймера, 0,5 мкМ обратного мутагенного праймера и 50 нг химерного pNL4-3VifB, с шага 1.2.6 , в конечном объеме 50 мкл. Установка тепловых параметров велосипедные чтобы: 98 ° С в течение 30 сек, 25 циклов при 98 ° С в течение 10 сек, 48 ° С в течение 1 мин и 72 ° С в течение 10 мин, затем 72 ° С в течение 10 мин. Повторите шаг 1.2.2 для 1.2.6. 2. Генерация вирусный штамм Использование трансфекции Рассчитать количество вирусных фондовой желании и плазмидной ДНК требуется. С титра вируса 10 4 МЕ / мл или выше, 1,8 мл вирусного наличии достаточно для двух комплектов конкуренции рост АссаYS, в том числе моноинфекциями, каждый сделал в трех экземплярах. Для трансфекции сделано в 6-луночный планшет, около 1,8 мл супернатант собирают на лунку. Один мкг плазмидной ДНК необходима для каждой трансфекции сделано в 6-луночный планшет. Для каждой лунке 6-луночного планшета, готовят 100 мкл трансфекции смеси, например., Состоящий из 1 мкл X-tremeGENE 9 реагента для трансфекции (или сопоставимый продукт), 1 мкг плазмидной ДНК и бессывороточной DMEM. Определить объем плазмидной ДНК, необходимой, используя 1 мкг плазмидной ДНК на лунку. Убедитесь, что конечная концентрация плазмидной ДНК, по крайней мере 50 нг / мкл. Определить, сколько бессывороточной среде Игла (DMEM) необходим на лунку, используя формулу: Общий объем DMEM в мкл = 100 мкл – объем ДНК мкл. Добавить 10 6 HEK 293T-17 (АТСС) клеток / лунку в 2 мл распространения среды Игла (DMEM + 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS)) в 6-луночный планшет. Инкубировать в течение 1 ч при 37 ° С в5% атмосфере СО 2. Семенной столько скважин при необходимости (определяется на этапе 2.1). Для приготовления смеси для трансфекции, аликвоту соответствующий объем бессывороточной DMEM, как рассчитано выше, в 1,8 мл полипропиленовую центрифужную пробирку, а затем добавить реагента для трансфекции. Внесите реагент непосредственно в раствор массовой информации, не добавляйте его в пластиковой поверхности трубки микроцентрифужных. Добавить в прошлом плазмиды ДНК. Внесите вверх и вниз, осторожно, чтобы перемешать раствор. Инкубировать в течение 15 мин при комнатной температуре (15 ° С до 25 ° С), чтобы позволить образование трансфекции комплексов. Добавить смесь в каплям таким образом, чтобы клетки высевают в пластине 6-а. Слегка встряхните или закружить в колодцы, чтобы обеспечить равномерное распределение трансфекции комплексов. Печать пластины с пластиковой пленкой. Инкубируйте культур при 37 ° С в 5% СО 2 атмосферы в течение 48 ч. Используйте пипетку тщательно собирать и передавать супернатант в 15 мл трубки throuGH вершину 0,22 мкм фильтра. Использование пипетки для передачи 250 мкл или более отфильтрованной надосадочной жидкости до 1,8 мл микроцентрифужных пробирках с резиновыми прокладками в крышках. Магазин фильтруют супернатанты при -80 ° С до использования. 3. Определить Инфекционный титр вирусных запасов на мононуклеарных клеток периферической крови (МНПК) Стимулировать МНПК фитогемагглютинином (PHA). За один вирусный штамм, семян 2 х 10 6 РВМС в модифицированной среде Дульбекко полном Искова (cIMDM; IMDM с добавлением 20 ед / мл человеческого интерлейкина 2 (ГИП-2), 10% фетальной бычьей сыворотки и 1% пенициллина / стрептомицина), дополненной ФГА (1,5 мкг / мл). Семенной РВМС на 2 × 10 6 клеток / мл. Инкубируйте РВМС при 37 ° С в 5% СО 2 атмосферы в течение 72 ч. Урожай PHA стимулирует МНПК. Передача неприлипающими PHA-МНПК к 50 мл коническую пробирку. Спин трубку при 228 мкг в течение 10 мин. Осторожно снимите супернатант, не disruptinг осадок клеток. Повторное приостановить осадок клеток в конечной концентрации 2 × 10 5 РВМС / мл в cIMDM. Семенной 2 х 10 4 ФГА PBMC, стимулированных / лунку в 100 мкл / лунку в cIMDM с круглым дном 96-луночного планшета. Сделать разбавление вирусной складе 1:10. Затем из первого разбавленной складе, чтобы двенадцать 3-кратные серийные разведения в мастер 96-луночного планшета. Эта схема разбавления рекомендуется для обнаружения вирусные титры в диапазоне от 10 4 до 10 6 инфекционное отделение (МЕ) на мл. Например, можно добавить 20 мкл вирусного штамма 180 мкл среды в 1,5 мл пробирку. Смешайте разбавления с помощью пипетки осторожно. Затем перенесите 90 мкл разбавленного складе в 180 мкл среды первой скважины и хорошо перемешать с помощью пипетки. Продолжить серию разбавления путем передачи 90 мкл из текущего скважины до 180 мкл среды в следующую лунку еще одиннадцать раз. Увеличение или уменьшение начального разбавления, если титры выше, чем 10 6 МЕ / млили ниже, чем 10 4 МЕ / мл, как ожидается, соответственно. Добавить 40 мкл серийно разведенного вирусного складе с мастер разбавления пластины к пластине сеяной МНПК (со стадии 3.3) в четырех экземплярах. Планшеты инкубируют при 37 ° С в 5% СО 2 атмосферы в течение 16-24 ч. Осторожно удалить 100 мкл супернатанта из каждой лунки, и заменить 160 мкл свежей cIMDM до общего объема 200 мкл / лунку. Планшеты инкубируют при 37 ° С с 5% СО 2 атмосферы (1 день). В дни 4, 7, 10 и 13 передачи 100 мкл супернатанта из каждой лунки 100 мкл буфера нарушения (2% Тритон Х-100 в PBS), и заменить 100 мкл свежей cIMDM. Хранить супернатантов при -20 ° С. Держите проб и добавления свежей cIMDM каждые три дня, пока титр не стабилизируется. Определить 50% зараженной культуры ткани дозу (TCID 50) вируса складе по р24 ELISA с использованием 7 день и 13 пробы, как описано в пункте 4. Если TCID 50 получают из 13-й день явно выше, чем титр от 7 день, вирус складе, возможно, потребуется больше времени, чтобы расширить. Повторите р24 ELISA с использованием более поздние образцы до инфекционные титры из двух проб моменты времени не станет стабильным (или уменьшение). Выберите запасы из образцов с высоким титром. 4. ELISA (связанный Immunoabsorbant анализ) Обнаружение ВИЧ-1 p24 для определения титра вирусных инфекционных ПРИМЕЧАНИЕ: Следующий протокол был разработан с использованием антигена р24 захвата пластины, приготовленные в нашей лаборатории 30. Коммерческий ВИЧ-1 р24 ELISA пластины / комплекты могут быть также использованы, в соответствии с протоколом производителя. До работы с образцами, готовить рабочие запасы первичного антитела (кролик анти-ВИЧ-1 р24 SF2 антисыворотки). Оттепель р24 антисыворотку при комнатной температуре. Смешайте 2,5 мл глицерина с 2 мл 10% FBS в Phosphatе буфер солевой раствор (PBS). Добавить 0,5 мл антисыворотки, перемешать. Магазин 1 мл аликвотах при -20 ° C. Оттепель образцы шагом 3,7 в 37 ° C инкубатора. Вымойте P24 захватить пластина 5 раз промывочным буфером (PBS 1x с 0,05% Tween-20). Добавить 50 мкл / лунку Разбавитель образца (1% бычьего сывороточного альбумина (БСА), 0,2% Твин-20 в RPMI-1640), а затем добавить 50 мкл образца в соответствующие лунки. Включите по крайней мере три скважины с разбавителя образца только как макет / отрицательных контролей. Инкубируют в течение 2 ч при 37 ° С или O / N при 4 ° С. Подготовка первичный раствор антител свежий перед использованием. Сделать 1: 2000-кратное разбавление первичного антитела рабочей запасов с использованием разбавитель первичных антител (12% FBS в RPMI-1640). Обеспечить, чтобы подготовить достаточно для использования 100 мкл раствора на каждой пробы / контроль скважины в 96-луночный планшет. Например, чтобы сделать достаточно решение в течение одного 96-луночного планшета, добавляют 5 мкл первичных антител Workiнг запасов в разбавителе первичных антител до конечного объема 10 мл. Вымойте захватить пластина 5 раз промывочным буфером. Добавьте 100 мкл раствора первичных антител в каждую лунку. Инкубируют в течение 1 ч при 37 ° С в 5% СО 2 атмосферы. Подготовка вторичного свежего раствора антител перед использованием. Сделать 1: 14400-кратное разбавление вторичных антител (1 мг / мл козьих антител против кроличьего HRP) с помощью вторичного антитела разбавитель (7% FBS, 0.01% Твин-20 в RPMI-1640). Для уменьшения ошибок пипетки, выполнить два шага серийное разведение. Обеспечить, чтобы подготовить достаточно для использования 100 мкл раствора на каждой пробы / контроль скважины в 96-луночный планшет. Например, чтобы сделать достаточно решение в течение одного 96-луночного планшета, сначала добавить 1 мкл вторичного антитела к 99 мкл вторичного антитела разбавителем. Затем добавляют 70 мкл первого разведения до вторичного антитела разбавителя для конечного объема 10 мл. Вымойте захвата пластины 5 тимES с промывочного буфера. Добавьте 100 мкл раствора вторичного антитела в каждую лунку. Инкубируют в течение 1 ч при 37 ° С в 5% СО 2 атмосферы. Промывают планшет 5 раз промывочным буфером. Добавить 100 мкл субстрата ТМВ РТ. Инкубируют 30 минут при комнатной температуре в закрытом контейнере для защиты от света. Добавить 100 мкл стоп-раствора RT (1 NH 2 SO 4). Оптическую плотность при 450-650 нм в каждой лунке с помощью микропланшет-ридера. Используйте значение абсорбции забить друг также зараженного или неинфицированных. Рассмотрим хорошо содержать инфекционный вирус, если значение оптической плотности, по крайней мере в три раза выше, чем значение из ложных / отрицательный скважин управления. Рассчитать TCID 50 вирусного складе методом Рида-Meunch 31. 5. Установите Вирусный кинетика роста 5.1) Моноинфекция Семена 3 х 10 5 РНА-стимулированные РВМС / лунку в 48-луночный планшетс в общем объеме 500 мкл / лунку. Держите культуру пластин при 37 ° С в 5% СО 2 атмосферы до прививки. Для каждого вируса, подготовить инокулята, содержащего 6000 МЕ в 2 мл cIMDM. Посев скважин в трех экземплярах добавлением 500 мкл инокулята (1500 МЕ) с семенами клеток. Конечный объем культуры инфицированная клетка 1 мл / лунку и МВД 0,005. Алиготе 200 мкл оставшейся посевного к каждой из двух 96-луночных планшетах для выделения РНК, один из которых сохраняется в качестве резервного. Инкубируйте культур при 37 ° С в 5% СО 2 атмосферы в течение 16-24 ч. Вымойте культуры 16-24 ч после прививки. Снимите и выбросьте 750 мкл супернатанта культуры. Добавить 750 мкл свежей cIMDM. Оберните пластин в пластиковой упаковке и спина в течение 10 минут при 300 х г. Снимите и выбросьте 750 мкл супернатанта. Добавить 750 мкл свежей cIMDM. Инкубируют при 37 ° С с 5% CO 2 вмосферу (1 день). Примеры культур ежедневно с 2 дня до 7 дня. Передача 500 мкл супернатанта культуры в 1,8 мл центрифужную пробирку. Спин в течение 1 мин при 3000 х г. Передача 200 мкл бесклеточного супернатанта в двух выборок 96-а для выделения РНК, снова экономия одну пластину в качестве резервного. Магазин супернатанты при -80 ° С до выделения РНК. Добавить 500 мкл свежей cIMDM для каждой культуры. Инкубируют при 37 ° С в 5% СО 2 атмосферы. Откажитесь культур в Wescodyne в конце эксперимента. Изолировать РНК из 200 мкл супернатанта (использование коммерческих наборов, таких как QIAamp РНК вируса Mini Kit) следующих стандартного протокола производителя. Для большого числа образцов, с помощью набора Qiagen QIAxtractor. Образцы магазин РНК при -80 ° С до синтеза кДНК. 5.2) Синтез кДНК (обратной транскрипции) Для каждого РНК сдостаточно добавить 1,2 нмоль дНТФ и 1,2 пмоль праймера дл синтеза кДНК, (5'-GTTGATCCTTTAGGTATCTTTCCACAGC-3 ', НХВ2 нуклеотидную 7968 до 7995) к 10 мкл вирусной РНК. Добавьте воду до конечного объема 14 мкл. Flick трубку для смешивания и кратко вращаться для сбора жидкости на дне пробирки. Инкубируют смесь в течение 5 мин при 65 ° С, а затем провести при 4 ° С до тех пор, пока мастер смесь подготовлена. Подготовьте основной смеси с помощью 5x первой нити буфера (250 мМ Трис-HCl, рН 8,3, 375 мМ KCl, 15 мМ MgCl 2), 5 мМ ДТТ, 120 ед SuperScriptIII и 240 U РНКазы ингибитор. Добавьте воду до конечного объема 10 мкл. Добавьте 10 мкл мастер смеси для РНК смеси, фильм, чтобы смешать и спин собирать. Инкубируют смесь в течение 90 мин при 50 ° С, чтобы позволить синтез кДНК. Инкубировать в течение 15 мин при 70 ° С для инактивации обратной транскриптазы. Удержание при 4 ° С по мере необходимости. Добавить 2 U РНКазы Н, фильм, чтобы смешать, а затем спина, чтобы собрать. Выдержите 20 минутпри 37 ° С. Магазин кДНК при -20 ° С. 5.3) кДНК Количественное Использование КПЦР системы Подготовьте стандартный ряд разбавления. У 10-кратное серийное разведение, от 3 ​​х 10 6 копий / мкл до 30 копий / мкл, в pNL4-3VifA. Используйте дистиллированную воду для разведения. Подготовьте стандартное разведение ряд свежий перед использованием или подготовить небольшие партии и держать при температуре -20 ° C. Не замораживать-оттаивать стандартов более чем в три раза. Настройка 96-а КПЦР реакции пластину. Убедитесь, что каждая пластина содержит, по меньшей мере, одну лунку отрицательного контроля, в трех экземплярах стандартной серии разведений, и по крайней мере дубликат каждого образца кДНК. Для каждой реакции КПЦР, использовать 12,5 мкл КПЦР мастер смеси, 0,2 мкМ зонда, 0,8 мкм каждого из прямого и обратного праймеров и 1 мкл кДНК или стандарт серии разведений или вода / буфер (для отрицательного контроля). Добавьте воду до конечного объема 25 мкл. КПЦР зонд свет сенаsitive. Держите его в закрытом контейнере. Для обнаружения кДНК, полученную из основанного pNL4-3VifA молекулярной клона, использовать VIFA праймера-зонд: VifAB прямого праймера (GGTCTGCATACAGGAGAAAGAGACT), VIFA обратный праймер (5'-AGGGTCTACTTGTGTGCTATATCTCTTTT-3 ') и VifAB зонд (6FAM-5'-CTCCATTCTATGGAGACTC-3 "-MGBNFQ). Для кДНК, полученной из клона, основанной pNL4-3VifB, использовать VifB праймера-зонд: VifAB прямой праймер, VifAB зонд и VifB обратного праймера (5'-CACCTGCGTGCTATACCTTTTCT-3 '). Установка параметров велосипедные ПЦР до 50 ° С в течение 2 мин, 95 ° С в течение 10 мин, и 40 циклов 95 ° С в течение 15 сек и 60 ° С в течение 1 мин. Обратитесь поддержки документ производителя для работы машины КПЦР. Рассчитать стандартную кривую, используя данные из трех экземплярах стандартной серии разбавления. Сравнение данных амплификации образца кДНК стандартной кривой для определения числа копий. Обратитесь поддержки документ производителя для DAобработка та. 5.4) Определить Вирусный экспоненциальный рост этап Участок вирусные кинетику роста с днем дискретизации вдоль оси Х и числа копий кДНК вдоль оси ординат и определить вирусную экспоненциальной фазе роста, то есть., Когда вирусные кДНК копировать номера увеличение в экспоненциальной прогрессии. С помощью веб-инструмента GRC ( http://indra.mullins.microbiol.washington.edu/grc/ ) для расчета вирусной темпы роста (г). В этом приложении, инструмент GRC принимает кДНК копировать номера из по меньшей мере двух временных точках в качестве входных данных, и выводит вирусный рост (G). Используйте только данные момент времени в экспоненциальной фазе роста (см шаг 5.4.1 выше), чтобы получить точные темпы роста. Для более подробного описания математической модели, используемой в веб-инструмента GRC, см 20. 6. Рост конкуренции Анализ Семя 3 х 10 5 </ SUP> PHA-стимулированных РВМС (или 1 × 10 5 клеток CEMx174) в 500 мкл общего объема на лунку в 48-луночных плоским дном пластины. Держите тарелку 37 ° С в 5% СО 2 атмосферы до прививки. Для каждого вируса, подготовить 3 мл инокулята, содержащего 6000 МЕ. Передача 1,5 мл каждого вирусного посевного материала в стерильную пробирку, чтобы создать двойной инфекцией инокулята. Добавить 500 мкл двойной инокулята (1500 МЕ) 3 х 10 5 клеток в 48-луночный планшет. Конечный объем культура 1 мл / лунку. Аликвоты 200 мкл инокулята в двух 96-луночных планшетах для выделения РНК; сохранить одну пластину в качестве резерва. Инкубируйте инокулированных клеток при 37 ° С с 5% CO 2 атмосфере в течение 16-24 ч. Вымойте культуры 16-24 ч после прививки. Снимите и выбросьте 750 мкл супернатанта культуры. Добавить 750 мкл свежей cIMDM. Оберните пластин в пластиковой упаковке и спина в течение 10 мин при 300 х г. Снимите и выбросьте 75081; л супернатанта. Добавить 750 мкл свежей cIMDM. Инкубируют при 37 ° С с 5% CO 2 атмосфере (1 день). Выберите время выборки, чтобы включать по меньшей мере 3 очка времени, в течение экспоненциальной фазы роста, наблюдаемого в стадии 5.4.1. Для каждого отбора проб, выполните шаг 5.1.7. Выполните синтеза кДНК, как описано в разделе 5.2. Определить вирусную соотношение вариант, используя КПЦР. Приготовьте серию стандартных серийных разведений в трех экземплярах, разбавляя в 10 раз на каждом этапе от 3 ​​× 10 6 копий / мкл до 30 копий / мкл pNL4-3VifA. Настройка 96-а КПЦР реакции пластину. Убедитесь, что каждая пластина содержит по меньшей мере один отрицательный контроль, стандартный ряд разбавления в трех экземплярах, и дубликаты каждого образца кДНК. Для каждой реакции КПЦР, использовать 12,5 мкл КПЦР Master Mix, 0,2 мкМ зонд, 0,8 мкМ каждого из прямого и обратного праймеров и 1 мкл кДНК или Стандарт D ilution серии или вода / буфер (для отрицательных контрольных лунках). Добавьте воду до конечного объема 25 мкл. КПЦР зонд является светочувствительным, держать его в закрытом контейнере. Используйте Vifa праймера-зонд для обнаружения сигналов в отрицательных контролей и стандартного серии разведений и с одной дубликата образца кДНК. Используйте VifB праймера-зонд с другой дубликат образца кДНК. Установка параметров велосипедные ПЦР до 50 ° С в течение 2 мин, затем 95 ° С в течение 10 мин, а затем 40 циклов при 95 ° С в течение 15 сек и 60 ° С в течение 1 мин. Обратитесь поддержки документ производителя для работы машины КПЦР. Рассчитайте стандартную кривую, используя данные амплификации из стандартного ряда разведения. Сравнение данных амплификации образцов кДНК с калибровочной кривой для определения числа копий. Обратитесь поддержки документ производителя для обработки данных. С помощью веб-инструмента GRC (ol.washington.edu/grc/">http://indra.mullins.microbiol.washington.edu/grc/) для вычисления относительного вирусной пригодность (D). ПРИМЕЧАНИЕ: инструмент GRC принимает кДНК копировать номера или хроматограмма пиковых высот, по крайней мере, двух временных точках, как на входе, и выдает разницу чистый прирост (г) между двумя вирусами. В то время как инструмент может рассчитать чистую скорость роста от двух данных точек время, настоятельно рекомендуется, чтобы входных данных из трех или более точек времени. Используйте только данные, полученные от временных точках в пределах фазы экспоненциального роста (см шаг 5,4), чтобы получить точные темпы роста. Для более подробного описания математической модели, используемой в веб-инструмента GRC, см 20. Определить вирусных отношения с помощью хроматограмме пика высоты ПЦР-амплификации ВИЧ-1 VIF фрагменты, содержащие последовательность тег VifAB используя VifFwd (5'-GAAAGAGACTGGCATTTGGGTCAGGG-3 '; НХВ2 позиции 5266-5291) и VifRev праймеры (5'-GTCTTCT GGGGCTTGTTCCATCTGTCC-3 '; НХВ2 позиции 5579-5553). Для каждой реакции ПЦР, используют 1 мкл кДНК, 1х NH 4 буфер, 1,5 мМ MgCl 2, 0,2 мМ дНТФ, 2,5 ед Taq-полимеразы, и 0,45 мкМ каждого праймера. Добавьте воду до конечного объема 50 мкл. Установка параметров велосипедные ПЦР 3 циклов при 94 ° С в течение 1 мин, 55 ° С в течение 1 мин и 70 ° С в течение 1 мин, а затем 34 циклов при 94 ° С в течение 15 сек, 58 ° C в течение 30 сек, и 70 ° С в течение 1 мин, а затем провести при 4 ° С. Очищают продуктов ПЦР, используя набор для очистки ПЦР QIAquick в соответствии с протоколом производителя. Отправить очищенные продукты ПЦР к поставщику услуг для секвенирования ДНК последовательности Sanger. Проверьте средний балл качества чтения, которые должны быть предоставлены службой секвенирования. Если средняя точность база вызов менее 85%, повторить шаг 6.10.1 6.10.3 для С помощью веб-инструмента ChromatQuan (f="http://indra.mullins.microbiol.washington.edu/cgi-bin/chromatquant.cgi">http://indra.mullins.microbiol.washington.edu/cgi-bin/chromatquant.cgi ) для вычисления вирусной соотношение в каждый момент времени. Инструмент требует файл последовательность трассировки (*) .ab1 и последовательность 5 'к нуклеотидной сайта интереса. Инструмент измеряет интенсивность пика на указанном сайте. Отношение пиковой интенсивности соответствует рациону двух вирусов (фиг.4В). С помощью веб-инструмента (GRC http://indra.mullins.microbiol.washington.edu/grc/ ) и записанные интенсивности пиков в качестве входных данных для вычисления относительного вирусной пригодность (D). См шаг 6.10.6. 20