Crecimiento por parejas Ensayo de competición para determinar la aptitud de replicación de virus de inmunodeficiencia Humanos

NOTA: El protocolo, como se describe a continuación, no incluye ninguna información de identificación del paciente y por lo tanto no se considera Sujetos Humanos de Investigación por la Junta de Revisión Institucional de la Universidad de Washington o la División de Sujetos Humanos. 1. Construcción de quimérico VIH-1 NL4-3 clones moleculares 1.1) Amplify inserto de ADN Fragmento Diseñar cebadores quiméricos. Mitades 5 'de ambos adelante y atrás primers contienen una secuencia de VIH-1 vector, en la que se inserta el fragmento. El "medio de los cebadores 3 debe contener el final de la secuencia de inserción (Figura 2). Asegúrese de que la secuencia del cebador quimérico conserva los marcos originales de lectura abierta. Utilice cebadores al menos 20 bases de longitud, con una temperatura de fusión mayor que o igual a 60 ° C, ~ 50% de contenido de GC, y una baja tendencia a formar dímeros de cebadores, heterodímeros y / o estructuras de horquilla. Evaluar estas propiedadesutilizando la herramienta web OligoANALYZER ( https://www.idtdna.com/analyzer/Applications/OligoAnalyzer/ ). Uso PCR 27 y los cebadores quiméricos para amplificar el ADN de inserción (Figura 2). Para cada reacción de PCR, utilice 1X tampón de alta fidelidad, dNTPs 0,2 mM, 1 U de ADN polimerasa de alta fidelidad, 0,5 M de cebador quimérico hacia delante, 0,5 M de cebador quimérico inversa y 1 PG0 ng de muestra de ADN región que lleva inserto. Añadir dH 2 O hasta un volumen final de 50 l. Conjunto pasos de ciclos térmicos como sigue: realizar un paso de desnaturalización inicial del ADN a 98 ° C durante 10 seg. Amplificar con 30 ciclos de desnaturalización del ADN a 98 ° C durante 10 seg y el ADN recocido a 3 ° C por encima de la temperatura de fusión más bajo de los dos cebadores para 20 seg. Realice una extensión final a 72 ° C durante 10 min. Guarde los productos de PCR a 4 ° C. Tome 5 l de los productos de PCR de lapaso anterior y correr la electroforesis en gel de agarosa 28. Utilice un gel de agarosa al 0,7%, tampón 1x TAE (40 mM Tris-acetato, EDTA 1 mM), 0,5 g / ml de bromuro de etidio (EtBr) concentración final y la escalera 1 kb como el marcador de tamaño de ADN. Set voltaje de la fuente de alimentación a 5 V / cm de distancia entre los electrodos. Detener la electroforesis cuando el colorante de carga migra a través de aproximadamente 2/3 de la longitud del gel. Visualizar el gel usando un sistema de documentación de gel 28. NOTA: EtBr es un carcinógeno y debe desecharse de forma adecuada, según los reglamentos de la institución. Guantes deben ser usados ​​siempre al manipular geles que contienen EtBr. Cambiar a guantes nuevos después EtBr manejo acabado que contiene el material y antes de manipular otros materiales o equipos para evitar la contaminación cruzada. Si se detecta una sola banda de ADN con el tamaño correspondiente al producto de PCR deseado, purificar el resto del producto de PCR utilizando un kit comercial tal como kit de purificación QIAquick PCR acuerdoing con los protocolos del fabricante. Si otras bandas, no específicos también están presentes, utilizar el resto del producto de PCR para funcionar electroforesis en gel preparativa. Utilice los mismos parámetros y condiciones que se especifican en el paso 1.1.4. Asegúrese de que el gel así es lo suficientemente grande para cargar ~ 45 l de productos de PCR. Cortar la banda de interés y extraer el ADN del gel usando el kit de extracción de gel QIAquick de acuerdo con los protocolos del fabricante. 1.2) Introducir la inserción del fragmento en integral infecciosa del VIH-1 subtipo B vectorial (pNL4-3) Use productos de PCR purificados a partir del paso 1.1.5 como cebadores de PCR. Utilice pNL4-3VifA 20 como ADN molde en una reacción de PCR y el uso de pNL4-3VifB 20 como plantilla en la otra reacción (Figura 2). Para cada reacción de PCR, utilice tampón de alta fidelidad 1x, dNTPs 0,2 mM, 2 U de ADN polimerasa de alta fidelidad, 500 ng de ADN cebador y 50 ng de ADN molde en un vol definitivaume de 50 l. Ajuste los parámetros de ciclo térmico a: 98 ° C durante 30 seg, 35 ciclos a 98 ° C durante 10 seg, 48 ° C durante 1 min y 72 ° C durante 10 min, seguido de 72 ° C durante 10 min. Añadir 10 U de Dpn I a 50 l de la reacción PCR y se incuba a 37 ° C durante 1 hora para digerir la plantilla de ADN. Asegúrese de que el ADN plasmídico se aisló de una cepa bacteriana competente metilación, por ejemplo., Escherichia coli TOP10 químicamente competente. Uso Dpn I digerido producto para transformar células bacterianas competentes. Utilice la transformación de choque térmico con TOP10 químicamente competente E. coli, de acuerdo con el protocolo del fabricante. Para seleccionar las células bacterianas que contienen el plásmido recombinante, utilice Luria Broth (LB) placas de cultivo que contienen 100 mg / L de carbenicilina. Escoja ~ 10 colonias bien separadas y crecer cada uno por separado en medio líquido LB que contenía 3 ml 100 mg / L de carbenicilina y se incuba a 30 ° C en unaagitador O / N. Utilice kit QIAprep Spin Miniprep para aislar ADN de plásmido a partir del cultivo líquido bacteriana, de acuerdo con el protocolo del fabricante. Utilice la digestión de restricción doble 29 para determinar si el ADN plásmido contiene el inserto correcto. Asegúrese de que uno de los sitios de restricción sólo existe dentro de la región de inserción y el otro sitio de restricción existe sólo una vez en el vector de VIH-1, fuera de la región de inserción. Recopilación de al menos 300 ng de ADN plásmido en un volumen final de reacción de 10 l. Seleccione buffers de restricción, temperatura de incubación y tiempo de incubación de acuerdo con el protocolo del fabricante de las enzimas de restricción seleccionadas. Tome 9 l del ADN y electroforesis en gel de ejecución digerido como se describe en el paso 1.1.4. Seleccionar plásmidos recombinantes que tienen bandas de ADN de los tamaños predichos. Confirmar secuencia de la integridad de los plásmidos recombinantes mediante secuenciación de Sanger. Aunque es poco común, no deseadosmutación (s) puede ser introducida durante las reacciones de PCR. Secuencia de ambas cadenas del ADN plasmídico. Siga las instrucciones en el paso 1.1.1.1 para diseñar cebadores de secuenciación. Además, asegurar que el avance y retroceso cebadores de secuenciación recocido al menos 50 pb aguas arriba y aguas abajo de la región de inserción en el plásmido recombinante, respectivamente. Presentar ADN plásmido y cebadores de secuenciación a un proveedor de servicios de secuenciación de ADN comercial. Preparar la muestra de ADN y los cebadores según lo especificado por el proveedor de servicios. Hacer un stock de libre de endotoxina del ADN plásmido mutado utilizando un kit de ADN de plásmido libre de endotoxinas de acuerdo con el protocolo del fabricante. Preparar al menos 1 g de ADN de plásmido libre de endotoxinas para la transfección en el siguiente paso. 1.3) Introducir pequeña escala mutaciones Via mutagénesis dirigida Diseñar cebadores mutagénicos con la superposición de cebadores directo e contienen el mutat deseada revertirion (s). Coloque la base (s) a ser sustituido, insertado o eliminado en medio de los cebadores, flanqueado por 10 a 15 bases homólogas. Siga las instrucciones en el paso 1.1.1.1. Utilice PCR para sintetizar plásmidos mutantes. Para cada reacción de PCR, utilice tampón de alta fidelidad 1x, mM dNTPs 10, 2 U de ADN polimerasa de alta fidelidad, 0,5 M de cebador mutagénico hacia delante, 0,5 M de cebador mutagénico inverso y 50 ng de pNL4-3VifB quimérico, de la etapa 1.2.6 , en un volumen final de 50 l. Ajuste los parámetros de ciclo térmico a: 98 ° C durante 30 seg, 25 ciclos a 98 ° C durante 10 seg, 48 ° C durante 1 min y 72 ° C durante 10 min, seguido de 72 ° C durante 10 min. Repita el paso 1.2.2 a 1.2.6. 2. Generación de Viral Stock Uso de transfección Calcular la cantidad de papel deseado viral y el plásmido ADN requerido. Con un título viral de 10 4 UI / ml o superior, 1,8 ml de stock viral es suficiente para dos conjuntos de ASSA competencia crecimientoys, incluyendo monoinfections, cada uno hecho por triplicado. Para una transfección hecho en una placa de 6 pocillos, sobre 1,8 ml de sobrenadante se cosecha por pocillo. Se necesita un g de ADN plásmido para cada transfección hecho en una placa de 6 pocillos. Para cada pocillo de una placa de 6 pocillos, preparar 100 l de mezcla de transfección, por ejemplo., Que consta de 1 l X-tremeGENE 9 reactivo de transfección (o comparable), 1 g de ADN plásmido y DMEM libre de suero. Determinar el volumen de plásmido de ADN necesario, usando 1 g de ADN plásmido por pocillo. Asegúrese de que la concentración final del ADN plásmido es al menos 50 ng / l. Determinar cuánto se necesita medio libre de suero (DMEM) por pocillo usando la fórmula: Volumen total de DMEM en l = 100 l – volumen ADN en l. Añadir 293T-17 (ATCC) las células HEK 10 6 / pocillo en 2 ml de medio de propagación (DMEM + suero bovino fetal al 10% (FBS)) en una placa de 6 pocillos. Incubar durante 1 hora a 37 ° C en un5% atmósfera de CO 2. Semillas tantos pozos como sea necesario (determinados en el paso 2.1). Para preparar la mezcla de transfección, alícuota del volumen apropiado de DMEM sin suero, según lo calculado anteriormente, en un tubo de microcentrífuga de 1,8 ml de polipropileno, y luego añadir el reactivo de transfección. Reactivo Pipetear directamente en la solución de los medios de comunicación, no se agregue a la superficie de plástico del tubo de microcentrífuga. Añadir ADN plásmido pasado. Pipetear hacia arriba y hacia abajo suavemente para mezclar la solución. Incubar durante 15 min a RT (15 ° C a 25 ° C) para permitir la formación de complejos de transfección. Añadir la mezcla de una manera gota a gota a las células sembradas en la placa de 6 pocillos. Sacudir o agitar los pozos para asegurar una distribución uniforme de los complejos de transfección con cuidado. Placas sello con una envoltura de plástico. Incubar los cultivos a 37 ° C en una atmósfera con 5% de CO 2 durante 48 horas. Utilice una pipeta para recoger y transferir el sobrenadante a un tubo de 15 ml throu cuidadogh una tapa de 0,22 micras filtro. Utilice pipeta para transferir 250 l o más de los sobrenadante filtrado a 1,8 ml tubos de microcentrífuga con juntas de goma en las tapas. Tienda filtró sobrenadantes a -80 ° C hasta su uso. 3. Determinar infecciosa Titer de las poblaciones virales en células mononucleares de sangre periférica (CMSP) Estimular PBMCs con fitohemaglutinina (PHA). Por una acción viral, semilla de 2 x 10 6 PBMCs en medio de Dulbecco modificado completa de Iscove (cIMDM; IMDM suplementado con 20 U / ml de interleucina humana 2 (hIL-2), 10% de suero bovino fetal y 1% de penicilina / estreptomicina) suplementado con PHA (1,5 g / ml). PBMCs de SEED en 2 x 10 6 células / ml. Incubar PBMCs a 37 ° C en una atmósfera de CO2 al 5% durante 72 horas. Cosecha de PBMCs estimuladas con PHA. Transferencia no adherente PHA-PBMCs a un tubo cónico de 50 ml. Girar tubo a 228 xg durante 10 min. Retire con cuidado el sobrenadante sin disrupting del sedimento celular. Vuelva a suspender el sedimento celular a una concentración final de 2 x 10 5 PBMC / ml en cIMDM. Seed 2 x 10 4 PBMCs estimuladas con PHA / pocillo en 100 l / pocillo cIMDM en una placa de 96 pocillos de fondo redondo. Hacer una dilución 1:10 de la población viral. Luego, desde la primera acción diluida, que doce diluciones seriadas de 3 veces en una placa maestra de 96 pocillos. Se recomienda este esquema de dilución para la detección de los títulos virales en el intervalo de 04 10-6 10 unidad infecciosa (UI) por ml. Por ejemplo, añadir 20 l de stock de virus a 180 l medios de comunicación en el tubo de 1,5 ml. Mezclar la dilución pipeteando cuidadosamente. A continuación, traslado de 90 l de la acción diluida en 180 l de medios del primer pozo y mezclar bien con la pipeta. Continuar serie de diluciones mediante la transferencia de 90 l del pozo actual a 180 l de medios en el siguiente pozo once veces más. Aumentar o disminuir la dilución inicial si los títulos superiores a 10 6 UI / mlo se espera inferior a 10 4 UI / ml, respectivamente. Añadir 40 l de la cepa vírica diluido en serie de la placa de dilución principal a la placa PBMCs cabeza de serie (del paso 3.3) por cuadruplicado. Incubar las placas a 37 ° C en una atmósfera de 5% de CO2 durante 16 a 24 horas. Retire con cuidado 100 l de sobrenadante de cada pocillo, y reemplazar con 160 l de cIMDM fresco a un volumen total de 200 l / pocillo. Incubar las placas a 37 ° C con 5% de CO 2 atmósfera (día 1). En los días 4, 7, 10 y 13 de transferencia de 100 l de sobrenadante de cada pocillo a 100 l buffer de interrupción (2% Triton X-100 en PBS), y reemplazar con 100 l de cIMDM fresco. Almacene los sobrenadantes a -20 ° C. Mantenga el muestreo y añadiendo cIMDM fresca cada tres días hasta que el título se estabiliza. Determinar la dosis infecciosa de cultivo de tejidos 50% (TCID 50) de la población viral p24 por ELISA usando el día 7 y 13 muestras como se describe en el paso 4. Si el DICT50 obtenido de día 13 es claramente superior a la titulación del día 7, el stock de virus puede necesitar más tiempo para ampliar. Repetir el p24 ELISA utilizando muestras posteriores hasta que los títulos infecciosos a partir de dos puntos de tiempo de muestreo se vuelven estable (o disminución). Selecciona las poblaciones de las muestras con los títulos más altos. 4. ELISA (Enzyme-linked inmunoabsorbente Assay) Detección de VIH-1 p24 para determinar viral infecciosa Titer NOTA: El siguiente protocolo fue desarrollado utilizando placas de captura de antígeno p24 preparadas en nuestro laboratorio 30. Comercial VIH-1 p24 placa de ELISA / kits también se puede utilizar, siguiendo el protocolo del fabricante. Antes de trabajar con muestras, preparar stocks de trabajo de anticuerpo primario (de conejo anti-HIV-1 p24 SF2 antisuero). Antisuero p24 Descongelar a temperatura ambiente. Mezclar 2,5 ml de glicerol con 2 ml de 10% de FBS en Phosphatsolución salina tampón E (PBS). Añadir 0,5 ml de antisuero y mezcle. Tienda 1 ml de alícuotas a -20 ° C. Descongele las muestras del paso 3.7 en una incubadora a 37 °. Lave la placa de captura de p24 5 veces con tampón de lavado (1x PBS con 0,05% de Tween-20). Añadir 50 l / pocillo de diluyente de muestra (1% de albúmina de suero bovino (BSA), 0,2% de Tween-20 en medio RPMI-1640), a continuación, añadir 50 l de muestra a los pocillos apropiados. Incluya al menos tres pozos con diluyente de muestra sólo como controles simulados / negativos. Incubar durante 2 horas a 37 ° C o O / N a 4 ° C. Prepare la solución de anticuerpo primario fresca antes de su uso. Hacer una dilución 1: 2.000 veces del anticuerpo primario stocks de trabajo utilizando el diluyente de anticuerpo primario (12% de SFB en medio RPMI-1640). Asegurar para preparar suficiente para el uso de solución de 100 l por cada muestra / control de pocillo en una placa de 96 pocillos. Por ejemplo, para producir suficiente solución para una placa de 96 pocillos, añadir 5 l de la worki anticuerpo primariong de stocks al diluyente de anticuerpo primario para un volumen final de 10 ml. Lave la placa de captura de 5 veces con tampón de lavado. Añadir 100 l de la solución de anticuerpo primario a cada pocillo. Incubar durante 1 hora a 37 ° C en una atmósfera de 5% de CO 2. Prepare la solución de anticuerpo secundario fresca antes de su uso. Hacer una dilución 1: 14.400 veces del anticuerpo secundario (1 mg / ml de cabra anti-conejo HRP) utilizando el diluyente de anticuerpo secundario (7% de FBS, 0,01% de Tween-20 en medio RPMI-1640). Para reducir los errores de pipeteo, realizar una dilución en serie de dos pasos. Asegurar para preparar suficiente para el uso de solución de 100 l por cada muestra / control de pocillo en una placa de 96 pocillos. Por ejemplo, para producir suficiente solución para una placa de 96 pocillos, agregar primero 1 l de anticuerpo secundario a 99 l de diluyente de anticuerpo secundario. A continuación, añadir 70 l de primera dilución al diluyente de anticuerpo secundario para un volumen final de 10 ml. Placa de captura Wash 5 times con tampón de lavado. Añadir 100 l de la solución de anticuerpo secundario a cada pocillo. Incubar durante 1 hora a 37 ° C en una atmósfera de 5% de CO 2. Lave la placa 5 veces con tampón de lavado. Añadir 100 l de sustrato TMB RT. Incubar 30 minutos a temperatura ambiente en un recipiente cerrado para protegerlo de la luz. Añadir 100 l de solución de parada RT (1 NH 2 SO 4). Leer la absorbancia a 450-650 nm en cada pocillo utilizando un lector de microplacas. Utilice el valor de absorbancia para anotar cada uno así como infectado o no infectado. Considere un pozo para contener virus infeccioso si el valor de la absorbancia es al menos tres veces más alto que el valor leído de los pocillos de control simulacros / negativo. Calcula TCID 50 de la cepa vírica utilizando el método de Reed-Meunch 31. 5. Establecer la cinética de crecimiento viral 5.1) monoinfección Semilla 3 x 10 5 PHA-estimulado PBMC / pocillo en placas de 48 pocilloss en un volumen total de 500 l / pocillo. Mantenga las placas de cultivo a 37 ° C en una atmósfera de CO2 al 5% hasta que la inoculación. Para cada virus, preparar un inóculo que contiene 6.000 UI en 2 ml de cIMDM. Inocular pozos en triplicado mediante la adición de 500 l de inóculo (1500 IU) a las células sembradas. El volumen final del cultivo celular infectado es 1 ml / pocillo y se la MOI es 0.005. Alícuota 200 l de inóculo restante para cada uno de dos placas de 96 pocillos para el aislamiento de ARN, una de las cuales se guarda como una copia de seguridad. Incubar los cultivos a 37 ° C en una atmósfera con 5% de CO2 durante 16 a 24 horas. Culturas Lave 16-24 h después de la inoculación. Retire y deseche 750 l de sobrenadante de cultivo. Añadir 750 l de cIMDM fresco. Envuelva las placas en papel plástico y centrifugado durante 10 minutos a 300 x g. Retire y deseche 750 l sobrenadante. Añadir 750 l de cIMDM fresco. Se incuba a 37 ° C con un 5% de CO2 amósfera (día 1). Culturas muestras diarias del día 2 al día 7. Transferir 500 l de sobrenadante de cultivo a un tubo de 1,8 ml de centrífuga. Centrifugado durante 1 min a 3000 x g. Transferencia de 200 l del sobrenadante libre de células a las dos placas de muestra de 96 pocillos para el aislamiento de ARN, de nuevo ahorro de una placa como copia de seguridad. Sobrenadantes Almacenar a -80 ° C hasta que el aislamiento de ARN. Añadir cIMDM 500 l fresco a cada cultura. Incubar a 37 ° C en una atmósfera de 5% de CO 2. Desechar culturas en Wescodyne al final del experimento. Aislar ARN a partir de 200 l de sobrenadante (utilizar kits comerciales, como QIAamp Viral RNA Mini Kit) siguiendo el protocolo estándar del fabricante. Para un gran número de muestras, utilice el Qiagen QIAxtractor. RNA de muestras Conservar a -80 ° C hasta que la síntesis de ADNc. 5.2) Síntesis de ADNc (transcripción reversa) Para cada RNA samplio, añadir 1,2 nmol de dNTP y 1,2 pmol de cebador de síntesis de ADNc, (5'-GTTGATCCTTTAGGTATCTTTCCACAGC-3 ', nucleótidos HXB2 desde 7.968 hasta 7.995) a 10 l de RNA viral. Añadir agua hasta un volumen final de 14 l. Flick el tubo para mezclar y centrifugar brevemente para recoger líquido en la parte inferior del tubo. Incubar la mezcla durante 5 minutos a 65 ° C, a continuación, mantenga a 4 ° C hasta que se prepara la mezcla maestra. Preparar mezcla maestra usando 5x primer capítulo de amortiguación (250 mM Tris-HCl, pH 8,3, 375 mM KCl, 15 mM MgCl 2), DTT 5 mM, 120 U de SuperScriptIII y 240 U de RNasa inhibidor. Añadir agua hasta volumen final de 10 l. Añadir 10 l de mezcla maestra a la mezcla de ARN, película de mezclar y girar a recoger. Incubar la mezcla durante 90 min a 50 ° C para permitir la síntesis de cDNA. Incubar durante 15 min a 70 ° C para inactivar la transcriptasa inversa. Mantenga a 4 ° C, según sea necesario. Añadir 2 U de RNasa H, película para mezclar, y luego girar a recoger. Incubar 20 mina 37 ° C. ADNc tienda a -20 ° C. 5.3) La cuantificación de cDNA mediante el Sistema de qPCR Preparar una serie de diluciones estándar. Haz 10 veces dilución en serie, de 3 x 10 6 copias / l hasta 30 copias / l, de pNL4-3VifA. Use agua destilada para diluciones. Preparar la serie de dilución estándar fresca antes de usar o preparar pequeños lotes y mantener a -20 ° C. No congelar-descongelar los estándares más de tres veces. Configurar una placa de reacción de 96 pocillos qPCR. Asegúrese de que cada placa contiene al menos un pocillo de controles negativos, un triplicado de la serie de dilución estándar, y al menos un duplicado de cada muestra de ADNc. Para cada reacción de qPCR, utilizar 12,5 l de mezcla maestra qPCR, 0,2 M de sonda, 0,8 mu M cada uno de los cebadores directo e inverso y 1 l de cDNA o la serie de dilución estándar o agua / tampón (para el pocillo de control negativo). Añadir agua hasta un volumen final de 25 l. La sonda qPCR es luz sensitive. Guárdelo en un recipiente cerrado. Para detectar ADNc derivado de clon molecular basado pNL4-3VifA, utilice el Vifa cebador-sonda: VifAB cebador directo (GGTCTGCATACAGGAGAAAGAGACT), Vifa cebador inverso (5'-AGGGTCTACTTGTGTGCTATATCTCTTTT-3 ') y la sonda VifAB (6FAM-5'-3-CTCCATTCTATGGAGACTC '-MGBNFQ). Para ADNc derivado de clon basado pNL4-3VifB, utilice el VifB cebador-sonda: cebador directo VifAB, sonda VifAB y VifB cebador inverso (5'-CACCTGCGTGCTATACCTTTTCT-3 '). Ajustar los parámetros de los ciclos de PCR a 50 ° C durante 2 min, 95 ° C durante 10 min, y 40 ciclos de 95 ° C durante 15 segundos y 60 ° C durante 1 min. Consulte el documento de soporte del fabricante para el funcionamiento de la máquina qPCR. Calcular una curva estándar utilizando los datos de la serie de dilución estándar triplicado. Comparar los datos de amplificación de la muestra de ADNc para la curva estándar para determinar el número de copias. Consulte el documento de soporte del fabricante de daprocesamiento ta. 5.4) Determinar Viral fase de crecimiento exponencial Trazar la cinética de crecimiento viral con el día de muestreo a lo largo del eje X y el número de copias de ADNc a lo largo del eje Y e identificar la fase de crecimiento exponencial viral, es decir., Cuando ADNc virales número de copias de aumento en una progresión exponencial. Utilice la herramienta web GRC ( http://indra.mullins.microbiol.washington.edu/grc/ ) para calcular la tasa de crecimiento viral (g). En esta aplicación, la herramienta GRC acepta cDNA número de copias de al menos dos puntos de tiempo como entrada, y da salida a la tasa de crecimiento viral (g). Utilice sólo los datos de puntos de tiempo dentro de la fase de crecimiento exponencial (véase el paso 5.4.1 anterior) para obtener tasas de crecimiento precisos. Para una descripción detallada del modelo matemático utilizado en la herramienta web GRC, ver 20. Ensayo de Competencia 6. Crecimiento Semilla 3 x 10 5 </ Sup> PBMCs estimuladas con PHA (o 1 x 10 5 células CEMx174) en 500 l volumen total por pocillo en una placa de pocillos de fondo plano 48. Mantenga plato en 37 ° C en una atmósfera con 5% de CO 2 hasta que la inoculación. Para cada virus, preparar 3 ml de inóculo que contiene 6.000 UI. Transferir 1,5 ml de cada inóculo viral a un tubo estéril para crear el dual inóculo infección. Añadir 500 l de la doble inóculo (1500 IU) a 3 x 10 5 células en una placa de 48 pocillos. El volumen de cultivo final es 1 ml / pocillo. Alícuota de 200 l de inóculo a dos placas de 96 pocillos para el aislamiento de ARN; salvar una placa como respaldo. Se incuban las células inoculadas a 37 ° C con una atmósfera de CO2 al 5% durante 16 a 24 horas. Culturas Lave 16-24 h después de la inoculación. Retire y deseche 750 l de sobrenadante de cultivo. Añadir 750 l de cIMDM fresco. Envuelva las placas en papel plástico y centrifugado durante 10 minutos a 300 x g. Retire y deseche 75081; l sobrenadante. Añadir 750 l de cIMDM fresco. Se incuba a 37 ° C con una atmósfera de CO2 al 5% (día 1). Seleccione tiempos de muestreo para incluir al menos 3 puntos de tiempo dentro de la fase de crecimiento exponencial observada en el paso 5.4.1. Para cada toma de muestras, siga el paso 5.1.7. Realizar la síntesis de ADNc como se describe en el apartado 5.2. Determine la relación variante viral usando qPCR. Preparar una serie de diluciones en serie estándar por triplicado, diluyendo 10 veces en cada paso de 3 x 10 6 copias / l a 30 copias / l de pNL4-3VifA. Configurar una placa de reacción de 96 pocillos qPCR. Asegúrese de que cada placa contiene al menos un control negativo, la serie de dilución estándar por triplicado, y los duplicados de cada muestra de ADNc. Para cada reacción qPCR, utilizar 12,5 l de qPCR Master Mix, 0,2 M de la sonda, 0,8 mu M cada uno de los cebadores directo e inverso y 1 l de cDNA o la d estándar serie ilution o agua / tampón (para los pozos de control negativo). Añadir agua hasta un volumen final de 25 l. La sonda qPCR es sensible a la luz, guárdelo en recipiente cerrado. Utilice la sonda-primer Vifa para detectar señales de los de la serie de dilución estándar de controles negativos y con uno y dos ejemplares de la muestra de ADNc. Utilice el cebador-sonda VifB con el otro duplicado de la muestra de ADNc. Ajustar los parámetros de los ciclos de PCR a 50 ° C durante 2 min, luego 95 ° C durante 10 min, y luego 40 ciclos de 95 ° C durante 15 seg y 60 ° C durante 1 min. Consulte el documento de soporte del fabricante para el funcionamiento de la máquina qPCR. Calcular la curva estándar utilizando los datos de amplificación de la serie de dilución estándar. Comparar los datos de amplificación de las muestras de cDNA a la curva estándar para determinar el número de copias. Consulte el documento de soporte del fabricante para el procesamiento de datos. Utilice la herramienta web GRC (ol.washington.edu/grc/">http://indra.mullins.microbiol.washington.edu/grc/) para calcular la aptitud viral relativa (d). NOTA: La herramienta GRC acepta cDNA número de copias o alturas de los picos del cromatograma de al menos dos puntos de tiempo como la entrada, y da salida a la diferencia de tasa de crecimiento neto (d) entre los dos virus. Mientras que la herramienta puede calcular la tasa de crecimiento neto a partir de dos datos de puntos de tiempo, se recomienda encarecidamente a los datos de entrada a partir de tres o más puntos de tiempo. Usar sólo los datos obtenidos a partir de los puntos de tiempo dentro de la fase de crecimiento exponencial (véase el paso 5.4) para obtener tasas de crecimiento precisos. Para una descripción detallada del modelo matemático utilizado en la herramienta web GRC, ver 20. Determinar proporciones virales usando cromatograma pico-heights PCR amplificar VIH-1 vif fragmentos que contienen la etiqueta de secuencia usando VifAB VifFwd (5'-GAAAGAGACTGGCATTTGGGTCAGGG-3 '; HXB2 posiciona 5266 hasta 5291) y cebadores VifRev (5'-GTCTTCT GGGGCTTGTTCCATCTGTCC-3 '; HXB2 posiciones 5.579-5.553). Para cada reacción de PCR, utilizar 1 l de ADNc, 1x tampón de NH 4, 1,5 mM de MgCl 2, 0,2 mM dNTP, 2,5 U de Taq polimerasa, y 0,45 M de cada cebador. Añadir agua hasta un volumen final de 50 l. Ajustar los parámetros de los ciclos de PCR a 3 ciclos a 94 ° C durante 1 min, 55 ° C durante 1 min, y 70 ° C durante 1 min, seguido de 34 ciclos a 94 ° C durante 15 seg, 58 ° C durante 30 seg, y 70 ° C durante 1 minuto, y luego mantenga a 4 ° C. Purificar los productos de PCR utilizando el kit de purificación QIAquick PCR de acuerdo con el protocolo del fabricante. Presentar productos de PCR purificados a un proveedor de servicios de secuenciación de ADN para la secuenciación de Sanger. Compruebe la puntuación media de la calidad de lectura, que debe ser proporcionada por el servicio de secuenciación. Si la precisión media de las llamadas de base es inferior al 85%, vuelva a realizar el paso 6.10.1 a 6.10.3 Utilice la herramienta web ChromatQuan (f="http://indra.mullins.microbiol.washington.edu/cgi-bin/chromatquant.cgi">http://indra.mullins.microbiol.washington.edu/cgi-bin/chromatquant.cgi ) para calcular la razón viral en cada punto de tiempo. La herramienta requiere el archivo de secuencia de trace (* .ab1) y la secuencia 5 'del sitio de nucleótidos de interés. La herramienta mide la intensidad máxima en el lugar especificado. La relación de la intensidad pico corresponde a la ración de los dos virus (Figura 4B). Utilice la herramienta GRC web ( http://indra.mullins.microbiol.washington.edu/grc/ ) y las intensidades de los picos registrados como entrada para calcular la aptitud relativa viral (d). Vea el paso 6.10.6. 20